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流式细胞术的最新应用进展(幻灯片)

流式细胞术临床应用

流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,PI可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N),而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期,S期和G2/ M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率,DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程,而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时,在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变,FCM可精确定量DNA含量的改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。有资料证实,癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重,DNA非整倍体出现率增高,这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据,FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案,从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物,对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段,胞浆膜磷脂的不对称性丧失,导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的,也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的,而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的,而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此,Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色,凋亡细胞可被标记上Annexin-V,坏死和凋亡晚

(完整版)精准检验对流式细胞术的发展和质量控制要求

精准检验对流式细胞术发展和质量控制需求 盛慧明 2016年11月11日

一、流式细胞术发展历史和现状 二、流式细胞术的最新进展 三、BEAMing技术 四、流式细胞术的质量控制

一、流式细胞术发展历史和现状 二、流式细胞术的最新进展 三、BEAMing技术 四、流式细胞术的质量控制

一、流式细胞术发展历史和现状 流式细胞术Flow Cytometry 现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代,源于对细胞进行分选,所以最早是Fluorescence-activated cell sorting ,FACS;最早的omic 经过近四十年的发展和完善,今天的流式细胞仪已经十分成熟并不断推陈出新,广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面; 是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球,细菌,小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术; 流式细胞术技术平台涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作 用。

流式细胞术完成FCM计数的主要历程 ◆1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数; ◆1934年,Moldaven 是世界上最早通过光电仪记录细胞数量; ◆1940年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白; ◆1953年,Croslannd Taylor 应用分层鞘流原理,奠定了流式细胞术的液流技术基础; ◆1956年,Coulter 生产了Coulter细胞颗粒计数器; ◆1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形; ◆1967年, Holm 等设计了汞弧光灯激发荧光染色的细胞,再由光电设备计数的装置; ◆1973年, Steinkmp设计了利用激光激发双色荧光色素标记的细胞,达到计数和分选的 装置.

流式细胞术临床应用

流式细胞术得临床应用 一、在肿瘤学中得应用 这就是FCM在临床医学中应用最早得一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞得DNA含量进行分析,PI可以与细胞内DNA与RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到得与DNA结合得PI得荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量得多少。由于细胞周期各时相得DNA含量不同,通常正常细胞得G1 / GO 期具有二倍体细胞得DNA含量((2 N),而G2/ M期具有四倍体细胞得DNA含量((4 N),而S期得DNA含量介于二倍体与四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期,S期与G2/ M期,并可通过特殊软件计算各时相得百分率,DNA含量直接代表细胞得倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变得漫长过程,而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常得体细胞均具有比较稳定得DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能得癌前病变时,在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量得异常改变,FCM可精确定量DNA含量得改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中得一个有价值得标志,能对癌前病变得性质及发展趋势作出估价,有助于癌变得早期诊断。有资料证实,癌前病变得癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度得加重,DNA非整倍体出现率增高,这就是癌变得一个重要标志。 2、在肿瘤得诊断、预后判断与治疗中得作用 FCM在肿瘤诊断中得重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰得存在可为肿瘤诊断提供有力得依据,FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后得判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变得复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤得预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图得变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要得意义。临床医师可以根据细胞周期各时相得分布情况,依据化疗药物对细胞动力学得干扰理论,设计最佳得治疗方案,从DNA直方图直接地瞧到瘤细胞得杀伤变化,及时选用有效得药物,对瘤细胞达到最大得杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡与多药耐药基因得研究中得作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡得早期阶段,胞浆膜磷脂得不对称性丧失,导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异得Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不就是细胞凋亡特有得,也可发生在细胞坏死中。但在凋亡得早期细胞膜就是完整得,而细胞坏死时细胞膜得完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整得活细胞与早期凋亡细胞就是拒染得,而对膜完整性被破坏得晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此,Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。正常活细胞不会被染色,凋亡细胞可被标记上Annexin-V,坏死与

