慢性呼吸道疾病患者肺功能进行性下降，是由于致病菌侵袭并定植于气道，引起反复感染，致使肺通气功能降低所致，而气道慢性感染性疾病患者气道最常见的病理现象就是黏液高分泌，因为分泌过多的黏液造成了正常呼吸道纤毛清除机制的破坏，随着时间的增加，最终导致肺功能受损[1]。多种刺激因素可通过蛋白激酶C诱导黏液生成，中心粒细胞弹力蛋白酶即为其中1种。根据研究红花黄色素抑制PKC 的作用强，据此，我们建立大鼠气道黏液高分泌模型，通过观察红花黄色素在其中的作用，为临床科学、合理用药提供依据。
1 材料与方法
1.1 建立模型并分组
取体质量300~350g健康雄性大鼠，放置于玻璃箱内，用中性粒细胞弹力酶（NE）加生理盐水配制成120U/mL，用8U的剂量连续4周每日1次予以雾化吸入。大鼠表现出了倦怠、食量减少等症状。之后随机把动物分为3组：①绝对对照组：未予以任何处理的健康大鼠。②阳性对照组：仅用NE刺激的健康大鼠。③治疗组：NE刺激并每天用红花黄色素3次灌胃给药用量为30mg/（kg?d），红花黄色素配制液为100mg/L。
1.2 检测支气管灌洗液中黏蛋白MUC5AC水平
使用RT-PCR测定肺组织MUC5AC mRNA表达水平各组大鼠麻醉后纵行切开颈部前侧气管，插入气管导管，用4℃Hanks液15mL灌洗3次，回收BAIF至少10mL作离心处理。取BALF上层清液0.1mL，用酶标板包被。置于5℃恒温箱12h后用Tween 20（0.05％）-PBS（0.01％moL/L）室温密封存放60min，随后加入经稀释的抗大鼠MUC气道单抗200μL，于37°C恒温下培养60min，再用配置好的辣根过氧化物酶将牛抗鼠IgG标记，置于37°C温箱培养60min，然后提取反应溶液120μL，于37℃恒温下显色20min后终止。MUC含量相对值以酶联检测仪读取的光密度值（OD）492表示。之后测定肺中MUC5AC mRNA 的含量，测定方法使用RT-PCR，具体步骤按试剂盒说明进行。
1.3 用Western blot检测PKC的蛋白含量
用裂解液在冰浴中浸泡细胞20min，4℃离心10min，上清液用10％SDS-PAGE电泳分离，移至PVDF膜，在PBS中密闭1h，加入兔抗PKC多克隆抗体，随后加入HRP标记的第二抗体，不间断摇动情况下，在室温中进行反应。经显色处理后予以积分学分析，其相对含量用所得结果与参考值的比表示。
1.4 测定PKC的活性
用离心法分离胞膜与胞浆，测定蛋白质含量，然后使用放射性同位素法检测PKC活性。胞浆与胞膜PKC活性都用所测得的活性和对照组的差值表示，PKCt是PKCc和PKCm活性的和值（胞浆PKC活性、胞膜PKC活性、PKC总活性分别用PKCc、PKCm和PKCt表示）。
1.5 统计学处理
所有的数据用（χ—±s）表示，并分析所得数据（使用SPSS12.0）。
2 结 果
2.1 各组情况总结
对照组中MUC5AC转录水平、PKC和MUC5AC蛋白含量均低于NE组，即NE提高了上述3项指标，而使用红花黄色素后，明显减少了MUC5AC蛋白的含量以及PKC蛋白、MUC5AC mRNA水平，其差异有统计学意义（表1）。
红花黄色素对大鼠气道黏液高分泌的治疗作用
黄裕卓1周向东2
（1 重庆医科大学附属第二医院奉节分院呼吸内科，重庆 404600；2 重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆 400010）
【摘要】目的 讨论红花黄色素在气道慢性炎症黏液高分泌机制中的作用。方法以注射用红花黄色素为可变因素设为治疗组，应用中性粒细胞弹力酶雾化吸入法建立大鼠气道黏液高分泌机制病理模型，注射用水设为对照组，用RT-PCR、ELISA法检测各组气道上皮黏蛋白的表达情况，以western blot和放射活性法分别测定蛋白激酶C（PKC）的蛋白水平以及PKC活性。结果红花黄色素组的黏蛋白mRNA转录和蛋白表达水平均较对照组明显降低，治疗组组织中蛋白激酶C（PKC）蛋白水平及活性也有明显下降。结论红花黄色素可通过抑制PKC活性而抑制大鼠气道黏液高分泌。
【关键词】黏蛋白；红花黄色素；蛋白激酶C
中图分类号：R56 文献标识码：B 文章编号：1671-8194（2013）35-0333-02
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ｏｎ Ｍｕｃｉｎ ＭＵＣ５ＡＣ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ
