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根癌农杆菌介导的菊花遗传转化体系的建立及ipt基因的导入

西南农业大学

硕士学位论文

根癌农杆菌介导的菊花遗传转化体系的建立及ipt基因的导入

姓名:晁岳恩

申请学位级别:硕士

专业:细胞生物学

指导教师:李名扬;裴炎

2002.5.1

摘要

潞花是我国的传统花卉,也是世界四大鲜切花之一,占切花总量的23%。由于菊花的传统育种方式是利用芽变(菊花雌雄性性器官退化)的方法来选育新品种,所以育种的速度慢,周期长,定向性差J利用基因工程技术,有目的地向菊花中导入一些基因,培育抗病性好、色香形独特、观赏价值高的菊花新品种,不但可以有目的地改良特定性状,还可以缩短育种年限和加快育种进程。本研究通过再生试验选择了两个品种(山城之光和日本小黄)来作为遗传转化的材料,山城之光为切花菊,日本小黄为小菊。所选用的外源基因为抑制叶片衰老的SAG—IPT基因,以期得到耐贮运、瓶插寿命长的切花菊山城之光和抗衰老、花期长的绿化小菊日本小黄。

f1.建立了以幼叶和茎段为外植体的再生体系。

取植株刚展开的幼叶或幼茎,消毒后接入‘ⅥSl(MSO+I.Omg/L2,4-D+O.1mg/L6一BA)中预培养2-6天后,转入MS2(MSO+O.5mg/L6一BA+O.1mg/LNAA)(幼叶)、MS3(MS0+3.Omg/L6一BA+O.Img/呲~)(茎段)后可直接再生出芽。其中,山城之光和日本小黄的幼叶经预培养后再生率可达100%,而白雪、光辉、冬青、臼绣纺四个品种的再生率则较低,难以满足遗传转化的需要。日本小黄茎段再生率也达92%,山城之光再生率不足70%,其他品种的茎段再生率则极低。再生出的芽在I/2MS培养基上经7-10天可生根,生根率达lOo%。

2.建立了以幼叶为受体的遗传转化体系

取切花菊“山城之光”和小菊“日本小黄”的无菌苗叶片,切成4衄2大小,以OD。--O.5的农杆菌液感染30min,滤除菌液,接入MSl培养基上,于暗处共培养3天。共培养后,以附加有500mg/L的Cef和500mg/L的Carb的MSO液体培养基震荡脱菌培养2小时,无菌水冲洗5次,无菌滤纸吸干水分.然后接入MS2+50mg几Cef的培养基上延迟筛选培养3天,再转入MS2+50mg/LCef+Smg/LI(m培养基上进行筛选分化培养。30天后可分化出绿芽,把分化出的绿芽在I/2MSO+IOmg/LKm培养基上进行生根筛选,把能够正常生根的苗移栽田间,做进一步的鉴定。

3.通过PCR扩增表明,转基因植株中可以检测出有目的基因(ipt基因)的存在,目的基因已成功地插入菊花的基因组中。园艺性状观察表明,转基因植株和野生株存在有一定的差异。户1厂

关键词:菊花;根癌农杆菌;ipt基因;遗传转化;植株再生

mmnsformntionmediated、I!『A露}obtt矗edHmt瑚幡时酝毫ensandtheintroductionof

iptgeneintochrysunthemum

Candidate:ChaoYueen

Adviror:Prof.LiMingyang

Prof.PeiYhn

一(CentreofBiotechnology,SWAU,chongqingchina,400716)

Abstrat

Chrysanthemum,oneofthetraditionalornamentalflowersinChina,isoneofthe

fourcutflowersintheworld,making23%ofthetotalcommercialproduction.New

cultivarsweretraditionallybreededbyusingbudmutation.Ittakeslongperiodof

timeandispoor-oriented.Geneticengineeringprovidesanalternative.Itcanbeused

effectivelytomodifyaspecificcharacterwhileshortenthebreedingtime.Foreign

gene(s)havebeenengineeredtoobtainnovelornamentalcultivarswithparticular

andmorphology.Afterregenerationexperiment,twocultivars,cut

color,fl'agna/lce

flowerShanchengzhiguangandJapanesexiaohuang,wefeselectedaStargetmaterials

se燃eRceof

forgenetictransfornmtioninthispaper.SAG-邛Tprolongthe

leaves.ArmedwithSAG-IPT'transgeniccutflowerswithstorageresistant,longer

shelflifeandlongerflowerperiodmayheobtained.

1.Regenerationsystemwasestablishedwithyoungleavesandshootsasexplants.

MSl(MSOcontainingYoungleavesandshootsworebothpre-culturedon

1.0m#L2,4.Dand0.1rag/L6-BA)for3-6days,transferredtoMS2(MS0

MS3(MS0supplemented

supplementedwithO.5rag/L6-BAand0.1mg/LNAA)and

with3.0mg/L6-BAandO.1mg/LNAA)respectivelytoinducebudinitiationdirectly.

Withyoungleaves,LightofMoutainC时andJapanesexiaobuangwereregenerated

withfrequencyamountingto100%whileBaixue、Ouanghui、Dongqingand

Baixiufangworeregeneratedwithmuchlowerfrequeneywhichishardtomeetthe

needsofgenetictransformation.W.血shootS’JapanesexiaohuangandLightof

MoutainCitywereregeneratedwithfrequencyamountingto92%and7006

respectivelywhileBaixue、Guanghui、DongqingandBaixiufangwiththesamelow

monthMSmediumfor7-10days.

丘equency.Regeneratedbuswererootedon1/2

androoting心equcI唧amountodto100%.

2.Transformationsystemwasestablishedwithyounglcavvsastargetmaterial.