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用 血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而,在血小板相关疾病的诊断中,检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法本身的原因造成的[1],譬如,静脉阻滞、抗凝剂选择、离心,甚至标本处理不当等因素,都可导致医源性血小板激活,影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便,最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。 关键词:血小板临床应用流式细胞术 血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而,在血小板相关疾病的诊断中,检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法本身的原因造成的[1],譬如,静脉阻滞、抗凝剂选择、离心,甚至标本处理不当等因素,都可导致医源性血小板激活,影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便,最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。 由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断,近年来,文献报道利用流式细胞术,特别是全血法流式细胞术,检测血小板膜糖蛋白的表达[2]。该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板,并评价其功能。现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。 一、全血法流式细胞术 1.方法学:流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记,然后由压缩氮经硅管送达标本室,再以5 000~10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下,被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射,然后传入计算机进行分析。 传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达,常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。由于血小板极易活化激惹,样本经离心、洗涤等步骤,容易人为地导致体外血小板激活,影响临床诊断价值。为此,Shatti等[2]引入了全血法流式细胞术。该技术能使用全血样本测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。 全血流式细胞术样本制备步骤为: 抽血抗凝→稀释→生物素化的检测用单克隆抗体(单抗)→激动剂或缓冲液→固定(1%多聚甲醛)→FITC标记的鉴别用单抗→PE-卵白素→稀释。 稀释样本是为了防止血小板聚集,否则单个血小板上的抗原量就测不出来了,因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光,而不管这单个粒子是一个血小板还是几个血小板的聚集体。当用凝血酶作外源激动剂时,为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块,可在全血标本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)[3]。固定这一步若不干扰单抗的结合,生物素化的检测用单抗也可以在固定后加入。血小板鉴别用单抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPⅠb,GPⅡb,GP Ⅲa的单抗中任选一种。标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY53种荧光染料中任选。 样本随后用流式细胞仪检测。通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后,检测5 000~10 000个血小板表面的特异性荧光讯号。检测结果可用两种方法表示。一种是平均颗粒荧光强度,另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关,且可以检测受损伤部位血小板亚群的变化。如果检测的是血小板表面某抗原的总量,则荧光强度法更为适合。譬如,在活化状态下,血小板表面GPIb-IX-V复合物含量比静息时低,但降低的幅度小,通常还不足以报告阴性结果[4],这时用荧光强度法就比阳性血小板百分率法更合适。 目前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的绝对数目,但Shatti等[2]利用125I 和生物素双标记的单抗进行研究,以PE-卵白素作为荧光结合试剂,发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此,对于一个特定的单抗,一旦弄清这一线性关系,并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比,就能利用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的绝对数目。

流式细胞术最新发展

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球,细菌,小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台,现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善,今天的流式细胞仪已经十分成熟,并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作用。 现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术,是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展,为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求,流式细胞技术仍然在快速发展,并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。本文就流式细胞术的最新进展做一些介绍。 RealTime ready 智力大冲浪!答对5题,即获赠美国傲仕优质保温杯! 一、流式细胞检测与细胞成像的结合 使用传统的流式细胞检测技术,研究人员可以分析成千上万个细胞,获得每个细胞的散射光信号和荧光信号的数值,从而得到细胞群体的各种统计数据,并可以找到稀有的细胞亚群。但是传统流式细胞检测技术仍然存在局限,那就是获得的细胞信息很有限。细胞对研究人员来说,只是散点图上的一个点,而不是真实的细胞图像,缺乏细胞形态学、细胞结构及亚细胞水平信号分布的相关信息。要想获得细胞图像,研究人员就必须使用显微镜进行观察,但显微镜能够观察的细胞数量是非常有限的,很难提供细胞群体的量化与统计数据。因此,使用传统的细胞分析技术,我们就只能面对这样的两难选择,没有一种技术可以既提供细胞群体的统计数据,又获得细胞图像。不过,最近美国Amnis公司推出的ImageStream成像流式细胞仪,给传统细胞分析带来突破性的变革。 ImageStream是一种台式多谱段成像流式细胞仪(Multispectral Imaging Flow Cytometry),能够同时采集6个检测通道中的细胞图像(图1)。它将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一身,既能提供细胞群的统计数据,又可以获得单个细胞的图像,从而提供细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

流式细胞技术临床应用及研究

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 流式细胞技术临床应用及研究 1 流式细胞技术临床应用及研究流式细胞技术是激光为光源,集流力学技术,电子物理技术,光电测量技术,计算机技术以及细胞荧光化学技术,单克隆抗体技术为一体的新型技术仪,应用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒经行快速的,多参数的,定量分析和分选技术称为流式细胞技术(FCM)[1]。 其中生物颗粒包括大的免疫复合物,DNA,RNA,蛋白质,病毒颗粒,脂质体,细胞器,细菌,染色体,真核细胞,杂交细胞,聚集细胞等,所检测的生物颗粒理化性质包括大小,细胞形态,胞浆颗粒化程度,DNA 含量,总蛋白含量,细胞膜的完整性和酶活性学。 由于融合了单克隆抗体技术,定量细胞化学和定量荧光化学,流式细胞技术作为一门生物检测技术已经日臻完善,流式细胞或在生物学,免疫学,胞瘤学,血液学,病理性,遗传学,临床检验等学科中都得到广泛的应用,并将为医学科学研究发挥更大的作用。 1 生物分析原理将悬浮分散的单细胞悬液,经特异荧光染料染色后,放入样品管,在气体压力的作用下,悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室,沿流动室的轴心向下流动,流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动,形成包绕细胞悬液的鞘液流,鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆 2 柱流束自喷嘴的圆形孔喷出,于水平方向的激光束垂直相交,相交点成为测量区。 染色的细胞经激光照射后发出荧光,同时产生光散射。 1 / 6