HUANG Yu-zhuo1, ZHOU Xiang-dong2
(1 Department of Respiratory Medicine, Fengjie Branch of Second Hospital Affiliated to Chongqing Medical University, Chongqing 404600, China;
2 Department of Respiratory Medicine, Second Hospital Affiliated to Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China) [Abstract]Objective?To investigate the efects of Chinese traditional medicine safflower yellow on mucin MUC5AC expression in mucous hyperseretion rats. Methods Used a rat model of neutrophil elastase (NE)-induced airway inflammation, experiment group was treated with safflower yellow solution, and isotonic Na chloride was used in control group. MUC5AC mRNA and protein were detected by RT-PCR and ELISA, respectively. Protein kinase C(PKC)protein expression was assayed by western blot, activity of PKC was detected by radiation method. Results NE increased mucin expression and PKC activity in rats(P<0.01), compared with normal control group. When treated with safflower yellow, MUC5AC mRNA expression, MUC5AC protein production and PKC activity were decreased obviously(P<0.05), compared with NE stimulated group. Conclusion Safflower yellow can reduce mucous hypersecretion in rats airway epithelial through inhibition of PKC.
[Key?words]?Mucin; Safflower yellow; Protein kinase C
（下转335页）
于阻滞区内的血管也有麻醉作用，使得血管的代偿性收缩消失，也就造成血液中的热量得不到代偿性的保留，并且在手术过程中，由于大量液体的输入，也会造成患者体温下降，这一切因素均会造成患者麻醉后出现寒战。而患者在手术过程中一旦出现寒战，尤其是严重寒战，不仅仅会阻碍手术的正常进行，并且肌肉的不自主颤动会使组织耗氧增加，导致心律加快，不利于患者的手术进程与预后。研究表明麻醉后寒战发生原因可能与以下几点有关：①外界环境温度低：在寒战时体温变化与外界环境温度的高低关系仍不清楚，但临床中发现，外界环境温度<10℃寒战发生率明显增高，这可能是外界环境温度低直接刺激皮肤而诱发寒战发生。室温过低或输入大量冷血或冷液体或者是手术操作中为冲洗体腔倾入大量冷盐水，使体温下降而出现冷反应。②血压下降：麻醉后患者血压下降，局部供血减少血循环减慢，局部温度下降和酸性代谢产物增多，反射性引起肌肉收缩，产热即寒战出现，这一点临床试验工作中也得到证实，低血压时寒战发生率高于血压正常时的寒战发生率。③所用液体温度低：有报道，当输液液体温度、消毒液体温度、局麻药液体温度<10℃时，麻醉后发生寒战率高于温度>30℃时的寒战发生率，机制可能是药物直接刺激血管收缩，血循环减慢，另外大量低温液体进入体内造成体温的下降，从而引起寒战发生。④术前用药：术前给安定类药物的寒战发生率明显小于术前给抗碱类药物的寒战发生率，这可能是安定类有镇静作用。⑤药物蓄积作用：局麻药用量过大或反复多次应用导致药物蓄积出现早期的中毒反应[2-3]。