MoutainCityandYoungleaveswereexcisedfromsterileseedlingsofLightof

Japanesexiaohuang,cutinto4x4mm,dippedintoAgrobatedumsuspention(OD600adjustedto0.51for30min.PaReddryonthefikerpaper,transferredtoMS1mediumandCO—culturedfor3daysindarkness.Afterco-cultivation.alltheexplantswerewashedinliquidMSOmediumcontaining500mg/LCefand500mg/LCarbfor2hours.Washedwithsterilewaterfor5timesandpatteddryonthefilterpaperagahSubsequemly,theexplantswereu'ansferredtoMS2mediumsupplementedwith

medium50mg几Ceffor3daysdelayselectionandthetransferredtoMS2

supllementedwith50nvgLCefand5mg/LKmforselectionculture.Alter30days.greenbudsweremetedon1/2strengthMSOmediumcontaining10mg/LKm.Plantletwithrlormalrootsweretransferredto6eldforfurtheranalysis.

3.Confirmationoftrmlsformant.

IntegrationofSAG-IPTintochrysanthemumgenomewasconfu'medintwothirdsoftheputativetansgenicplantletbePCRamplification.Differenceofhorticulturalcharacterbetweentransgeaicandwild-typeplantswasobserved.

Keywords:Chrysanthemum:Agrobacteriumtumefaciens;ipt;genetictransformation;plantletregeneration

一.文献综述

1.1植物遗传转化研究橇况

缝物遗传转化(Genetictransformation)悬指铡用DNA薰缎、缀胞组织培

葬等技术,将步}源基嚣导入穗物缨臆或缀绞,获得转蒸嚣德糖豹技术。囊1983

年蕾次获褥转蒸西植物以来,橇物基因芷程骈究进入了蓬勃发箍阶段,得戮了缀

多转基因挺物。隧藩技术上豹不叛铡掰秘改进,转基圆成功的褴锈静类不敝增加,‘不仅颓予时橇秘,褥髓在戳前被认为对农杼蘩不敏感瓣单子冲棱携上畿取褥了成..功。到1997年初,筵豳西援准避入耀阉试骏煎转萋闲植镑这2584镪,批准17

饲转摹濯攘物憨离黑他释放。在我漫已搜准进行懑晶化垒产嬲4项,强蟪释放-、3l项,中溜试验iO磺,遮塑转蕊因植物涉及抗虫、抗病毒、改焚芯色、藐攫等

蚤耱农芝矬状。对夕}源基隧灼表达期遗传稳定髅的研究也在广泛歼展。通过基因

工程潋受佟镄器种已在农渡雯产及撵镌遗传窝静串显示出越来越题犬豹漤力(燹

士荣,1994,1997,1998)。迄今为止,甚获褥转基因植物西余种,其中农秆菌

转纯成功熬棱物融达116辨,蠢足手恻转基爨撼物被蹴握进弦羽嬲试验,涉及的

植物有50多个种,有的已进入或正在进入裔垃歼发阶段,专利报道屡觅不祥(歪

美拣等,1998)。

棱物遗传转仡技术的迅猛发畿,始予瓣裰癌农释藏Ti藤粒奔导豹天然遗传

转化系统的深入研究和应用。自1983年Zambryski用搬癌农秆藩介导法获得第

一捌转基因楗拣及1985冬Horsch蓠截摄癌农杼越站蠹转化法及1987年美瀑壤

耐尔大学Sanford等研翩成功蒸瓣稔戳来,新静转能方法与技术不断满嚣,极穴

她撼动了遗传转化搜零瓣发腥。这些按零凝攒麓来主要商三大类:载俸介等的转

纯、DNA蠢接转纯和种质系统转傀。

1.1.1载体夯导转讹法

1.1。1.1擞癌农抒藏会导瓣遗传转化

檀物基因王稷的开始,褥簸予麓土壤摄瘸农释蘸(Agrobacterium

tumefaciens)的研究。榛物缀融被掇痰农秆蘑澄染艏可形成植物肺癌。1974年,

Zeanen、Schell秘VamLarebeke等扶致癌农转蘩孛分离出~类匪失矮糙,这一’

质粒称为致痰质辍(Tumeoinducingplasmid),褥称Ti璇粒。蕈i囊被是农稀

薄中一辣垮澎的DNA分子(>200kb),可以独_窕于缍薅鹩捩DNA耀避行巍我筻铡。

彳i震粒上静~段T-DNA(Transferred-DNA)上宥生长豢蒸因_箨缨臆分裂豢蒸嚣,。

这骜蒸蠲的袋遮,破坏了植物体肉茧常煎激綮警衡,导致无蕊鬟|j冠瘘瘸酌形成。

T-DNA爵以撰入攘妨基羧组DNA中,成为基爨织DNA的一郏分并孳l起攘物绷照特

经钓变亿。戳魏,入桶试鬣利孀滚猝夭然静遗传转纯体篆,将舞源纂嚣瀵过T-IYNA

弓l入棱锪细胞,势零11月植物镪飚鲍金救链,经过绷臌或组织壤葬,由转化纲飑氍

生成完整的转基因植物,此即农杆菌介导的基因转移(Agrobacterium-mediated

transfer)。首次实现这种基因转移的是比利时根特大学的Montagus和gene

Schell及Monsanto公司的Fraley,他们将T-DNA上的致瘸基因切除(Disarmed),代之以外源基因,证明可以将外源基因转入植物基因组。并从转化细胞再生出完整的可育植株。

根癌农杆菌Ti(tumorinducingplasmid)质粒转化系统是目前研究得最

多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化系统之一。该系统以其转化效

率高、转化基因的目的性强、携带目的基因片段大(最大可达50kb)、拷贝数低、

整合后外源基因结构变异小、操作简单、周期短等优点(王关林等,1996;余淑

文等,1992;Ming等,1997;Paul等,1992),成为迄今转化成功最多的一种转

化方法。近年来,Ti质粒转化系统在曾被认为不是农杆菌宿主的单子叶植物的

遗传转化中也取得了很大的进展(贺晨霞等,1999)。迄今所获得的近200种转基因植物中,80%以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。