流式细胞术的原理及临床应用

流式细胞术的原理及临床应用 马洪星1 张春斌2 汪晶冰1 庞玉军1 张丽岩2  (1.黑龙江省大庆油田总医院检验科,163001 2.黑龙江省佳木斯大学基础医学院生物教研室)中图分类号: R331 文献标识码:A 文章编号:1006-9534(2003)04-0145-02 流式细胞术(flow cytometry)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术,它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以同时测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域内发挥着重要作用[1]。 一、流式细胞仪检测的原理[2,3] 流式细胞仪主要包括以下几个组成部分:激光系统、流动系统、信号处理及放大的系统、计算机系统。当待测标本被制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理、就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。 二、流式细胞仪在免疫学中的应用[4] (1)淋巴细胞亚群分析:淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群。各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+)区分开来,并计算出CD4+/CD8+的比例,可通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态,指导治疗。 (2)感染及其疗效观察:由于T淋巴细胞在人体的免疫系统中承担着重要功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态和程度。当病毒感染发生时(如乙型肝炎.EB病毒和巨细胞病毒)CD8+细胞增多,对CD8+T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。 (3)流式细胞仪可以对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、、CD25+持续增加提示已开始发生排异,CD4/CD8持续下降,表明有感染发生,当其比值小于012时必须停用免疫抑制剂。 (4)免疫性疾病分析:SL E患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度,活动或非活动性伴有多系统疾病,但无肾脏损害的患者可出现CD4/CD8T比值增高,伴有严重肾脏损害的SL E患者可出现低CD4+。高CD8+的现象。 (5)利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PHA),根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)所连接的蛋白,如DFA(CD55)与MIRI(CD59),来确诊此病,比传统的血清溶血试验具有更高的特异性与敏感性。 (6)HLA群体分析:FCM运用HLA-B27特异性单克隆抗体检测抗原,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高,有助于强直性脊柱炎的辅助诊断。 (7)AIDS中的应用:用于CD4+细胞的绝对计数(CD4+阳性细胞是HIV病毒特异侵染细胞),另外还可以监测病程和治疗过程中患者的免疫状态,估计预后。 三、FCM在细胞生物学中的应用 (1)细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DAN异倍体。 (2)可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是p H值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内p H值测定。 四、FCM在肿瘤中的应用 (1)肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志。细胞的增值能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍体分析。辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面[5]。 (2)肿瘤预后估计 异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道,在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中,异倍体和/或较高的S期比率都是不良的预后标志。同样地,在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中,亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上,用流式细胞仪监测肿瘤

流式细胞仪现状与临床应用进展

流式细胞仪现状与临床应用进展 北京大学第一医院检验科 吴煦,王建中 作者吴煦,毕业于北京医科大学医学检验专业,在美国BD公司生命科学部从事流式细胞仪及其相关产品的技术应用支持工作,现在北京大学第一附属医院检验科攻读硕士学位,师从王建中教授。 摘要:本文主要介绍了流式细胞仪以及新发展的仪器检测技术和目前主要的临床应用,包括细胞免疫表型分析,红细胞和血小板分析,细胞功能分析,以及细胞DNA分析等;最后介绍了临床流式细胞分析应用的新进展和新的应用领域,以及流式细胞术应用于细胞组学提供预测医学信息的概况。 关键词:流式细胞术,流式荧光定量分析,流式微球技术,流式细胞原位杂交分析,细胞组学 Status Quo and Clinical Application Development of Flow Cytometry Clinical Laboratory, Peking University First Hospital Xu Wu, Jianzhong Wang ABSTRACT: This article introduced flow cytometry techniques, and presently major clinical applications, such as immunophenotyping, red blood cell and platelet analysis, cell function analysis, and DNA analysis. Finally, it introduced newly exploited clinical applications and new diagnostic fields of flow cytometry, and cytomics by flow cytometry to provide diagnostics information as predictive medicine. KEY WORDS: Flow cytometry, Quantitative flow cytometry, Cytometric bead array, Flow-FISH, Cytomics 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对处在液流中的细胞或其他生物微粒,以及人工合成微球逐个进行多种物理或生物学特征快速定量分析和分选的技术[1]。流式细胞仪是测量细胞的散射光和标记荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量,并分类收集的高精密仪器。流式细胞仪可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数,进行定性或定量分析,具有速度快、精度高、准确性好等特点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。如今,流式细胞仪(图1,最常用的流式细胞仪,配备双色激光器)以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点,广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,如细胞生物学、细胞遗传学、生物化学、免疫学、肿瘤学、血液学等。

