三种结核分枝杆菌抗原的抗体联合检测在临 床中的应用 作者：崔晓利，姚小红，刘春梅，张增贤 【摘要】目的：通过结核菌三种抗原脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16KDa、38KDa固相于同一膜片上制作的结核蛋白芯片系统联合检测结核患者血清中的相应抗体，以达到快速诊断结核病的目的。方法：收集西安市结核病胸部肿瘤医院痰涂片或者结核菌培养阳性患者的血清98例，痰涂片或者结核菌培养阴性患者的血清54例，结核性脑炎、结核性胸膜炎患者血清20例，通过结核蛋白芯片系统检测三种抗体，任意一种抗体阳性即为结核抗体阳性。结果：活动性肺结核阳性率86.7%(85/98)，痰涂片阴性的肺结核阳性率66.7%(36/54)，结核性脑炎、结核性胸膜炎阳性率45%(9/20)。结论：三种抗原联合使用具有良好的敏感性与特异性，明显优于任何一种抗原单独使用，联合使用将会对结核病的快速辅助诊断起积极作用。 【关键词】结核分枝杆菌；联合检测；抗原；芯片 结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾患，特别是我们国家患者数约450万，每年病死近20万人。结核病的病原体为结核杆菌，它除了能引起呼吸道感染外，还可引起其他部位的病变，因此，结核病的早期快速诊断对结核病的防治具有极其重要的意义。我们使用基因工程表达的结核菌蛋白16KDa和38KDa以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)三种抗原制作的结核蛋白芯片联合检测结核抗体，在临床上取得较理想的快速诊断效果。
1 材料与方法 1.1 血清标本来源 结核患者的血清均来源于西安市结核病医院的住院患者，其中痰直涂或者培养阳性患者98例，痰涂片阴性患者54例，结核性脑炎或者结核性胸膜炎的患者20例。 1.2 结核菌多抗原的IgG抗体芯片检测系统由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供。批准文号：国药准字S。 1.3 蛋白芯片阅读仪 南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X4。 1.4 芯片系统操作步骤 在芯片上标记样品编号；在芯片盒窗口内滴加4滴试剂A，使膜表面完全浸湿；待完全渗入后，加入待检血清100ue；待血清完全渗入后，再滴加6滴试剂B；待试剂B完全渗入后，滴加10滴试剂C；待试剂C完全渗入后，最后滴加6滴试剂D；反应完毕后30 min 内，将芯片放入芯片阅读系统进行分析。阴阳性结果根据南京大渊生物技术工程有限公司生产的芯片识别仪器设置参数自动判别。 2 结果 三种抗原的抗体联合测定，任何一种阳性即为结核抗体阳性。痰涂片阳性或者培养阳性的结核患者98例，其中结核抗体阳性85例，阳性率86.7%。痰涂片阴性的肺结核患者54例，其中36例结核抗体阳性，阳性率66.7%。结核性脑炎、结核性胸膜炎患者20例，其中结
鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的 应用前景 Williams等（1962）发现用某种抗原免疫产蛋母鸡，鸡血清中可产生相应抗体，产蛋母鸡又能以产蛋方式将血清免疫球蛋白有效地转移到卵黄中（ROse 和Orlans，1981）。鸡血液中能转移到卵黄中的免疫球蛋白只有免疫球蛋白G （IgG），至今尚未发现卵黄中存在免疫球蛋白A和M（IgA和IgM）（胡清林等，1997）。因此卵黄中的IgG又称为卵黄抗体或卵黄免疫球蛋白（简称1GG ）(Leslie和Clem，1969）。 与哺乳动物的Igh相比，鸡蛋的lgY具有取材方便、提取方法比较简单、产量高等优点。IgY的稳定性较好，可作为口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗动物早期的消化道疾病。用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。本文简介一下IgY的分子结构、功能。特点及分离提纯方法，着重介 绍IgY在畜禽生产中的应用前景。 1 IgY的分子结构与功能 正常鸡的IgY分子量约为180KD，由两条重链和两条轻链组成，分子量分别为67000和2200。IgY的等电点接近5．2.尽管IgY同免疫球蛋白E（IgE）和LgY 有相似的结构特征，但从抗体产生特性及数量来看，IgY与哺乳动物IgG更相似。IgY的基本功能是与特异性抗原结合而发生免疫反应，增强机体的免疫力。 IgY通过口服方式，可用于预防和治疗哺乳动物早期的消化道疾病。 2 IgY的特点 2．l免疫的产蛋母鸡是高效率、高质量的IgY"生产厂"经用特定抗原免疫的
