分子生物学实验指导书
本实验指导书包括三个紧密相关、前后衔接的实验，可供16-20学时的实验课教学使用。实验内容均为分子生物学最常用的实验技术，希望同学们能熟练掌握。实验体系已经多次尝试和优化，虽趋成熟但非尽善尽美，更非逢做必成。随实验条件的变化，每次实验前的预实验是有必要的。指导书如有不妥之处敬请指出，以便再次修订。
西北农林科技大学农学院柴守诚
实验一植物总DNA的提取
1.实验目的
通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法，并为后续的实验准备DNA样品。
2.实验原理
2.1 DNA提取的原理
植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。植物细胞具有坚硬的细胞壁，液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。常用的去污剂有SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，CTAB(cetyltrimlthylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)等。细胞壁、细胞膜及核膜破坏后，释放出细胞内含物至提取缓冲液，内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。将其他组分除去或降解，然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部，取上清液、弃残渣，上清中加入苯酚和氯仿（三氯甲烷）处理后经离心蛋白质沉淀于有机相（下相）和水相（上相）的界面处。水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonuclease A ，RNaseA)则使RNA降解，而DNA仍完整。加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出，絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获，并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。
2.2 DNA提取的质量要求
对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性（即没有或很少降解）和样品的高纯度（即蛋白质和RNA等的污染程度低）。但对DNA 样品的质量要求程度的高低依DNA样品用途而定。
2.2.1 导致DNA降解的因素及对策
①物理因素：机械剪切力和高温。
对策：DNA样品制备时要求动作轻缓；避免溶液的过多转移，特别是用小口径吸管的过多转移；避免高温。
②细胞内源DNA酶：细胞内含活性很高的DNA酶,细胞破碎后便可与DNA接触并使其降解。
对策：为避免或纯化DNA酶活性，在DNA提取液中常选择加入EDTA、SDS、CTAB及蛋白酶等。EDTA能整合Ca2+、Mg2+，而Ca2+、Mg2+是DNA酶的辅因子。SDS和CTAB能使蛋白质变性（DNA酶也是蛋白质），蛋白酶可降解蛋白质。
③化学因素：在过酸的溶液条件下，DNA分子可脱嘌呤，DNA分子极易在碱基脱落处断裂降解。
对策：避免DNA按触过酸溶液。
2.2.2.造成DNA污染的主要因素及对策
①蛋白质:体内DNA常与蛋白质结合,蛋白质的污染会影响到后续的DNA操作。对策：苯酚、氯仿抽提可使蛋白质变性而DNA不受影响。
②RNA：污染后果依DNA的用途而异。对有些DNA实验，RNA的污染可能无关大局，而对有些实验则至关重要。
对策：RNA本身极易降解，如有必要去除则可用无DNA酶活性的RNase A （DNase-free RNaseA）处理。
3．实验材料
因本门课程实验内容设置的特殊需要，本实验所采用的实验材料包括某些遗传特性已知的小麦品种和一些未知的待测系（株），力求使课程实验不仅具有演示性，更重要的是具有探索性，以培养学生的研究兴趣和能力。
表1. 部分实验材料例举
材料是否含高分子量谷蛋白5+10亚基