本文针对麻醉后寒战对患者造成的不良后果，我院对120例手术患者进行研究，分别采用生理盐水，芬太尼与度冷丁麻醉后静脉注射的方法对患者进行预防麻醉后寒战的发生[4-5]。研究表明：芬太尼与度冷丁对于麻醉后寒战的发生均能起到预防作用，但是芬太尼的效果明显比度冷丁要好。且三组的心率、血氧饱和度和体温的变化差异不大，P>0.05。
综上所述，麻醉后寒战的发生于多方面因素有关，麻醉后静脉注射芬太尼与度冷丁，配合有效的人性化护理，可以有效预防麻醉后寒战的发生。
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表2 三组心率、血氧饱和度和体温的变化比较
组别例数HR(bpm)SaO2(%)RR(次/min) A4085±998±0.518±0.5 B4087±999±0.717±0.5 C4087±697±0.518±0.5
表1 红花黄色素对MUC5ACmRNA、MUC5AC、PKC蛋白的干
预（χ—±s，n=12）
分组PKC蛋白MUC5AC MUC5ACmRNA
对照组0.34±0.030.26±0.050.27±0.10
NE组0.74±0.12#0.83±0.06#0.80±0.09# NE+红花黄色素组0.46±0.05*0.49±0.04*0.48±0.04*注：与对照组相比，#P<0.01；与单纯NE刺激组相比，*P<0.05 2.2 予以红花黄色素后各组PKC活性的变化情况
与对照组相比，NE组的PKC活性都有不同程度的升高，且所测得的P值＜0.01，故而其差别存在统计学意义；而各组PKC活性都在予以红花黄色素干预后有显著性降低（P<0.05）（表2）。
表2 红花黄色素对每组PKC活性产生的变化（χ—±s，n=12）组别PKCt PKCc PKCm
对照组8.39±0.81 6.89±0.96 1.51±0.44
NE组51.61±5.19#35.87±7.31#15.61±4.81# NE+红花黄色素组23.96±3.12*12.42±1.68*11.54±0.89*注：与对照组相比，#P<0.01；与单纯NE刺激组相比，*，P<0.05.（活性单位均为pmol/min?mg.）
3 讨 论
气道上皮细胞和粘膜下纤体分泌的黏蛋白决定了气道黏液的弹性，呼吸道中最重要的黏蛋白表型为MUC5B、MUC5AC、MUC2三种，多项研究已表明呼吸道上皮MU5AC蛋白量以及转录的水平都代表了气道黏液的分泌强度[2，3]。多种刺激因素均可导致MUC5AC生成增多[4]。故通过抑制PKC活性能够有效减少黏蛋白生成，从而缓解呼吸道黏液高分泌，延缓肺功能下降，改善慢性气道炎症性疾病的预后。
红花黄色素是从菊科植物红花的花瓣为原料，利用现代的生物技术提取而成的天然色素，其中含有的还原性酚羟基可以抑制PKC 活性。本研究中，使用NE诱导使其PKC蛋白含量增加且活性增强，并增加大鼠黏蛋白的生成。用红花黄色素溶液治疗后，大鼠肺中的MUC5AC转录水平以及蛋白含量均有明显降低，且伴有PKC蛋白含量减少和活性降低。从而证明了红花黄色素对PK激酶有抑制作用，且表现出了抑制黏蛋白合成的能力[5]。目前临床上红花黄色素主要用于冠状动脉粥样硬化性心脏病等的治疗，而且作为PKC抑制剂，红花黄色素有望成为气道黏液高分泌疾病治疗的理想药物。
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红花黄色素对大鼠气道黏液高分泌的治疗作用
作者：黄裕卓， 周向东， HUANG Yu-zhuo， ZHOU Xiang-dong
作者单位：黄裕卓,HUANG Yu-zhuo(重庆医科大学附属第二医院奉节分院呼吸内科,重庆,404600)， 周向东,ZHOU Xiang-dong(重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010)
刊名：
中国医药指南
英文刊名：Guide of China Medicine
年，卷(期)：2013(35)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/5817027017.html,/Periodical_zgyyzn201335259.aspx