目前该方法主要使用两种Ti质粒载体,即共整合载体(Co—integrated

vector)和双元载体系统。共整合载体的典型代表是pGV3850。双元载体系统(Binaryvector)是由两个分别含卜DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的,其中一个是既能在大肠杆菌又能在根癌农杆菌中复制的小质粒,含有卜DNA边界序列、外源基因插入位点和选择标记基因;另一个是缺失了卜DNA的Ti质粒,具有完整的Vir区基因。通过接合转移将重组质粒导入农杆菌,然后用以转化植物。由于双元载体的Ti质粒能提供反式Vir基因功能,而重组质粒又能在农杆菌中自主复制,因此省去了体内重组的步骤。操作简单,提高了转化效率。1.1.1.1.1Ti质粒的结构及改造

野生型Ti质粒约150_屹OOkb,包括T—DNA(transferredDNAonTiplasmid)区、毒性区(vir区:Virulenceregion)、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿瘸分解位点。其中以T—DNA区与毒性区在植物转化中最重要。T-DNA可以整合到植物基因组中,携带有致瘤基因(iaam、iaah、ipt)和冠瘿碱合成酶基因(OCS、acs、nosetc)。T—DNA两端有25bp末端序列,它是T-DNA转移所必须的,胭脂型T—DNA有两个,章鱼碱型T—DNA有四个。Vir区长约30kb,由VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH7个操纵子等个基因组成,共同调控T—DNA的加工与转移(顾红雅等,1995)。

T-DNA上致瘤基因不是T—DNA转移所必须的。切除后并可以外源基因取代,

而应用于目的基因的植物遗传转化工作。最初的Ti质粒载体为共整合载体,携带有Yir区,使能携带的目的片段较小,后来发现,Yir区可以构建到另一个辅助质粒上,从而构建的双元载体可携带更大的目的片段。

1.1.1.1.2T—DNA整合机理

根癌农杆菌通过T—DNA的转移把外源基因导入植物细胞并整合到核DNA上,T.DNA的转移过程非常复杂,它包括农杆菌附着植物细胞壁、T—DNA在农杆菌中被加工剪切、越过细菌的细胞膜、细胞壁、以及植物的细胞璧、细胞膜,最后越过核膜,整合进植物基因组。当植物细胞受到损伤时,会发生创伤反应,产生~些创伤信号分子如乙酰丁香酮(AS)、羟基乙酰丁香酮(OH—AS)等小分子酚类物质。根癌农杆菌对这些信号分子具有趋化性,可以借此向创伤细胞运动并与之附着。

信号分子尤其是AS、0H—AS首先活化VirA基因,其产物可以直接感应酚类物质。VirA活化后进一步激活VirG。VirG是一种转录激活因子,可以打开VirB、VirC、VirD、VirE、VirH等基因。

VirB活化后,VirD基因产物对DNA进行加工剪切,Vir吼结合于T—DNA链57端,它具有核定位信号及保护T一链的作用。VirE蛋白为单链结合蛋白,可与T一链结合并形成T~复合体。T一复合体可以通过在细菌质膜上形成的通道转移并进入受体植物的细胞。VirE2也含有核定位信号,与VirD:共同引导T-DNA进入受体细胞中,并随机整合到受体细胞核基因组中。

在T—ONA转移过程中农杆菌核基因组中ChvA、ChvB、aft、pscA、ChvD、及ChvE基因也有一定的作用。ChvA、pscA突变,会使农杆菌失去与植物细胞附着的能力,ChvB会影响细菌的致瘤能力。ChvD在低pH和磷酸饥饿情况下可诱导VirG蛋白保持一定水平的表达。VirE蛋白可与葡萄糖与半乳糖结合,能识别植物受伤后产生的糖单体,导致细菌向植物伤口的趋化性,因此,T—DNA的转移是由Vir区与宿主农杆菌核基因组中相关基因共同作用的结果(顾红雅等,1995)。1.1.1.2发根农杆菌Ri质粒介导的遗传转化

发根农杆菌(Agrobacteriu口rhizogenes,肛,Ri质粒系统与根癌农杆菌Ti质粒系统相似,但研究较Ti质粒系统晚。Ri质粒系统的特点是可以不经御甲进行转化,获得发根,发根可再生成植株,而且再生的植株起源于单个细胞,克服了嵌合体的困难。同时也可用于有价值的植物次生代谢产物的生产。因此Ri质粒系统是~种很有前途的转化系统。有待于进一步的深入研究。迄今,Ri质粒介导的遗传转化也有很多成功的报道(Haniseh.ch.1988『:何玉科,1990)。

发根农杆菌的Ri质粒与根癌农杆菌的Ti质粒的致瘤性不同。发根农杆菌转化植物后,在浸染部位形成发状根,诱发的发状根可以通过愈伤组织或胚胎发生的途径重新形成植株。随着Ri质粒转化机理的深入研究,Ri质粒在遗传转化系统中的应用将会越来越多。