产蛋母鸡，对抗原可产生持久性应答。抗体在卵黄中出现的时间比在血清中约晚一周，一般在母鸡被免疫后15d左右出现，效价可维持数月至一年以上。Hatta 等（1993）报道，经轮状病毒（HRV）免疫成功的母鸡，其所产蛋中的抗HRVIgY 效价可维持一年以上。卵黄中IgY的含量超过哺乳动物血清抗体含量。 每个卵黄中lgY含量可达100～250mg（teslie和CIem，1969）。从一只兔子一个月可提取lgG约200mg，而-只母鸡一个月可提取lgY2000～2800mg（Schade 等，2001）。因此IgY生产效率是哺乳动物lgG的10倍。 2．2 IgY具有良好的稳定性，耐热、耐酸、耐碱较好Shimizu等（1988，1992，1993）研究lgY和哺乳类IgG（牛、山羊、兔）的热稳定性，结果表明IgY与哺乳类（除兔以外则外有着大致相同的热稳定性。发现热（＞75℃）或酸（pH＜3．0）能够降低IgY的抗体活性，温度65℃时IgY活性可保持24h以上，但70℃处理90min 后活性明显下降。Lasson等（1993）将IgY制剂在4℃贮存5年或在室温下放置6个月，经免疫扩散法检测，IgY抗体性仍无明显下降。 IgY对PH值和蛋白水解酶有较好的稳定性。IgY在pH 4．0～11．0时比较稳定，pH值为3．0～3．5时活性迅速下降，pH为12．0时活性也降低。Yolken等（1988）报道，IgY能够抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。Hatta等（1993）检测了3种主要消化道酶对抗HRVIgY的影响。将胃蛋白酶和IgY在pH2．0温育l h后，几乎所有IgY丧失；而在pH 4．0温育lh后保持91％的活性，甚至温育10 h后仍有63％的活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶温育8h，活性分别保持39％和41％，这说明IgY对这两种酶的消化在一定时间内有抵抗作用。由于幼畜胃内酸度不会太高，IgY在
卵黄抗体 科技名词定义 中文名称：卵黄抗体 英文名称：vitelline antibody 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 所属学科：免疫学（一级学科）；畜牧免疫（二级学科） 概述 卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。 IgY的性质 IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。IgY 与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。IgY 在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。IgY 对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h 后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。 IgY的作用机理 特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。 IgY在动物疾病防治方面的应用
高免卵黄抗体应用研究现状及发展趋势 李文学,青学刚,刘刚 (四川省农业科学院蚕业研究所,四川南充637000) 摘要 介绍了近年来卵黄抗体在家禽、家畜、水产、蚕桑等养殖业方面的应用研究进展,提出了卵黄抗体在动物疫病防控方面的可行性和发展方向。关键词 卵黄抗体;免疫;应用研究 中图分类号 S852.4+ 3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)24-12981-02Advances i n Applica tion Studies and D evelopm en t Trend of H igh T iter Egg 2yolk I mm unoglobuli n s L IW en 2xue et a l (Sericultural Research I nstitute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Nanchong,Sichuan 637000) Abstract The advances in app lication studies of egg 2yolk i mmunoglobulins in the field of poultry,ivest ock,aquatic and silkwor m were intro 2duced.A t the same ti m e,the