流式细胞术及其应用教程

流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分,理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展,达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界,为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序,操作规程,为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27,extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称:流式细胞术及其应用教程 二、总学时数:38学时,2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象: 博士生、硕士生,专业不限

流式细胞术样品制备技术(完整)(推荐文档)

流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上,这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中,制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞,又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤:①取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存;②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色;③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析;⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上,根据各种组织成分的特点,可选择不同的分散细胞方法,以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序,但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中,解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以,在对各种不同组织进行分散选择方法时,应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 (一)酶消化法 1 作用原理: 对实体组织分散的作用原理主要有3方面:①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等;②可以水解组织间的粘多糖等物质;③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有:蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等,都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键;胶原酶能降解几种分子类型的胶原;溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键;弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用,可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项: ①酶需要溶解于适当的溶液中,而这些溶液不致于造成酶效价降低;②要注意酶的使用浓度和消化时间;③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性,胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等;④要随时注意影响酶活性的其它因素,如酶的生产批号等。 3 方法学程序 (1)将适合于酶消化的组织置于离心管中; (2)将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中; (3)一般消化20-30分钟(恒温37℃或室温),消化期间要间断振荡或吹打; (4)终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞团块,以低速成离心除去细胞碎片;

流式细胞术

流式细胞术 科技名词定义 中文名称:流式细胞术 英文名称:flow cytometry assay;flow cytometry;FCM 其他名称:荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS) 定义1:一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞,用激光束激发单行流动的细胞,根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。 应用学科:免疫学(一级学科);应用免疫(二级学科);免疫学检 测和诊断(三级学科) 定义2:一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。 应用学科:生物化学与分子生物学(一级学科);方法与技术(二级学科)定义3:用荧光剂对细胞特定成分染色,利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析,并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 应用学科:细胞生物学(一级学科);细胞生物学技术(二级学科) 流式细胞术(Flow CytoMeter,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,

并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。简介 一种在液流系统中,快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开,以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。 特点

流式细胞术的临床应用

一、诊断性指标

如图1所示,图(左)白血病细胞成为一个单一的群体,很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。但是通过CD45和(SSC)设门法之后(图右),看到图(左)无法区分细胞被分成了五群。在这五群中,成熟细胞CD45表达的荧光比较强。A门里是淋巴细胞,B门里是单核细胞,C门里就是粒细胞群,D门里是原始细胞,一般CD45表达较弱。一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞,由于不表达CD45,可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来,减少了其它细胞的干扰。对D门里的白血病细胞做进一步的分型,就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。 图1 3.白血病的特异性标志 免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志,把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。 T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8 、CD10和CD7;B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20;髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64;NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57;红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36;巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61;一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达,尤其是表达在早期的造血干组细胞上,一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。 其中,对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3,当胞浆内CD3出现阳性的时候,高度怀疑是T淋巴细胞白血病。对于B淋巴细胞白血病来讲,胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的,cCD79a最具特异性。cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。cMPO是髓系特异标志。 如图2所示为B-ALL的表达图。白血病免疫分型采用的是CD45和侧向散射光的设门方案,通过CD35和侧向散射光设门可以准确地找到一群CD45表达较弱的白血病细胞,也就是D门里的细胞。把D门的细胞再做进一步的分型,发现表达CD19、CD10和HLA-DR。这是B淋巴细胞白血病的表型分析。

流式细胞术及其应用_百替生物

流式细胞术及其应用 作者:贾宇臣 第一部分流式细胞术的一般介绍 概念 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞仪特点

FACSCalibur 临床型(台式机) 特点: 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢,主要用于细胞分析

BD LSR

FACS Vantage DiVa 科研型(大型机) 特点: 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选

FACSAria 科研型 特点: 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上(4路和24孔板)适用于高速分选和多色分析 流式细胞仪检测范围