1.I.1.3其他载体介导的遗传转化

除农杆菌Ti、Ri质粒载体系统外,植物病毒(王关林等,1998)、人工染色体、RNA病毒、线粒体DNA、类病毒、叶绿体DNA、核复制子、S1类质粒等(朱

玉贤等,1995)都可作为遗传转化的载体系统。其中病毒介导的遗传转化研究得较多,但因病毒载体转化的基因很难通过有性繁殖传递给后代,其应用受到很大的限制。

1.1-2DNA直接导入法

1.1.2.1基因枪法

该法又称为微弹轰击法(microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistics),它是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面t然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞。微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到植物染色体上,得到表达,从而实现基因的转化。白1987年康耐尔大学Sanford等研制出火药基因枪以来,研究者们相继开发出了高压基因枪、压缩气体驱动的基因枪、粒子流基因枪、微靶点射基因枪和气枪基因枪等,开创了基因枪转化技术飞速发展的局面。基因枪法在一些利用载体系统难以转化的禾谷类作物遗传转化中取得了很大的成功,目前利用基因枪技术已获得了烟草(Vasil等,1992)、小麦(Daniell等,1990;赵虹,2001)、水稻(LiL,eta1.,1993)、玉米(FrommM.E.eta1.,1990)、燕麦(SomersD.A.eta1.,1992)、谷子(贾士荣,董云州等,1993)等作物的转基因植株。基因枪法是一种很有前途的方法,但具有转化率低,成本高,易污染,多拷贝及转化不稳定等缺点,因而有待进一步的改进。

1.1.2.2PEG法

PEG(Polymerasechainreaction)是一种选择性化学渗透剂,它可以改变质膜性质引起透性改变,从而促进外源遗传物质进入原生质体而实现遗传转化。Davey(1980)和Krens(1982)等首次用PEG法将Ti质粒DNA导入矮牵牛悬浮细胞原生质体中。其主要原理是在聚乙二酵(PEG)、多聚一L一鸟氨酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。应用此方法已得到水稻(Davey等,1991:朱祯,1991:田波,1992)、高粱(卫志明等,1991)、小麦(郭光心等,1992)、玉米等重要粮食作物的转基因植株。在双子叶植物中取得了更多的成果,如烟草、绿豆(黄健秋等,1991)、杨树(王善平等,1991)、火炬松(Gupta等,1988)、白云杉(Bekkaoui等,1988)等。PEG法要求以原生质体为受体,限制了这种方法的广泛应用,但在细胞器转移方面仍有很大的应用价值。

1.1.2.3脂质体法

脂质体(1iposome)是由脂质双分子层组成的类膜状结构,具有同时与生物大分子和原生质体亲和的能力,故可以介导DNA进入细胞并实现遗传转化。该方法是利用脂质双层分子包被DNA分子进入植物原生质体的一种方法,常与电击法、PEG法配合使用.脂质体可直接转移外源RNA或DNA,也可用于基因的瞬时

表达检测,特别对植物病毒RNA的转化具有较高的转化率。朱祯等1990年利用脂质体将人的a一干扰素cDNA导入水稻原生质体获得转基因植株,并检测了干扰素在水稻细胞中的有效表达,转化效率达14%。烟草(Nagata等,1981;袁天华等,1994:Fraley等,1982)、长春花(Fukunaga等,1981)、玉米(AntonelliN.。1990)、矮牵牛、胡萝卜等用脂质体方法转化都获得了较高的转化率。1.1.2.4电激法

电击法,又称电击穿孔法。其原理是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上“电激穿孔”(electro-poration),形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA摄取的一种转化方法。Form(1986)等首先运用此方法,将CAT基因转移到烟草、胡萝卜和玉米原生质体中,并得到了表达。近年来对电激法的使用又有所发展,可直接利用带壁的植物组织和细胞进行转化,这种技术称之为“电注射法”,并已在水稻上获得转基因植株(李宝健等,1990)。

1.1.2.5超声波法

低声强脉冲超声波处理植物细胞,可改变植物细胞质膜的通透性。并能引发细胞局部破裂,从而使DNA进入细胞并实现遗传转化。许宁等(1990)利用超声波将质粒pBll21导入小麦幼穗诱导的愈伤组织,获得了30%发瞬间表达。章立健等(1991)利用此技术将GUS基因导入小麦幼穗愈伤组织,以及将CAT基因导入甜菜和烟草原生质体,均得到瞬间表达。贾士荣等(1991)用此方法获得的转基因植株的频率以起始外植体数计算,可达到22.3%。超声波法不受受体种类限制,且操作简单,转化效率高。

1.1.2.6显微注射法

显微注射法是用微毛细管在显微镜下将DNA导入特定细胞使之成活、增殖并获得转基因植株的遗传转化方法。显微注射法历史悠久,在70年代就已成功地应用于动物转化,80年代中后期开始应用于植物转化。显微注射于细胞核、原生质体及完整细胞或胚性细胞团均可进行转化。如Toyoda等(1988)把NPT—II基因注射到番茄的愈伤组织细胞,获得了转基因植株。Neuhaus等(1987)用油菜花粉起源的12细胞期的体细胞胚注射含NPTII基因DNA,转基因植株的频率可达到27%一51%。DNh直接注射花粉粒、卵细胞、子房也获得理想结果。该方法的缺点是工作效率较低。

1.1.2.7微束激光穿刺法

激光是一种很强的相干单色电磁射线,一定波长的激光经聚焦后其直径大约只有0.3-0.5um,这种直径很小而能量很高的激光微束能击破细胞壁并能引起细胞膜的可逆性穿孔,从而导入外源DN^并实现遗传转化,这就是激光微束穿刺法。激光微束可以瞄准靶细胞导入外源基因,并可对细胞器进行转化,如Weber等将外源基因导入油菜叶绿体。应用激光穿刺法,已将外源基因导入小麦(王兰岚等,

1992)、百脉根(周亦华等,1994),也可对花粉进行转化(Yamaguchi,1994)。但激光穿刺法操作慢,只能穿刺表层细胞,而且需要昂贵的设备,只有在不能使用基因枪法及显微注射法的特殊情况下,才能显示其优越性。