feasibility of using egg 2yolk i m munoglobulins in the field of ani mal disease p reventi on was put f or ward,and the de 2velopment trend of the egg 2yolk i m munoglobulins in silkwor m was p rospected .Key words Egg 2yolk i m munoglobulin;I mmunology;App licati on study 基金项目 四川省财政育种工程2009年度青年基金项目(2009QNJJ 2 028)。 作者简介 李文学(1981-),男,四川成都人,硕士,助理研究员,从事 蚕桑生物技术研究。 收稿日期 2010205204 家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,目前不仅在遗传学、生理病理学等基础理论研究方面对其有深入的研究,而且作为一种重要的经济类绢丝昆虫、吐丝结茧,为人们提供了环保、舒适的丝绸面料。然而在广大农村,各种病虫害严重危害了家蚕的健康,蚕病引起的经济损失相当严重。在现阶段,蚕病防治仍采取“预防为主、综合防治”的基本方针,对病毒(核型多角体病毒、质型多角体病毒、浓核病毒等)、细菌、真菌等病原微生物引起的病害缺乏针对性以及强效性药物治疗。作为种养产业的家禽、家畜、水产业,在由病原微生物引起的重大传染病预防、防治方面却成功取得了实质性的药物治疗成绩,如卵黄抗体(Egg Y olk I m munogl obulins,I gY )是当今生物科学研究中的重大发现之一 [1] 。自1893年Kle m 2 perer 首次报道鸡蛋中存在抗体以来,人们便对I gY 进行不断 深入地研究,作为被动免疫方式使用的I gY,在家禽、家畜、水产等养殖业的重大传染病控制和治疗方面均取得了成功,发挥了重要作用。家蚕不同于高等动物的免疫体系,有其独特的免疫系统和免疫机制。家蚕无T 和B 淋巴细胞,无免疫球蛋白及完整的补体系统,缺乏特异的抗原-抗体反应。在家蚕病害防治方面,通过被动免疫方式,添食或注射高免I gY 研究能否取得成功值得探索。 1 I g Y 的特性与作用机理 运用I gY 对发育成熟的母鸡进行免疫学注射试验,15d 左右即可产生特异性卵黄免疫球蛋白,且较快达到效价最高值,产生的免疫应答效价可维持数月或1年。鸡的I gY 类似于哺乳动物的免疫球蛋白G ,分子量约180k D 。I gY 含氮量为14.8%,其氨基酸组成、含糖量与人和兔的免疫球蛋白存在显著差异。I gY 在常温下可保持6个月左右的活性,性能比较稳定;在4℃条件下可保存6～7年,活性下降不超过 5%。I gY 可耐热、耐酸碱,在pH 值4.0～11.0时稳定,在pH 值低于3.0和高于12.0时,其活性迅速降低;在65℃高温时,I gY 的活性亦可保持24h 以上,70℃加热90m in 后,其 活性迅速下降。而且,I gY 溶液在39.2×107 Pa 时仍保持活性,这表明I gY 有较强的抗高压能力。此外,I gY 可抵御来自幼龄动物的胃酸屏障以及肠道环境中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等的消化降解作用。 I gY 是动物机体内免疫应答系统所产生的特异性抗体, 它能抵御相应的病原微生物,保护生物机体健康安全,通过以下几方面机理发挥作用 [2] :①特异性I gY 蛋白能直接粘附 于其病原菌的细胞壁上,改变病原菌细胞的完整性,直接抑制病原菌的生长。②I gY 蛋白可粘附于细菌菌毛上,使病原菌不能粘附于肠道粘膜上。而诸如大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物首先需要粘附于动物肠道粘膜细胞上,才能进行增殖病原、毒素产生及感染动物的过程。③一部分特异性I gY 蛋白在动物肠道内环境被消化酶消化降解为小结合片段 (B inding frag ment ),这些片段含有抗体的末端高度可变的小 肽,即Fab 部分。这些小肽先是很容易地被肠道所吸收,进入血液后与特定病原菌的粘附因子结合,使得该病原菌不能粘附于动物体内的易感细胞,而失去病原菌致病性,从而对非肠道病原菌起到抑菌效果。同时,这些Fab 部分还能与被感染动物机体内血液中的球蛋白末端相结合,使机体免被破坏,而特异性I gY 蛋白的稳定区或Fc 部分则被留在肠道内。 2 I g Y 的应用 2.1 I g Y 在禽病防治中的应用 目前国内应用较广泛的I gY 有:抗鸡脑脊髓炎病、抗鸡病毒性关节炎、抗鸡传染性喉 气管炎高免I gY 、抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸡减蛋综合征I gY 、抗鸭疫里氏杆菌病、抗鸭病毒性肝炎、抗番鸭细小病毒、抗小鹅瘟等I gY 。