临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞(DC)研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究(MDR)、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 流式细胞仪的工作原理 -光学系统 激光光源 光收集系统 -液流系统 流动室 液流驱动系统 -电子系统 光电转换 数据处理系统 -细胞分选系统 激光光源 单波长、高强度、高稳定性 多采用氩离子激光器或氦氖激光器

流式细胞术的工作原理及其临床应用

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术。它可测量细胞大小、内部颗粒的性状;可检测细胞表面和细胞浆抗原,细胞内DNA、RNA 含量等;可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,并能在短时间内检测分析大量细胞,以及收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度超过95%。随着各种相关技术的发展,流式细胞术已成为日益完善的分析细胞学和肿瘤标志学研究的重要工具。 1 流式细胞仪的结构及工作原理 流式细胞仪主要分为科研型(又称大型机、分析型)和临床型(又称小型机、台式机)两类,科研型的仪器功能齐全,分析灵活,但操作较繁琐,必须由经过培训的专业人员进行操作;临床型的仪器易于操作,稳定性好,分析速度快,适合在临床实验室中应用。流式细胞仪主要由 以下五部分构成:① 流动室及液流驱动系统;② 激光光源及光束形成系统;③ 光学系统;④ 信号检测与存储、显示、分析系统;⑤ 细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射(FSC)光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。 流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入充满流动的鞘液;当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时,在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱经过激光聚焦区,与入射的激光束垂直相交,经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光;仪器中一系列光学系统,如透镜、光阑、滤片和检测器等,收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号;计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测 定的各种信号,对各种指标做出统计分析[1]。 科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中 流式细胞术的工作原理及其临床应用 Working Principle and Clinical Application of Flow Cytometry [摘 要] 流式细胞术是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。随着其分析技术和方法的日臻完善,流式细胞术在医学临床及科学研究上发挥了非常重要的作用。本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍,并对其在肿瘤学、血液学及免疫学等方面的临床应用进行了综述。 [关键词] 流式细胞术;工作原理;临床应用 Abstract : Flow cytometry is a new kind of technology which can analyze single cells by qualitative analysis and quantitative analysis quickly. With the development of analyzing techniques and methods, flow cytometry has being played an important role in the clinical medicine and scientific research. This paper introduced the working principle of flow cytometry synoptically and summarized its clinical application in oncology, hematology and immunology, etc. Key words: flow cytometry; working principle; clinical application [中图分类号] R459.5;R446.11+3 [文献标志码] B doi:10.3969/j.issn.1674-1633.2011.03.033[文章编号] 1674-1633(2011)03-0091-03 吴晓娜,蒋红兵 南京医科大学附属南京第一医院 设备科,江苏 南京 210006 WU Xiao-na,JIANG Hong-bing Equipment Department,Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu 210006, China 收稿日期:2011-01-06 修回日期:2011-03-09作者邮箱:naiadsnowal@https://www.doczj.com/doc/5816637656.html, 2011年第26卷 03期 VOL.26 No.03 临床工程CLINICAL ENGINEERING 91

流式细胞术

流式细胞术的最新突破 摘要:随着现代科技的高速发展,为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求,流式细胞技术仍然在快速发展,并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。本文就流式细胞术的最新进展做一些介绍。 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球,细菌,小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台,现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善,今天的流式细胞仪已经十分成熟,并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作用。 现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术,是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展,为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求,流式细胞技术仍然在快速发展,并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。本文就流式细胞术的最新进展做一些介绍。 一、流式细胞检测与细胞成像的结合 使用传统的流式细胞检测技术,研究人员可以分析成千上万个细胞,获得每个细胞的散射光信号和荧光信号的数值,从而得到细胞群体的各种统计数据,并可以找到稀有的细胞亚群。但是传统流式细胞检测技术仍然存在局限,那就是获得的细胞信息很有限。细胞对研究人员来说,只是散点图上的一个点,而不是真实的细胞图像,缺乏细胞形态学、细胞结构及亚细胞水平信号分布的相关信息。要想获得细胞图像,研究人员就必须使用显微镜进行观察,但显微镜能够观察的细胞数量是非常有限的,很难提供细胞群体的量化与统计数据。因此,使用传统的细胞分析技术,我们就只能面对这样的两难选择,没有一种技术可以既提供细胞群体的统计数据,又获得细胞图像。不过,最近美国Amnis公司推出的ImageStream成像流式细胞仪,给传统细胞分析带来突破性的变革。 ImageStream是一种台式多谱段成像流式细胞仪(Multispectral Imaging Flow Cytometry),能够同时采集6个检测通道中的细胞图像(图1)。它将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一身,既能提供细胞群的统计数据,又可以获得单个细胞的图像,从而提供细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。

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