1.1.2.8碳化硅纤维介导法

利用直径为0.6um,长度为lO-80um的碳化硅纤维丝,借助于涡旋引起的相互碰撞中纤维丝对细胞的穿刺作用,将黏附在纤维丝或细胞壁上的质粒DNA导入细胞,即是碳化硅纤维介导的基因转化,其中碳化硅纤维丝起到微注射的作用。该方法无基因型限制,广泛适用于单子叶和双子叶植物,操作简便快速,不需要昂贵的仪器设各,可转化完整的细胞和组织,具有良好的应用前景。利用碳化硅纤维介导法,已获得转基因玉米(Kappler,1990:Frame,1994)、烟草(Kappler,1990),并对真核藻类实现了稳定转化(Dcmuhay,1993)。

1.1.3种质系统转化法

种质系统(germlinetransformation),也称生物媒体转化系统,即借助生物自身的种质细胞为媒体,特别是植物生殖系统细胞(花粉、子房、幼胚、卵母细胞等)以及细胞自身结构来实现外源基因转化的系统。主要包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊与子房注射法、萌发种子转化法等。花粉管通道法是由周光宇等(1983)建立并发展的,它利用植物开花受粉后形成的花粉管通道导入外源DNh,实现转化的一种方法。在棉花、水稻、大豆等作物上均已有成功的报道。种子系统转化法的主要优点是对基因型的依赖小,适用于一切开花植物,无须烦琐的离体培养阶段,操作快速简便,成本低。尽管机理尚不十分明确,分子学方面的证据尚不充分,但仍然得到了比较广泛的研究和应用,转化成功的报道也日益增多,在水稻(Luo,Wu,1998;谢道听等,1991)、小麦(曾君祉等,1993)、棉花(谢道昕等,1991)、玉米(丁群星等,1993)、烟草(Leonne,】995)、油菜(林良斌,官春云等。1999)等作物中取得成功。

1.2花卉基因工程研究概况

花是高等植物繁衍生命的重要器官,不同植物的花大小、形态、色彩各异。传统的杂交育种及定向选择育种培育了大量的花卉新品种,但也有其局限性:在自然条件下,植物变异频率比之人类的篙要要小得多;人工诱变虽然提高了变异频率,但仍不够高,且盲目性比较大。杂交育种虽然能弥补两者的不足,却也面临着远缘杂交不亲和,难以打破物种生殖隔离,在有性生殖过程中,重组时染色体的交换量小,难以打破某些基因连锁,杂交育种周期长,一个新品种的育成,往往经过多年杂交,且会使某些优良性状难以保持,这就给改良某一单一性状带来极大不便。在传统育种基础上采用基因工程技术可以对植物的基因进行修饰,获得某些运用传统育种方法所不能达到的改良效果。基因工程技术为花卉改良开

辟了一条全新的途径。80年代以来,基因工程技术在遗传转化花卉植物花色、花形、花香及延长瓶插寿命等方面取得了重要进展。

1.2.I花卉花色基因工程研究

花的颜色主要受两大类化合物决定,即类黄酮和胡萝h素,类黄酮有3000种,是普遍分布于植物体内的次生代谢物,参与植物许多功能,如防止紫外光、抵御病原、诱导病原和使花粉保持活力等。基因工程技术可以从两个方面来改变花的颜色。第一,抑制类黄酮生物合成基因的活性,从而导致中间产物的积累和花色的改变。对基因的沉默有不同的理论假说,如DNA的异位配对,DNA的甲基化,染色质的改变,反义RNA的抑制和共抑制。反义RNA技术已被成功地用来抑制CHS基因的活性,在CHS基因反义链转基因的植物中,CHS的mRNA活性都有所降低,从而造成CHS无色底物的积累,使花颜色变浅或成白色,如利用单链DNA的烟草黄化矮化病毒(TYMV)改造成一个载体,构建成一个35s启动子:查尔酮(类黄酮的一个亚类)合成酶的表达质粒转化到矮牵牛中,可以获得多种随机有白色花斑模式且可遗传的转基因植株。白色花斑随机分布在花瓣上。经研究发现RNA的转录没有受到影响,但CHSA稳定态的mRNA水平降低了,也就是说转录后CHSA的活性受到了影响,且与CHSA的拷贝数有关(Rose等1998)。另一种抑制基因活性的方法是利用具有酶活性的RNA分子,能特异地切断mRNA,从而阻止其编码蛋白的合成。第二,引入新基因来补充某些品种缺乏合成某些颜色的能力。Meyer等将玉米(ZeamaysL.)的DFR基因导入白色矮牵牛中,单拷贝的转基因矮牵牛的花色表现为红色,而多拷贝的转基因矮牵牛的花色表现为白色。美国DNAP公司已从矮牵牛中分离了编码兰色的基因并使之转入玫瑰创造出了原来没有的兰色玫瑰,

1.2.2花型基因工程研究

传统植物形态学的研究早已推断:在进化上,花器官与叶属同源器官。遗传学分析的结果也表明叶是花器官的“基础形态”。花发育的研究属于基础理论研究,同时它也为遗传操作改变花的形态开辟了应用前景。从研究的角度可把植物花的发育划分为4个阶段:花序发育、花芽发育、花器官发育、和花型发育。经过研究发现了大量与花型有关的基因,例如:与花萼形成有关的APETALAl(API)基因、与花瓣与雄蕊形成有关的APETALA2(AP2)基因、与雄蕊和心皮形成有关的PAETALA3(AP3)、PISTILLATA(PI)、AGAMOUS(AG)、SUPERMAN等基因(H面in把s)。1.2.3切花保鲜研究

玫瑰、菊花、郁金香、百合和香石竹是世界销量最大的五种切花。近年来,转基因育种的热点相对集中在玫瑰、香石竹、菊花和非洲菊上.由于切花从产地的温室经由拍卖市场、花店才会到顾客手中,此时切花仍要有很长的瓶插寿命,这样才能使颐客满意.假如鲜切花不具备最起码的瓶插寿命,单靠花色和花型是