绵阳19 郑麦366 郑农16 小偃22 西农2000 西农979 是是是否否否
4.实验程序
植物DNA提取的方法有许多,这里介绍本实验室常用的CTAB法。
4.1程序1——经典程序
①在三角瓶中加入4ml 2×CTAB提取缓冲液,80ulβ-巯基乙醇,恒温水浴中预热至65℃。
②液氮（-196℃）预冷研钵，取鲜叶1克剪碎后置研钵中，加液氮研磨至最细，粉末转入上述三角瓶中，置恒温振荡水浴中（65℃）轻摇温育10~60min（较长时间的处理可增加DNA得率）。
③取出三角瓶冷至室温，加入4ml苯酚一氯仿一异戊醇（25：24：1）混合液，轻摇混匀使之乳化。
④倒入10ml离心管，室温下10000rpm离心5~10min，上清移至另一试管。
⑤加入4ml异丙醇（-20℃预冷），试管加盖后缓慢翻转混匀，DNA以絮状沉淀析出，-20℃静置，时间长短酌情而定，长时间静置可增加DNA得率。
⑥用清毒弯头玻璃棒或消毒牙签钓出DNA沉淀，1ml 70%乙醇中洗涤片刻。
⑦稍加风干，将DNA沉淀溶于0.5ml 1×TE中,加入1mg/ml的无DNA酶活性的RNase A(DNase-free RNase A)20μl,置37℃30min(增大RNase A的用量,加长处理时间都可改善RNA去除的效果)。
⑧加0.5ml氯仿—异戊醇(24:1)混合液,试管加盖后缓慢翻转混匀,10000rpm 离心5min,移上清至另一试管(注意不要破坏上下相界面)。
⑨上清中加1/10体积(约5μl)的3M NaCl和等体积(约0.5ml)的预冷（-20℃）异丙醇，加盖后缓慢翻转混匀，使DNA以絮状沉淀析出，-20℃长时静置可增加DNA得率。
⑩钓出DNA沉淀，70%的乙醇（每次同量1ml）清洗2次，超净台风干，溶于适量1×TE中备用（视DNA量而定，建议用50~100μl）。
4.2程序2——简化程序
①在三角瓶中加入4ml 2×CTAB提取缓冲液,80ulβ-巯基乙醇,恒温水浴中预热至65℃。
②液氯（-196℃）预冷研钵，取鲜叶1克剪碎后置研钵中，加液氯研磨至最细，粉末转入上述三角瓶中，置恒温振荡水浴中（65℃）轻摇温育10~60min（较长时间的处理可增加DNA得率）。
③取出三角瓶冷至室温，加入4ml苯酚一氯仿一异戊醇（25：24：1）混合液，轻摇混匀使之乳化。
④倒入10ml离心管，室温下10000rpm离心5~10min，上清移至另一试管。
⑤加1mg/ml RNase A 100μl,置37℃30min。
⑥加4 ml氯仿—异戊醇（24：1）混合液，试管加盖后缓慢翻转混匀，10000rpm 离心5-10mim。
⑦移上清至盛4 ml预冷异丙醇的另一试管中，加盖后缓慢翻转混匀，使DNA 沉淀析出，-20℃静置，时间长短酌情而定，长时间静置可增加DNA得率。
⑧钓出DNA沉淀，70%的乙醇（每次用量1ml）清洗2次，超净台风干，溶于适量1×TE中备用（视DNA量而定，建议用50~100μl）。
4.3程序3——最简程序
程序2中省掉步骤⑤即得.
上述三个程序的区别主要体现在对RNA的去除上。程序1费时较多（半天难完成），但提取的DNA能适合大多数DNA操作试验。程序3最简单，但提取的DNA中有RNA污染，程序2介于两者之间。学生实验建议采用程序2，可在4小时内完成。
5．实验准备
每次开始实验前，请按下列清单准备，并按实验分组分别摆放到位，醒目标
示。
（1）实验材料：提前收集纯种，种子发苗，保证实验时苗高10cm左右。
（2）2×CTAB：实验开始前预热至65℃。
（3）β—巯基乙醇
（4）液氮
（5）苯酚—氯仿—异戊醇（25：24：1）：按每实验材料5ml提前配制备用。
（6）氯仿—异戊醇（24：1）
（7）异丙醇：实验开始前-20℃预冷。
（8）70%乙醇
（9）3MNaCl：小份提供，高压灭菌（程序2无需）。
（10）1×TE：小份提供，高压灭菌。
（11）RNaseA：小份提供。
（12）三角瓶：50ml，提前洗净高压灭菌，配锡泊盖，每材料1个。
（13）研钵，研杵：洗净烘干，每材料一套。
（14）角勺：每材料1个。
（15）液氮勺：每小组1个。
（16）剪刀
（17）弯头玻棒或牙签：提前洗净高压灭菌，若用牙签需提前接长后灭菌。