I gY 还应用于一些疑似病、新病的预防、治疗研究中。 范玉芳等[3] 选择临床无白痢的鸡场,用从11个发病鸡场收集分离的法氏囊病强毒制备的灭活苗,采用皮下注射接种方式,剂量为2.5m l/只,每10d 注射接种1次,直至抗体效价达1∶128以上时,收集制备卵黄液,经无菌及安全检测合格后供试验备用。结果表明,注射鸡体12h 后开始有抗体产生,体内可维持5～7d,至第8天时抗体全部转阴。对缺乏母源抗体的雏鸡,应用该抗体进行早期预防,可提高被动免疫水平。早期仅使用0.5ml/只即可起到紧急预防作用,治愈有效率高达91%以上,这与王泽霖等[4] 的研究结果吻合。
抗结核分枝杆菌感染的免疫机制 学生：何燕华学号：20111061 一、结核病及结核分枝杆菌 １、结核病简介 趣味背景：林黛玉的不足之症是什么病症呢？ 不足之症是中医的病症名，即民间常说的先天不足，泛指各种虚证。虚证是指人的正气虚弱不足，又分气虚、血虚，气虚可发展为阳虚，血虚可发展为阴虚，有些病人可气血皆虚或阴阳皆虚。气虚主要表现为少气、懒言、心悸、自汗、头晕、耳鸣、小便清而频、脉虚弱等。血虚主要表现为面色苍白、唇舌色淡、头晕目眩、心悸怔忡，疲倦乏力或手足麻木，脉细弱等。 根据小说的描写，林黛玉患的应是一种慢性病。她“从会饮食时便吃药，到今日未断，请了多少名医修方配药，皆不见效。”“每岁至春分秋分之后，必犯旧疾”，并且病症主要表现是咳嗽、咳痰、数量不等的咯血，“又咳嗽数声，吐出好些血来”。王大夫分析她的病症时说“这病时常应得头晕，减饮食，多梦，每到五更，必醒个几次。即日间听见不干自己的事，也必要动气，且多疑多惧。不知者疑为性情乖诞，其实因肝阴亏损，心气衰耗，都是这个病在那里作怪。”从她所患之病的症状及疾病演变和进展分析，林黛玉患的是肺结核病。 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病又称为痨病和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，结核病又卷土重来，发病率愈演愈烈。 据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)统计，全世界约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年约有880万新发病例，200万人因结核病而死亡，每15s就会有一个死亡病例。并且,随着社会人员流动，HIV感染者增多造成的交叉感染使我国的结核病感染率一直处于上升趋势,已经成为造成全球人类死亡的主要传染病类型。了解宿主的免疫系统及机体相关细胞与病原菌的相互作用机制非常重要,并且能对结核病的预防和治疗提供一定的帮助。 2、结核分枝杆菌 结核分枝杆菌( mycobacteriumtuberculosis,MTB)是一种抗酸阳性棒状杆菌，主要包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中对人致病的主要是人型结核菌。结核菌细长略弯曲，大小约1～4X0.4μm，无鞭毛、无芽孢、不能产生内、外毒素，专性需氧，培养要求高，生长缓慢，菌体成分主要有脂质、多糖、蛋白质等。 大量研究表明结核杆菌属于兼性寄生菌，原因是首先在感染的巨噬细胞内复制，故称为胞内菌；然后，随着病变发展又会出现在坏死组织中即巨噬细胞外进行复制结核杆菌的致病性与其在组织细胞内大量繁殖引起的炎症反应，菌体和细胞壁成分以及代谢物质的毒性和机体产生抗结核免疫反应等有关。 在结核杆菌胞壁中含有许多特殊脂类物质这种特殊的胞壁赋予结核杆菌能在宿主吞噬细胞内生存的能力，也为特异性T淋巴细胞提供了独特的糖脂抗原；而且从其基因组序列可以看出结核杆菌具有潜在的由一种代谢途径转变为其他代谢途径的能力，包括有氧呼吸（如氧化磷酸化）和厌氧呼吸（如硝酸还原反应）。这一代谢途径转换的灵活性对结核杆菌适应生存环境的变化有极大的意义，主要表现为结核杆菌既可以在人高氧压力的肺泡中生存繁殖，还可以在结核肉芽肿的微氧和厌氧的环境中存活。 二、结核分枝杆菌在细胞内的免疫机制 1．非特异性免疫机制