很难在商战中获胜的。因此,控制花瓣和花朵的衰老过程是育种家是十分感兴趣的研究课题。乙烯在调节花衰老过程中的重要性已经清楚。乙烯生物合成途径的关键酶的基因,^cc氧化酶和Acc合成酶,已经分离出来并已鉴定。利用反义技术,两种大花香石竹被导入ACC氧化酶基因,这些转基因香石竹的瓶插寿命几乎二倍于原品种,增加了5_啕天。应用AcC合成酶的共抑制技术也成功地延迟了香石竹的寿命。细胞分裂素对ASA诱导的乙烯有很明显的拮抗作用,对切花施以细胞分类素可以显著地延长瓶插寿命。本论文的研究内容,就是把细胞分裂素基因(ipt基因)转入菊花,使切花中的细胞分裂紊维持在一定的水平,以期延长菊花的切花瓶插寿命。

1.3菊花研究概况

菊花(Chvyssnthemummorifolium),原产于我国,是一种多年生宿根革本花卉,栽培历史悠久,名贵品种极多,如:月明星稀、千尺飞流、祥云蝶舞、天女散花、杏花春雨、嫦娥奔月、绿衣红裳、春水绿波、绿牡丹、墨麒麟、玉翎管、粉松针、鸳鸯菏、梅花鹿、金风钗、桃花线、绿云、光辉、笑靥、虎啸、白雪等。相传我国养菊已有2000多年历史,拥有3000多个品种。唐宋时代,菊花传到日本,17世纪以后陆续传到欧美,现已在全世纪广为分布,成为世界上主要名花之一。也是世界四大鲜切花之一,占总鲜切花量的23%,在花卉产业中占有很重要的地位。

随着国际上对环境保护的重视,绿化植物的需求与日俱增。对菊花的需求包括切花菊和小菊两种。切花菊主要用于观赏,它花形大而艳丽,色香俱佳,适于庭院种植或做切花用,如上述的一些名贵品种及本实验中所用的山城之光等。小菊是一种很好的绿化用草花,它是菊花品种适于地栽、绿化的一个分支,特点是株丛较矮,花小且多,而且各色品种俱全,远观、近赏效果均佳,在本实验中所用的日本小黄即是小菊的一种。

菊花不但有很高的观赏价值,而且有药用、茶用、食用等多种经济用途,这在历代有许多古书中都有记述。菊花最初就是因为有药用价值才引起古人的重视和栽培。古代的药用菊是野菊又名苦薏。据<神农本草经》和‘本草纲目》记载它能治多种疾病。根据医学分析,野菊的花、叶、茎含有腺嘌呤、氨基酸、胆碱、水苏碱、黄酮类以及微量维生素等成分,有消除外感风热,恶寒头痛,以及清热解毒、清脑明目的功效,能治高血压、冠心病、偏头痛、淋巴腺炎肿、急性结膜炎等症。用菊花做饮料,更见普遍。菊茶有清凉镇静明日养肝、消炎解热等医药功效。除了具有实用价值的野菊外,今人种菊多以栽培观赏品种为主。由于菊花是园林中的重要花卉,因此不但品种日益丰富(已超过3000多个品种),而且造型艺术精益求精,频放异彩.这些菊花艺术珍品包括多头菊、独本菊、大立菊,悬崖菊一塔菊、树菊、扎菊图案、小菊盆景等等,千变万化..备具风蚕.随着我

国园林事业的日益发展和人们生活水平的不断提高,目前各地都迫切要求绿化、美化、彩化环境,对菊花需求也日益增加。

1.3.1菊花组织培养

菊花用不同的外植体均能建立再生体系。国内外都傲过较多研究,早在1983年裘文达曾建立起名贵菊花绿牡丹的茎尖快繁体系。唐巍等(1993)建立起了菊花的幼叶再生体系。谬为(1997)、谷迎春等(2000)建立了菊花花蕾的再生体系。菊花叶片、茎尖、头状花序产生愈伤组织然后再生出小植株,也可直接再生出不定芽。其中用幼叶和茎可获得较高的再生率。但是,菊花品种间的再生能力的差异是非常明显的。

1.3.2遗传转化

由于传统的菊花育种方式是利用芽变(雌雄性性器官退化)的方法来选育新品种,速度慢,定向性差。利用基因工程技术,有目的地向菊花中导入一些基因,来创造抗病性好、观赏价值高的菊花新品种,不但可以有目的地改良特定性状,还可以缩短育种年限和加快育种进程。

目前,对菊花的遗传转化已有了一些报道,Ledger(1991)等首次详细报道了用野黄菊(nindicum)叶圆片做遗传转化并再生成功。用农杆菌LBA4404和双质粒PGA643,携带选择标记基因NPTII,转化率约1%。1993年Renou使用超级毒性的EHAl01菌株,用节、节间、和叶的外植体接种后共培养一段时间,然后用潮霉索进行筛选,获得了转基因菊花。Fukai等(1995)报道了用菊花的茎外植体获得高转化率。把菊花外植体与AGLO菌株共同培养后转入高浓度吲哚乙酸(IAA)中7天,然后再转入低浓度的IAA培养基中,结果得到了约15%的转化率。此外,Yepes等(1995)、Courtney—Gutterson(1995)、傅荣昭刘敏(1998)和邵寒霜李继红(1999)也发表了转化成功的报道。

用基因工程的方法改变菊花的花色取得了成功:从菊花花瓣中分离出查尔酮合成酶基因,从正义和反义方向产生转基因菊花。结果,Moneymaker栽培品种的典型粉红色花变成了白色,在133个正义方向的转基因菊花中仅有3株是全自的,88个反义方向的转基因菊花中也得到了3株全白的。正义和反义转基因表型在稳定性方面没有发现明显的差别。反义技术在非洲菊上也证明是有效的:非洲菊的查尔酮合成酶基因的抑制作用可使原来的红色变成淡粉红和奶自色。1.4ipt基因研究概况