（18）10ml离心管：洗净，高压灭菌。
（19）1.5ml试管:洗净,高压灭菌,一次性新试管亦需高压灭菌。
（20）移液器：5ml、1ml、100μl，每小组一套。
（21）吸头：5ml、1ml、100μl，一次性新吸头亦需高压灭菌。
（22）线手套：每小组2双
（23）一次性手套
（24）油性记号笔
（25）称量纸
（26）天平：提前调平
（27）温箱：提前预热至37℃
（28）恒温振荡水浴；实验开始前预热到65℃
（29）高心机
实验二DNA琼脂糖凝电泳定量及质量检测
1.实验目的
学习和掌握DNA琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electropHoresis)的基本原理和技术;并在此基础上进而熟悉利用该技术进行DNA样品定量,完整性检测及RNA 污染程序度检测的原理和方法。
2.实验原理
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖经加热溶解和降温固化形成的凝胶是一种多孔的复杂分子筛。DNA样品加入样孔，凝胶置于电场后，带负电荷的DNA分子进入凝胶并朝向电场正极方向泳动，称其为电泳。不同的DNA分子具有不同泳动速率或称迁移速率（electropHoretic mobility）。相同泳动率的DNA总是集于泳道的相同位置，形成电泳带（band），经溴化乙锭染色后，在紫外光照射下电泳带可被肉眼观测。DNA 的泳动速度与DNA分子量的大小，DNA分子构型、凝胶中琼脂糖浓度，琼脂糖种类，凝胶中溴化乙锭的有无，电场强度和电泳缓冲液等诸多因素有关，现选其重要者简述如下：
①DNA分子的大小：在其他条件相同的情况下，DAN分子越小，泳动中所遇到的摩擦阻力越小，泳动速率越快，反之则反。线状双链DNA分子在凝胶中的泳动速率与DNA分子中碱基对数目的常用对数成反比，但比例常数则随琼脂糖浓度，缓冲液构成及电泳条件的不同而不同。而且这种线性比例关系当DNA片段长度超过某一最大极限值时则不复存在。
②琼脂糖浓度：在其他条件相同的情况下，琼脂糖浓度越大。DNA泳动速率越小。另外，更为重要的是琼脂糖的浓度影响其筛分不同分子量大小的DNA片段的效果。高浓度的凝胶有利于小分子量DNA的分离，低浓度则有利于大分子量DNA的分离。表1给出不同浓度的标准琼脂糖（即高熔点琼脂糖，与低熔点琼脂糖相对而言，前者的熔点为85~95℃，后者的熔点常低于65℃）分离DNA线段大小的范围，可做参考。
表1 不同浓度标准琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
琼脂糖浓度（%）分辨DNA片段大小的范围
0.5 700bp~25kb
0.8 500bp~15kb
1.0 250bp~12kb
1.2 150bp~6kb
1.5 80bp~4kb
③电压:低压范围内,DNA片段的迁移率与所用电压成正比。电场强度更高时,高
分子量片段的迁移率遂不成比例地增加。所以当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率,则所用电压不应高于5~8V/cm。
④电泳缓冲液：DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子（如用水代替电泳槽及凝胶中的缓冲液）则电导率降至很低，DNA不是全然不动，就是迁移极慢。但离子强度过高，如错用了10×电泳缓冲液，电导率升高，即使应用适中的电压也会产生大量的热能。最严重时凝胶会熔化，DNA会变性。有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳，如TAE、TBE和TPE等（表2）
表2 电泳缓冲液
缓冲液工作液贮存液（1L）
TAE 1×50×
40mM Tris-乙酸盐242g Tris
1mM EDTA 57.1ml 冰乙酸
100ml 0.5M EDTA(pH 8.0)
TPE 1×10×
90mM Tris-磷酸盐108g Tris
1mM EDTA 15.5ml 酸磷(85%,1.679g/ml)
40ml 0.5M EDTA(pH8.0)
TBE 0.5×5×