精制与粗制卵黄抗体的优劣势分析随着养殖业的发展，疾病种类越来越多，某些病原体的变异也越来越快，疾病互传的可能性也越来越大，迫切需要有相应的快速有效的对策来控制疾病的发展，降低死亡，减小损失。毋庸置疑，外源性的特异性抗体是治疗某些特定传染病的最直接最快速最有效的方法。卵黄抗体作为一种价廉易得的外源性特异性抗体，其使用效果已经在临床兽医学上得到了验证和认同。但在畜牧生产实践中，越来越多的人却对卵黄抗体的使用效果产生了怀疑，到底出现了什么问题？ 本文试从精制和粗制卵黄抗体的优劣势分析来探讨这一问题的根源。 鸡、鸭、鹅等禽类的蛋在营养成分上大致相同，主要由蛋黄、蛋清（即蛋白）和蛋壳构成。其中蛋黄约占32%，蛋清约占57%，其余11%为蛋壳。其中蛋黄又由如下图所示的成分所构成： 抗体(免疫球蛋白，Ig)是机体受到外来抗原物质刺激后，机体免疫系统细胞产生的可以特异性地识别和结合外来抗原并使之失活的一类球蛋白。家禽经特定抗原免疫后，可产生相应的特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积，并储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)，它是卵黄中唯一的免疫球蛋白，具有特异性和针对性，无毒副作用。下图为抗体结构：
从图中可以看出，在治疗疾病使用卵黄抗体时，起到关键作用的是卵黄中的免疫球蛋白（IgY)，IgY的作用非常广泛，其中最主要的作用有以下几种： 特定的卵黄抗体能黏附于特定病毒的衣壳上，直接抑制病毒的生长繁殖（抑制作用）； 黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于粘膜上皮细胞，失去感染能力（阻滞作用）； 能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用）； 中和细菌、霉菌等毒素的毒性（中和毒素）； 与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。 但大量调查发现，目前市面上可见的家禽用粗制卵黄抗体几乎都是地下作坊生产的“三无”产品，生产环境及产品质量令人堪忧。这些粗制抗体不仅抗体效价难以保证，而且通常会污染禽呼肠孤病毒、禽淋巴白血病病毒、网状内皮增生因子、大肠杆菌、沙门氏菌、支原体等外源性致病原。在注射抗体预防或者治疗疾病时，极有可能造成垂直传播病原或其他一些细菌、病毒的扩散甚至疾病的爆发，带来严重的经济损失。 此外，由于粗抗生产者往往试图通过添加大剂量的甲醛，青、链霉素等措施来延长其产品的保质期，增加所谓的使用安全性，但结果往往是造成更大的应激和严重的药物残留。这就是粗制抗体的购买者和使用者对粗制抗体的使用效果产生疑问的重要原因之一。 精制就是将蛋黄中的免疫球蛋白进行分离纯化的过程。已知蛋黄是由水溶相（Water soluble fraction, WSF）和水不溶相（Water insoluble fraction, WIF）构成的乳浊液。WIF主要为脂蛋白构成，而蛋黄抗体存在于蛋黄的WSF中。WSF中的脂蛋白类含量甚微，
3.结核分枝杆菌感染 3-1,痰结核菌检查阳性 肺阴菌结核的诊断：3次痰涂片及一次培养阴性的肺结核 患者连续三周以上的咳嗽，咳痰，若同时痰中带有血丝，就因想到肺结核病。 包括疑似病例，确诊病例，肺阴菌结核的诊断。 （1）典型肺结核临床症状和胸部X线表现； （2）抗结核治疗有效； （3）临床可排除其他非结核性肺部疾患； （4）PPD(5IU)强阳性，血清抗结核抗体阳性； （5）痰结核菌PCR+探针检查阳性； （6）肺外组织病理证实结核病变； （7）BALF检出抗酸分枝杆菌； （8）支气管或肺部组织病理证实结核病变。（不用写进PPT） 3-2 (1)全身症状表现为午后低热、乏力、食欲减退、消瘦、盗汗等。若肺部病灶进展播散，常呈不规则高热。妇女可有月经失调或闭经。 (2)呼吸系统症状 咳嗽咳痰：通常为干咳或带少量粘液痰，继发感染时，痰呈粘液脓性。 咳血：约1/3患者不同程度咯血，中等程度咯血，多为小血管损伤或空洞血管瘤破裂。咯血后常有低热。大咯血时可发生失血性休克;偶因血块阻塞大气道引起窒息。此时患者极度烦躁、心情紧张、挣扎坐起、胸闷气促、发绀，应立即进行抢救。 气急：慢性重症肺结核时，呼吸功能减退，常出现渐进性呼吸困难，甚至缺氧发绀。若并发气胸或大量胸腔积液，其呼吸困难症状尤为严重。 胸痛：固定性针刺胸痛，随呼吸和咳嗽加重，侧卧位症状减轻，常是胸膜受累缘故；当炎症波及壁层胸膜，可有不剧烈的胸壁刺痛。可放射至肩部或上腹部。 3-3肺结核的特征性病理改变包括肉芽肿和结核结节，病变包括渗出性病变出现浆液性和纤维素性炎症，形成病灶，导致咳嗽咳痰；增生性病灶形成肉芽肿，可发生毛细血管破裂，出现不同程度的咯血症状；当机体出现坏死性病变时，结核