细胞分裂素(cytokinins)具有促进细胞分裂、器官分化和调节某些重要生理生化过程(如叶片衰老、色素积累、延长切花寿命等)的作用。Ipt基因产物催化细胞分裂素生物合成中最重要的一步限速反应,即5’一磷酸腺苷和△2一异戊烯基焦磷酸化合生成旷[△2-异戊烯基]-5’一磷酸腺苷的反应,ipt基因不在细菌中表达,其序列已被克隆.Ipt是人们了解得囊清楚的和鲴胞分裂鬃合成有关的酶,

他是爿.tumefaciens的Ti质粒上T—DNA区里的ipt基因(也称作tmr基因)编码的异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase,IPT)。ipt基因已被成功地导入烟草、黄瓜、向日葵、矮牵牛和石刁柏等植物中,本实验室目前也已将该基因导入到了小麦、棉花和菊花中。将ipt基因和强启动予CaMV35S融合,获得的转基因植株的芽中细胞分裂素含量比对照增加300倍之多。这样高的激素含量严重抑制根的形成,因而难以获得完整的再生植株,而将ipt受控于热激蛋白启动予之下,则能克服上述困难。用玉米和果蝇的hsp70启动子调控ipt基因转化烟草属植物,获得的转基因植株在正常环境下,其体内细胞分裂素的含量比对照高数倍,从而导致植株矮小,侧芽增多,根系生长缓慢,但是植株的开花、花期以及生殖过程不被显著影响。但对这些转基因植株热激处理2小时后,其体内细胞分裂索的含量迅速增加几十倍至上百倍。用大豆的hsp6871启动子调控的ipt基因转化烟草,获得了表达IPT的转基因植株,它表现出叶片延迟衰老的现象。Ipt基因的这一作用为提高作物产量提供了另~种可能的途径。

二.引言

据统计,1999年世界花卉消费额1000亿美元左右,而到2000每已超过2000亿,二十一世纪预计有更大幅度的增长,每年的增长速度估计在109‘以上。作为世界园林之母的我国,花卉产业正以世界瞩目的速度发展,将进入世界花卉生产和发展的前列。菊花是原产于我国的传统十大名花之一,也是世界四大鲜切花之一上群翱怙曲-l¥-fih9q世甘办卅鬼茹圉由饷禺薤批廊乃漆诵且右+昝雷嚣冉竹音

的促进作用,用6-BA处理菊花,可延长菊花的瓶插寿命?

细胞分裂素对ABA诱导的乙烯有很明显的拮抗作用,对切花施以细胞分类素可以显著地延长瓶插寿命。所以利用生物技术向切花植株种转入与细胞分裂素合成有关的ipt基因,使其抑制切花中的ETH的合成,使切花中的激素维持在正常的水平上,可有效地防止切花的衰老:对于绿化用小菊来说,可延长其花期,阻It花朵过早地枯萎。

三.材料与方法

3.1材料

3.1.1植物材料

切花菊山城之光、白绣纺、白雪、光辉和小菊目本小黄五个品种由园艺系园林花卉教研室的陈林老师惠赠,采自园艺系花卉苗圃。

3.1.2农杆菌菌株及质粒与基因

农杆菌菌株:LB^4404

质粒:Pbs97(含SAGl2-ipt抑制衰老的自动调控元件),该表达载体含育瑚FrrIl基因,进行遗传转化时可通过卡那霉素抗性筛选获得转基因植株。其简易示意图如下所示:

RBLB

?匿亚亘玛.匝巫至逝重一.凰斗

目的基因:ipt

3.1.3试剂及主要仪器设备

组织培养所用化学试剂均为国产分析纯,购自重庆化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin,Km)购自上海生物工程有限公司,头孢霉素(Cefotamine,Cef)购自珠海丽康医药有限公司,乙酰丁香酮(Acetosyringone,As)购自北京欣经科生物技术有限公司。

主要仪器设备:超净工作台,高压灭菌锅,摇床,离心机、PCR仪等。3.1.4常用溶液

TE

TriS"HCllmmol/L

EDTAlmmol/L

质粒DNA快速抽提缓冲液

LiCl2.5mol/L

Tris?HCI(p118.0)50mmol/L

Triton一1004%(V/v)

Na2一EDTA62.5retool几

植物DNA抽提缓冲液(2×cTAB缓冲液)

Tris?Hcl(pf{8.0)100衄oi/L

EDTA20mol/L

NaCl

CrAB

50xTAE(电泳缓冲液)

Tris

冰醋酸

0.5reel/LEDT^3.1.5基本培养基3.1.5.1细菌培养基

LB培养基

Bacto—tryptone

Baeto—yeastextact

NaCl

pH7.21.4mol/L2%(w/V)

2429/L

57.19/L

100ml/L

lOg/L

59/L

109/L

(固体培养基加1.5—2%的琼脂)

YEB

Bacto—tryptone59/L

Bacto—yeastextract1g/L

Beefextract59/L

MgS仉‘7B:00.4399/L

pB7.0

(固体培养基加入1.5—2%的琼脂)

3.1.5.2植物培养基

基本培养基MSO..MS(Murashige—Skook,1962)矿质元素+MS有机物+7.59/L琼脂+309/L蔗糖,pH5.8。液体培养基不加琼脂.