45mM Tris-硼酸盐54g Tris
1mM EDTA 25.7g 硼酸
20ml 0.5M EDTA(pH8.0) 这些缓冲液各有特点但都工作良好。选用哪一种经常取决于工作习惯。三者之中TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极端将发生酸性化，凝胶中向阳极迁的溴酚蓝的颜色由蓝紫色向黄色转变。定期更换缓冲液或调换正负电极槽的缓部液可以防止TAE的消耗。TBE和TPE比TAE代价稍高，但缓冲容量高得多。双链线状DNA在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%。对高分子量DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，但对低分子量DNA，则TAE要差些。
DNA的凝胶电泳除用琼脂糖凝胶外，还可用聚丙烯酰胺凝胶。后者最适合于分离小片段DNA（5~500bp），其分辨力特强，但其制作和操作更繁琐。另外前者用于水平电泳。后者则用于垂直电泳。
2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳定量,完整性检测及RNA污染程度检测的原理。
DNA样品在含溴化乙锭（ethidium bromide，EB）的琼脂糖凝胶中电泳时，EB能嵌入双链DNA堆积的碱基对之间，在高离子强度的溶液中平均每2.5个碱基对中嵌入一分子EB 且与DNA碱基序列无关。因此EB的嵌入量与DNA的量成正比。嵌入DNA的EB在紫外光照射下产生荧光的能力倍增,比游离状态的EB发出荧光的能力增强20~25倍,因此DNA带与凝胶背景反差很大,即使少量的DNA也能从存在游离态EB的凝胶中被检测出来。而且荧光强度与DNA总量成正比，因此可以通过比照待测样品和一系列标准DNA（如λDNA）样品在紫外灯下电泳带的荧光亮度估待测样品中DNA的总量（μg），再除以电泳制样时吸取的待测样品的体积（μl）计算其浓度（μg /μl）。
对于高等动植物的总DNA样品，如DNA分子完整性较好，则可观察到一条高分子量的电泳主带（位于凝胶上端），如有降解则会出现瀑布状的拖尾（smear）。因此如高分子量主带明显，拖尾程度轻则说明样品中DNA分子完整性好，如高分子量主带不明显，甚至无主带，拖尾严重则说明样品中DNA分子的完整性差。
在DNA样品的制备过程中，如RNA的去除不彻底则会造成DNA样品中混有RNA，而RNA分子量比完整的DNA分子的分子量要小得多，电泳时通常处于凝胶底部（正极端），且常比溴酚蓝更靠近凝胶底部，很容易辨别。因此可根据RNA带的有无和带的强弱判断RNA的污染程度。如有必要可用RNaseA再行处理以除之。
因此，对制备的DNA样品和已知浓度标样一同电泳可使DNA定量，完整性和RNA污染检测一次完成，“一石三鸟”，是实验室常用的一种简便而多效的基本技术。
3．实验材料
①实验一所制备的DNA样品
②已知浓度的λDNA标样。市场购得的λDNA标样稀释至0.2μg/μl或0.1μg/μl,应用时甚为方便。
4．实验程序
包括凝胶制备，DNA样品准备，上样电泳，结果观测和记录。
警告：EB剧毒！电泳区的器皿（具）都可能有EB污染，专用专位，使用时请戴一次性手套，严禁将电泳区器皿（具）放于它处，严禁将它处之物放于电泳区。
4.1凝胶制备
①用胶带封住制胶板两端,架置样孔梳
②称取0.4g琼脂糖倒入三角瓶,加入50ml 1×TAE,加玻璃纸盖后置于微波炉中加热溶解(注意防止沸腾溢出)，配成0.8%的凝胶。
③胶液冷至约50℃左右(手握三角瓶底部感觉烫手但能忍受),加EB至终波度为
0.5μg/ml(EB贮存液为5mg/ml时,每10ml凝胶中加入1μl EB贮液),缓慢摇匀,倒于
制胶板,置桌面使其充分凝固。
4.2电泳样品准备
样品包括已知浓度标准DNA样品(如λDNA)的系列梯度样品和各待测样品,系列梯度的范围根据待测样品预估浓度范围设定,下面介绍本实验室经验体系(表
3).为方便,常将标准λDNA浓度调整至0.2μg/μl使用。
表3 DNA定量制样表
样号样名DNA用量（μl）1×TE（μl）10倍加样缓冲液（μl）总体积（μl）
1 λ0.