自古以来，人们一直把鸡蛋看成是滋补身体的营养品，有谁想到鸡蛋还能制成药用于治疗疾病呢! 自从上世纪70年代末期以后，免疫学家就已经开始将一些抗原物质注射到鸡的体内(这就是所谓的免疫)，然后再从免疫母鸡所生的蛋中提取抗体，并用于诊断和治疗疾病的研究，结果出人意料，优点之多超过传统用动物(如马、羊等)血清抗体所制备的诊断和治疗制品。 IgY的诞生 人类生活在自然界中，时时刻刻都受到周围环境中种种病菌的感染和威胁。由于病菌的侵袭，刺激人体产生抗体，这就是人体免疫力的主要部分。人体的免疫抗体共有五种成分，最重要的一种成分称为IgG，它有抵御和杀灭病菌的作用。鸡与人相似，在自然界中受到病菌的侵袭后，同样能产生抗体，但独特的是，在鸡蛋黄中仅有一种抗体成分——IgG。由于鸡蛋黄的英文名称为YOLK，为了与其它动物血液中的IgG相区别，特取第一个字母Y为代表，将鸡蛋黄中的抗体IgG称为IgY。 鸡蛋黄中的IgY是怎样产生的 由上面的介绍可以知道，鸡蛋中的特异性IgY不是天然生成的，而是受到病菌侵袭后产生的。因此，为了大量提取IgY，免疫学家们应用医学免疫学技术，将一些外源物质(抗原)，例如细菌、病毒以及生物的细胞等注射入鸡的体内，鸡的免疫系统中的B淋巴细胞，受到抗原物质的刺激后便转化为浆细胞，再由这些浆细胞产生能与抗原发生特异性结合的抗体。在免疫鸡的血液中有IgM、IgG、IgA等五种成分，但是IgM和IgA等抗体的分子较大，不能渗透过鸡卵黄囊(蛋清和蛋黄之间的一层组织)，当输卵管内卵黄成熟期时，血液中的IgG被选择性地转输至鸡蛋黄中，因此鸡蛋黄中仅有IgY(即血液中的IgG)一种抗体成分，经提取分离便可得到纯正的IgY抗体。 小小的鸡蛋如何能制备成大量的药 也许有人会问，鸡蛋这么小，从中间能提取多少IgY啊，如何投入批量生产呢？ 鸡经过人工免疫后，体内产生的抗体IgY逐渐通过卵黄囊集中到蛋黄中，它的含量大大超过鸡血清中的IgG。研究表明，62个免疫鸡蛋即可提取出130毫克IgY，由于它的效价(一种免疫学计量单位，代表有效物质的浓度)高，可以大量稀释成有效浓度，这样就可以进行大规模的商品化生产了。 IgY有哪些用途 IgY有许多优点，在免疫治疗方面，鸡产生的抗体耐酸，性能稳定，可用于口服预防人类肠道传染病，如轮状病毒性胃肠炎。IgY耐热，像鲜牛奶一样，经巴氏消毒(亦称低温消毒法，即把样品置于62～65摄氏度，持续20～30分钟)后活性依然存在。而且，应用各种病原微生物或其它病原体免疫鸡产生的IgY，对人体是无毒性物质。以上种种，使IgY 经口服途径给药治疗和预防疾病成为可能。最近我国一些药业厂家同国外公司合作，利用这种技术从鸡蛋黄中提取的一种新药，其有效成分就是特异性IgY，这种现代高新技术的产品，对引起急慢性咽喉炎、扁桃体炎的致病菌有特异性杀伤作用。这就是鸡蛋黄IgY实际应用的一个典型例子。相信在不久的将来，它将会为预防和治疗开创一条新途径。
鸡IBD和ND高免蛋卵黄抗体的测定 田 冰 (郑州牧业工程高等专科学校,郑州450008) 鸡传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)是养鸡业两大烈性传染病。特别是IBD,自1989年以来在我国各地呈持续性暴发流行,给养鸡业造成巨大损失,而利用高滴度的卵黄抗体对易感鸡进行被动免疫或对发病鸡进行特异性治疗,是防制本病的重要措施。为提高IBD、ND的母源抗体水平,掌握卵黄抗体消长规律,并为保护雏鸡和制备双价高免卵黄抗体提供数据,进行了此项试验。 1 材料和方法 1.1 实验鸡 成年商品罗斯蛋鸡200只,曾按常规进行MD、ND免疫。ND血凝抑制(HI)抗体滴度为7log2,IBD琼扩抗体阴性。 1.2 疫苗 IBD弱毒疫苗分别为吉林生物制药厂和郑州生物制药厂生产。IBD-ND油乳剂灭活二联疫苗由河南省农科院畜牧兽医研究所提供。 1.3 免疫方法 首次免疫用IBD弱毒疫苗4羽份饮水,同时用IBD-ND灭活二联疫苗皮下注射1ml。首免后1周进行二免,即用IBD弱毒疫苗10羽份饮水,同时用灭活二联疫苗皮下注射1.5ml。 1.4 抗体测定 首次免疫前和免疫后1,2,3,4,5周及2个月、4个月分别收集试验鸡所产的蛋,测定其IBD 和ND卵黄抗体。IBD卵黄抗体的测定用琼扩法,琼脂板采用含有8%氯化钠的磷酸盐缓冲液100ml加入1g优质琼脂粉煮沸溶制而成的,卵黄用生理盐水倍比稀释,操作和判定按常规方法进行。ND卵黄抗体的测定用β-微量血凝抑制(HI)试验。IBD抗原和阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供,ND浓缩抗原及阳性血清由河南农业大学传染病组提供。每次试验随机抽取鸡蛋12枚。 2 结果 2.1 IBD抗体测定结果 免疫前所有实验鸡的卵黄IBD琼扩抗体均为阴性。首免后1周个别鸡(2/12)出现低滴度抗体(1∶2)。首免后2周除4只鸡蛋仍无可测性卵黄抗体外,其余8只均已出现卵黄琼扩抗体,且已达1∶128以上。首免后4～5周卵黄抗体达最高峰,半数以上的卵黄抗体滴度在1∶512以上,并维持2个月以上。免疫后4个月仍维持在1∶256～512。 2.2 新城疫HI抗体测定结果 免疫前鸡群的新城疫卵黄HI抗体滴度在7 log2左右。油乳剂灭活二联苗免疫后1周,抗体水平无明显变化,免疫后2周HI抗体明显上升(9 log2),免疫后3周达11log2以上,并维持2个月。