几种主要的培养基:

幼叶和茎段预培养基MSl:MSO+1.Omg/L2。4-D+0.2mg/LBA

幼叶分化培养基MS2:MSO+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA

生根培养基1/2MS:MSO培养基的矿质元素和有机物成分减半

其他培养基根据研究目的的不同在以上各种培养基中再附加不同种类与浓度组合的激素和抗生素。

3.2实验方法

3.2.1培养条件

所有组织培养过程若非特别说明。都是在24—26℃、1Bh光照/Sh黑暗光周期、光强度1500"-2000Lx的培养室中进行..农杆菌在2812、180r阳的恒温摇床

17

上培养。

3.2.2无菌材料的获得

选取盆栽菊花的下部新萌发的根蘖苗,取顶部0.5一lcm左右,用自来水冲洗30min,然后用70%的乙醇消毒imin,无菌水冲洗一次,再用0.1%的升汞灭菌8min左右,无菌水冲洗5—6次,插到1/铷S上,令其生长,既可获得无菌苗。组织培养和遗传转化所用的无菌叶片和茎段可直接从无菌苗上获得。3.2.3再生体系的建立

3.2.3.1幼叶再生体现的建立

取山城之光无菌苗的叶片,切成4mm2大小,接入MSO+0.Img/INAA+0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/IBA的培养基中分化培养,40d后统计再生频率。3.2.3.2叶龄对再生的影响

取山城之光上部花蕾部位的老叶和根部新萌发的脚芽上的幼嫩叶片,用75%的酒精、升汞灭菌后,在MSI上预培养2d,再转入MS2中分化,40d后统计分化率。

3.2.3.3基因型对幼叶再生的影响

取山城之光、自绣纺、自雪、光辉和小菊日本小黄等品种的无菌苗叶片,切成4衄2大小,接种于MSI培养基上预培养2d。然后转入MS2培养基上进行分化培养,40d后统计个品种的分化率。

3.2.3.4预培养对幼叶再生的影响

取山城之光和日本小黄无菌苗叶片,切成dram2大小,接种于MSI培养基上培养,培养时间设置为0、2、4、6、8d五个时间梯度。然后转入MS2培养基上进行分化培养,40d后统计分化率。

3.2.3.5茎段再生体系的建立

取日本小黄无菌苗幼茎,切成2mm左右的不带腋芽的茎段,接种于MSI培养基上培养2d。然后转入MS0+O.Img/]N/ul+0、lt0、2.0、3.0、4.Omg/]BA中,40d后统计分化率。

3.2.4转化方法和转化条件的研究

3.2.4.1选择压及头孢霉素浓度的确定

3.2.4.1.1选择压的确定

取山城之光无菌苗叶片,切成4mm2大小,接种于骼l培养基上培养3天后,分别转入MS2+0、1、5、10、20、30、50、70mg/ll(Ⅲ的培养基中,于30天后统计再生率、正常芽率及再生芽的白化情况。

3.2.4.1.2头孢零素(Cof)对再生的影响

取山城之光无菌苗叶片,切成抽_l大小,接种子ttSl培养基上培养2天后,分

{蓉

别转入MS2+O、50、100、200、400、600、800醒/1的培养基种分化培养,于30天后统计再生率。

3.2.4.1.3卡那霉素对生根的影瞎

取无菌菌山城之光茎尖,分别接种于I/2MS+O、1、5、10雄/1硒培养基中,15天后检查生根情况。

3.2.4.2农杆蕾的培养与活化

取出喝O℃下保存的农杆菌菌种PBSG7,划线接种于附加有50喀/lj(m、125mg/1Sm的YEB培养基平板上,在28"(2下倒置培养2天。待菌落长出后,挑取一个单菌落,借重于5m1附加50mg/1Km、125mg/1Sm的YEB液体培养基中,180rpm、27"C下置于摇床上震荡培养,进行预活化。取25_-50ul菌液接种于50ml同样培养基中相同条件下培养至对数生长期。取对数生长期菌液室温下6000rpm离心8min,去上清,以MSO液体培养基重悬浮,调on。=0.5,备用。

3.2.4.3转化方法

取无菌苗山城之光的叶片,切成4衄2大小,然后浸入备好的农杆菌菌液(加入lOOumol/l的乙酰丁香酮)中感染30,,,in,其间不断震荡使菌液与外植体充分接触。滤去菌液,取出外植体,置于无菌滤纸上吸干多余的菌液,转入铺有滤纸的MSl培养基中,叶片背面朝向培养基,于暗中培养3天。

共培养结束后,将外植体转入MSO+500mg/lcef+500mg/1carb的液体培养基中,于摇床上震荡洗涤培养l—2个小时。然后滤除液体培养基,用无菌水冲洗5次,把外植体转入MS2+50mg/ICef中延迟筛选培养3—6天,再转入MS2+50mg/ICef+Smg/IKm培养基中进行筛选分化培养,20天转接一次,直到分化出芽(需要30一40天)。待绿芽长至1cm高时,既可进行生根筛选。3.2.4.4转化方法的优化

3.2.4.4.1感染时间对转化的影响

取山城之光无菌菌叶片,切成4mm2大小,按3.2.4.3的转化方法,感染时间设置为15min、30rain、60rain三个时间梯度,农杆菌浓度为0D。o-0.5,共培养3天,延迟筛选6天。转入分化筛选培养基(MS2+500rag/ICef+500mg/IKm)中分化。于40天后统计分化率。

3.2.4.4.2共培养对转化的影响

取山城之光无菌苗叶片,切成4mm2大小,按3.2.4.3的转化方法,感染时间为30min,农杆菌浓度为oD‰=O.5,共培养时阃设置为0、l、2、3、4d五个时间梯度,延迟筛选3天,转入分化筛选培养基(骼2+500曜/lCef+500mg/1硒)中分化。于40天后统计分化率。

3.2.4.4.3延迟筛选对转化的影响

取山城之光无菌苗叶片,切成4岫。大小,按3.2.4.3的转化方法,感染时

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