2 1 17 2 20
2 λ0.4 2 16 2 20
3 λ0.6 3 15 2 20
4 λ0.8 4 14 2 20
5 λ1.0 5 13 2 20
6 1 1
7 2 20
7 1 17 2 20
8 1 17 2 20
9 1 17 2 20
10 1 17 2 20
注：λ0.2表示λDNA的用量为0.2 μg,其他类同。
按上表制样后，轻弹混匀，稍加离心后待上样电泳。
4.3电泳
①撕掉制胶板两端的胶带,将制胶板连同凝胶置于电泳槽,加1×TAE电泳缓冲液
至液面高上出凝胶表面约1mm,小心垂直向上拔除样孔梳。
②按次序用移液器将各样品全量加入样孔。
③开启电泳仪,恒压(建议电压5~10v/cm凝胶)电泳至足以读取结果时(约0.5~1hr)
停止电泳。
4.4实验结果观测记录
将凝胶置于紫外透射仪上,打开紫外灯,比照待测样品与系列梯度标样的电泳带亮度,确定样品中的DNA总量,再根据加入的DNA溶液体积换算出DAN浓度。
如某一待测样品电泳带的亮度与入0.6(λDNA,0.6μg总量)等同则该样品中DNA
总量为0.6μg,如果电泳制样时该样品的用量为1μl,则浓度为0.6g/ μl,如用量为2
μl,则浓度为0.3μg/ μl,另外观察拖尾程度估测DNA的完整性,根据RNA带的亮芳
估测RNA的污染程度。实验结果列表记录更为方便。
表4 DNA定量及质量检测结果
样名DNA浓度（μg/ μl,）完整性RNA污染
5．实验准备：
根据实验样品量和分组情况，实验前请按下列清单查对准备。
制胶板，样孔梳，胶带，剪刀，三角瓶，玻璃纸，称量纸，天平，琼脂糖，量筒，1×TAE，EB，微波炉，电泳仪，一次性手套，待测DNA样品，λDNA，10×加样缓冲液，1×TE，离心机，移液器，吸头，紫外透射仪，凝胶成像系统，打印纸。
实验三特异引物PCR
1．实验目的
学习和掌握特异引物PCR（典型PCR）技术的基本原理和方法。为以后从事PCR相关研究奠定基础。
2．实验原理
典型的PCR（polymlracse chain reaction）用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。待扩增区段两侧的已知序列是设计物异PCR反应引物的依据。一般情况下，两引物的序列互不相同。PCR反应体系中，包括模板DNA，两段引物，dNTPs，热稳定DNA聚合酶和反应缓冲液。PCR反应是一种重复循环的DNA 体外复制过程，每轮扩增反应包括三个阶段：①高温变性：在高温（一般为94℃）下，双链模板DNA变性成单链。②降温复性：在较低温度下，（一般为55~65℃）两引物分别与模板DNA两条链上的互补序列复性。③适温延伸：在热稳定DNA 聚合酶最适反应温度下（如Taq酶为72℃），酶催化延伸引物，引物延伸合成的DNA序列由模板DNA序列确定。这三个阶段不断循环，且上一循环的产物又充当下一循环的模板，因此使特定的DNA区段倍增积累。PCR扩增的产物有两类：一类是具有定长的按指数级积累的DNA链，它的两个末端由引物的5＇端确定，而长度则决于两引物结合点间的距离。定长分子是以新生DNA链为模板合成的。另一类是以线性速率积累的更长的DNA分子，这类分子是以最初的模板分子为模板合成的，其长度可以大于模板上两个引物结合部位之间的距离。两类分子的量差异悬殊，定长分子占绝对优势。
本实验所使用的一对引物可特异性引导扩增小麦Glu-D1X5基因片段，特异性扩增产物约450bp。据此可检测不同小麦品种中Glu-D1X5基因的有无。该基因编码小麦籽粒中高分子量谷蛋白5亚基，常与编码10亚基基因紧密连锁。平均而言，含5+10亚基的小麦品种类群中出现优质面包小麦品种的频率较高。相反其等位位点编码2+12亚基的小麦类群中出现优质面包小麦品种的频率较低，简言之，对面包制作品质而言，5+10亚基组合与2+12亚基组合相比，前者可视为优质亚质组合，后者则为质亚基组合。因此设置此实验不仅可以帮助实验者熟悉典型PCR的原理和技术，同时使实验者掌握从事优质小麦相关研究的一种重要手段。
3．实验材料
①由实验一制备的不同小麦品种的DNA样品：其中一些小麦品种具有5+10亚基，如郑农16，中优9507，绵阳19等。而另一些小麦品种则不含5+10亚基，如中国春，陕229等。过些DNA在本实验中为模板DNA。
②Glu-D1X5基因的一对特异PCR引物：
引物1：5＇GCC TAG CAA CCT TCA CAA TC 3＇
引物2：5＇GAA ACC TGC TGC GGA CAA G 3＇
③Taq DNA 聚合酶（Thermus Aquaticus DNA Polgmlrase）：该酶是一种热稳定