免疫后4个月略有下降,但仍维持在10log2左右。 3 小结和讨论 产蛋鸡IBD弱毒疫苗饮水同时用油乳剂灭活苗免疫后1 周,几乎没有可测性IBD卵黄琼扩抗 体出现。再次免疫后(首免后2周)有66.6%的鸡 出现1∶16以下的卵黄琼扩抗体。免疫后3周均 达1∶128以上,免疫后4个月仍维持在1∶256以 上。因此,为了获得高滴度的IBD卵黄抗体应对 产蛋鸡同时用IBD弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗分 别进行两次免疫,间隔1周。同时,根据卵黄抗体 消长规律,最好在免疫后4周,至少也要到免疫后 3周再开始收集鸡蛋,这样才能保证用于孵化或 制备高免卵黄抗体的鸡蛋含有足够高的抗体。 经过新城疫Ⅱ系和Ⅰ系疫苗免疫过的成年产 蛋鸡,再用IBD-ND油乳剂二联苗免疫后,1周 内ND的HI抗体滴度无明显变化;免疫后2周 (二免后1周)则明显上升,由免疫前的7log2上 升至9log2;免疫后3周上升至11log2,并维持2 个月以上;至4个月时仍维持在10log2左右。这 种具有高抗体的种蛋所孵出的雏鸡,其新城疫的 首免时间应适当推迟为宜。 另外,由于条件所限,本项试验未能对高免鸡 所产的蛋进行孵化,进而测定雏鸡的母源抗体消 长规律,还有待进一步研究。 ? 2 3 ? 河南农业科学
抗结核分枝杆菌感染的免疫机制 1．非特异性免疫机制 结核杆菌作为兼性胞内寄生菌，以巨噬细胞为宿主细胞。组织中的巨噬细胞可以吞噬多种病原微生物并处理衰老死亡的组织, 其自身还能分泌多种细胞因子和其他炎性介质参与局部炎症反应、发热反应等。巨噬细胞可以通过氧依赖性和非氧依赖性杀菌系统发挥杀伤和消除病原菌的作用。 （１）巨噬细胞的识别作用 巨噬细胞是MTB进入机体内首先侵入的细胞, 是MTB感染过程中的主要靶细胞。巨噬细胞有两种识别MTB的方式：①直接识别：巨噬细胞能通过其表面的激素样受体直接识别侵入机体的MTB。②间接识别：巨噬细胞可以通过表达补体受体识别MTB。（２）巨噬细胞的杀菌作用 巨噬细胞能通过自身凋亡等杀灭菌体。巨噬细胞系统的细胞毒素具有两个系统:一个是氧依赖系统, 在抗微生物效应中起决定性的作用；另一个是氧不依赖的系统，溶菌酶等属于该系统产物，这个系统也参与杀微生物活性。巨噬细胞主要通过氧依赖系统杀伤侵入机体的MTB,激活的巨噬细胞发生呼吸暴发，产生反应性氧中间产物(ROIs)和反应性氮中间产物(RNIs)，释放溶菌酶等活性蛋白质，这些物质有强的氧化作用和细胞毒作用，对MTB有强的杀伤作用。另外，巨噬细胞与病原菌作用后处于激活状态的巨噬细胞可以通过病原菌与TLR相互作用激活caspase-8，诱导其自身凋亡，破坏MTB的生存环境，杀灭入侵的MTB。 （３）ＭＴＢ的免疫逃逸机制 MTB能在巨噬细胞内定居存活以及引起机体一系列的病理反应是与其免疫逃逸的机制分不开的。MTB进入巨噬细胞胞膜内化形成吞噬小体，然后与溶酶体结合形成吞噬溶酶体，溶酶体分泌的胞内酶可以促使吞噬溶酶体酸化，外源性抗原在吞噬溶酶体的酸性环境中被水解为抗原多肽。而MTB之所以能够在巨噬细胞内存活是因为它能够阻止吞噬溶酶体的酸化。MTB可以通过降低磷脂酶D的活性，抑制活性氧中间体和活性氮中间体的产生，下调MHCⅡ的表达,抑制吞噬溶酶体的成熟，进而抑制巨噬细胞的氧依赖杀伤作用。 2．特异性免疫在抗结核中的作用 MTB的感染过程，分为初始感染,潜伏感染,再次大量增殖造成的疾病复燃三个阶
鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 30 ng/L - 900ng/L 使用目的： 本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中卵黄免疫球蛋白（IgY）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）水平。用纯化的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵黄免疫球蛋白（IgY），再与HRP标记的卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵黄免疫球蛋白（IgY）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽
量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