酶，最初发现于嗜热水生菌（Therns aquaticus strain YT-1），它可以在74℃复制DNA，经95℃保温仍具有活性，（95℃时酶的半衰期为40min）这一未经修饰的酶的分子量为94KD，具5＇—3＇聚合活性和5＇—3＇外切酶活性，但缺乏3＇—5＇外切酶活性，因此不具校正功能，保真度较低(即DNA复制的准确度较差）。
该酶主要用于DNA PCR 扩增而不能用于DNA序列分析。对高保真度至关重要的PCR扩增反应则可选用其他的高保真度热稳定性DNA聚合酶，如Pfu等。
④10×反应缓冲液（MgCl2-free，即无MgCl2）：50mM KCl，100mM Tris-HCl，
（pH9.0 at 25℃）,1% Tritonx-100
⑤25mM MgCl2：MgCl2在PCR反应中的终浓度影响PCR扩增产量及扩增物异
性，MgCl2单独提供便于在建立PCR反应体系时根据不同的PCR引物和模板DNA调整优化MgCl2的终浓度。
⑥4dNTPs混合物：由dATP、dGTP、dCTP和dTTP等量混合而成，如每种贮
液浓度为10mM，则等量混合物中每种dNTP的浓度为2.5mM。
⑦PCR分子量标记（PCR marker）：本实验室常使用的标记由6个DNA片段组
成，长度依次为：1543、994、697、515、377和237bp。
4．实验程序
包知PCR反应体系的建立及PCR扩增、扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和实验结果观测记录。
[建议]：将模板DNA部分样品预先稀释至0.1μg/μl,供多次重复试验(如学生实验)甚为方便。
4.1 PCR反应体系的建立及PCR扩增
每个反应的体积为25μl,包括8μl模板DNA(0.8μg DNA)17μl其他组分。
①用移液器吸取每个供试模板DNA样品8μl，小心加入0.2ml薄壁PCR管底部，
并予编号，置冰上或-20℃备用。
表1 PCR反应体系
贮液终浓度1反应量(μl) 10反应量(μl) 20反应量(μl) 10×反应缓冲液1× 2.5 25.0 50.0
MgCl2(25mM) 2mM 2.0 20.0 40.0
4dNTP S混合液(2.5mM/each) 0.3mM/each
3.0 30.0 60.0
引物1 (16μM) 0.8μM 1.25 12.5 25.0 引物2 (16 μM) 0.8μM 1.25 12.5 25.0 Taq酶(3U/μl) 1.2U/25μl 0.4 4.0 8.0 D.D.H20 6.6 66.0 132.0 总体积17 170.0 340.0
②根据实验规模,按表1冰上混合配制其他组分,混匀稍加离心，重置冰上。
③按每反应17μl的量将上述混合液分装于盛8μl模板DNA样品的PCR管中（冰上操作）。
④将PCR反应管迅速放入预热至94℃的PCR仪中，并启动下列程序进行PCR 扩增反应，该过程需约1.5hr。
1．94℃5min 1个循环
2．94℃1min
3．63℃45s
2-4步30个循环4．72℃30s
5．72℃10min 1个循环
6．4℃无限时冷藏待电泳
4.2 PCR扩增产物凝胶电泳
①按实验一所述方法制备浓度为0.8~1.4%的琼脂糖凝胶
②在PCR扩增反应液中加10×的加样缓冲液约3μl,混匀,稍加离心后上样电泳，至溴酚蓝走至凝胶一半时即可观察(本实验扩增特异带紧跟于溴酚蓝后)。原始模板DNA样品可一同电泳以做阴性对照。如有必要可使用PCR分子量标记。
4.3实验结果观测记录
①电泳结果后，将凝胶置于紫外透射仪进行观察,建议将结果按表2记录。
②将凝胶置紫外凝胶成像系统扫描成像,打印结果并存于电脑备查备用。
表2 PCR扩增结果
泳道号DNA试样450bp特异带有无其他扩增带
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5．实验准备
实验开始前请根据实验规模和分组情况参考下列清单进行准备：
DNA样品，引物，Taq 酶，10×PCR反应缓冲液，MgCl2，4dNTP S，PCR 分子量标记，D.D.H2O, 1.5m l试管,0.2m l PCR试管,移液器及吸头,试管架,提前制冰,离心机,电泳仪,制胶板,样孔梳，胶带,琼脂糖,称量纸,量筒,三角瓶,微波炉,1×TAE,EB,10×加样缓冲液,一次性手套,紫外透射仪,凝胶成像系统。
附录：试剂溶液
1M Tris-HCl （pH8.0）
配制1000ml：
Tris 121g
D.D.H2O 800ml
浓HCl 约42ml
充分溶解后并冷到室温时补水至980ml左右,用浓HCl再细调pH至8.0,定容至1000ml高压灭菌,4℃保存。
0.5M EDTA (pH8.0)
配制500ml：
Na2EDTA·2H2O 93.1g
NaOH 约11g
D.D.H2O 400ml
加热搅拌溶解,冷至室温后补D.D.H2O至490ml、用10M NaOH细调pH至8.0，定容至500ml。
10M NaOH
配制100ml：
NaOH 40g
D.D.H2O溶解，冷至室温时定容至100ml
50×TAE 电泳缓冲液贮存液（pH≈8.5）
配制1000ml：
Tris 242g
冰醋酸57.1ml
Na2EDTA·2H2O 37.2g
D.D.H2O溶解定容至1000ml。
1×TAE工作液
40mM Tris·AC
2mM EDTA
配制1000ml：
20ml 50×TAE和980ml D.D.H2O 混匀。
EB（5mg/ml）
配制20ml：
EB 100mg
D.D.H2O 20ml
分成1ml小份避光保存。
10×电泳加样缓冲液
配制100ml：
溴酚兰0.25g
蔗糖40g
D.D.H2O 80ml
沸水浴助溶,冷至室温后定容至100ml,分装于1.5ml试管,4℃保存。
2×CTAB
100mM Tris-HCl pH8.0
2% CTAB
100mM EDTA pH8.0
1.4m NaCl
2%β-巯基乙醇(临用前加)
配制1000ml：
CTAB 20g
NaCl 82.2g
D.D.H2O 500ml
1M Tris-HCl (pH8.0) 100ml
0.5M EDTA (pH8.0) 200ml
加热搅拌助溶(若不易溶解,可沸水浴加热助溶),完全溶解后冷至室温,用D.D.H2O 定容至1000ml,高压灭菌后可室温长期保存使用。临用时，按需要量取出小份，每ml中加入20μl β—巯基乙醇，即兑即用。
1×TE （pH8.0）
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
配制1000ml：
1M Tris-HCl (pH8.0) 10ml
0.5M EDTA (pH8.0) 2 ml
D.D.H2O 950ml
10M NaOH 调pH值至8.0, D.D.H2O定容至1000ml,高压灭菌,4℃保存,不同使用者分出小份单存专用。
3M NaCl
配制100ml：
NaCl 17.5g
D.D.H2O 80ml
加热搅拌溶解,冷却后定容至100ml,高压无菌后, 4℃保存,用1.5ml试管分装单独
使用。
70%乙醇：
配制：无水乙醇和灭菌D.D.H2O按7：3体积比混合而成，4℃保存。
氯仿—异戊醇（24：1）
配制：500ml氯仿中加入20.8ml异戊醇混匀。
苯酚—氯仿—异戊醇（25：24：1）
配制：饱和平衡苯酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇(24:1)临用前按需要总量等体积混合而成。
无DNA酶活性RNase A（DNase-free RNase A）
配制：用D.D.H2O溶解RNaseA至1mg/ml，按1ml小份，分装至1.5ml试管,用封口膜包裹管口,煮沸10~30min，冷至室温后稍加离心,长期贮存置-20℃,短期贮存备用置4℃。
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验文档
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
微量加样器的使用及注意事项 1 微量加样器的使用原理及分类 根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。 活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml 之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。 以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。 2 微量加样器的一般使用原则 加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。 （1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。 （2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。 （3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。 （4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。 一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也