结核分枝杆菌IgG抗体(TB)检测试剂盒 一、检测原理------斑点金免疫渗滤法 二、临床意义------结核分枝杆菌抗体结果呈阳性 （一）、抗细胞壁脂多糖LAM抗体呈阳性 1、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体。 2、检测到此抗体阳性，结合临床症状和其他检查要考虑是活动性结核病患者。 3、由于在某些呼吸道炎症等良性疾病中，此抗体也会呈现阳性，所以，请医生要结合其他的临床信息加以鉴别诊断。 （二）、38KDa抗体阳性 1、38KDa抗原是定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白。 2、检测到此抗体阳性，结合临床病史，非常有助于活动性结核的诊断。 3、由于此抗原和大肠埃希菌(简称大肠杆菌)同源蛋白有30％以上的交叉，所以，在肠道感染患者中有一定的假阳性，要注意加以鉴别。 4、值得注意的是在部分接种过卡介苗（BCG）的患者中，也会出现阳性，要注意鉴别。 （三）、16kDa抗体阳性 1、16kDa蛋白又被称为HSP16.3蛋白，是小分子热休克蛋白（sHSP）家族成员之一。 2、此抗体在结核病患者中有相当高的阳性率（46～50% )，检测到此抗体阳性，并结合临床要考虑是活动性结核病患者。 3、在大多数接种过卡介苗（BCG）的患者中，并不会出现阳性，能将结核病患者与BCG 接种患者区别开来。 4、作为儿童结核的早期诊断指标，敏感性为64.8%左右，特异性96.2%左右。
（四）、MPT63抗体阳性 1、MPT63抗原是结核杆菌的分泌蛋白之一。 2、它的灵敏度为15～40％，特异性很高，约为98％左右。即在检测到此抗体阳性时，临床 上基本就可诊断是活动性结核病患者。 三、临床意义------结核分枝杆菌抗体结果呈阴性 （一）不是结核病患者 （二）病情好转 （三）在结核病患者病情加重、合并人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的结核病患者、痰涂片、 痰培养呈阴性的患者中，由于机体免疫能力低下等原因，导致产生的抗体滴度太低，以至于 不能被检测到，会呈现假阴性的结果，需要结合临床加以鉴别。 四、多指标联合检测的优势 （一）多指标联合检测，提高了阳性率 由于单个抗原不可能捕获全部或大多数抗体，所以，多指标联合检测，提高了阳性率，减少 了漏检，是结核血清学诊断的发展趋势。 指标组合灵敏度 LAM 56.5% LAM+38KD 68.3% LAM+38KD+16KD 75.2% LAM+38KD+16KD+MPT63 77.4% （二）多指标独立的检测结果，有助于医生对患者病情的监控 结核菌侵入机体后刺激机体产生一系列体液免疫反应，体液免疫随着病变的加重（或血行播散）而增加。当多个抗体呈现阳性时，提示病情有加重的迹象，所以，临床医生可以根据不 同时期的抗体谱，并结合患者的临床病症，进行病情的监控和疗效的判断。
文献综述 卵黄抗体的研究进展 郑译 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆，荣昌402460 摘要：抗体（免疫球蛋白，Ig）是指机体受到外来抗原物质刺激后，B细胞识别抗原后活化、增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的能与相应抗原特异性识别和结合的一类球蛋白。 关键词：卵黄抗体；免疫程序；研究进展 卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk，IgY）经特定抗原免疫后的母鸡可产生相应的特异性抗体，有研究证实[1]，产蛋鸡的卵黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于卵黄中，这种抗体称为卵黄抗体。 1 卵黄抗体的概念 卵黄抗体，英文名（vitelline antibody） 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 卵黄抗体是用特定抗原多次免疫产蛋母鸡，使机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存在卵黄中，经提取纯化的免疫球蛋白 卵黄抗体（Egg yolk antibodies eyAb），也称卵黄免疫球蛋白(Egg yolkimmunogbhin，IgY)。科学家在鸟类的血液循环壁发现三种免疫球蛋白(IgG、IgA 与IgM)，母鸡在细胞分裂产蛋的过程中，会将其免疫球蛋白转移至鸡蛋，母鸡血浆中之IgA与IgM，会在输卵管中与其他的蛋白质结合而构成鸡蛋蛋白的部分。 IgG：免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，IgG)的缩写。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组织中。 IGA：一种免疫球蛋白。异常情况下，在肾脏受到各种炎症反应刺激等因素下，导致IGA过度沉积在肾脏肾小球系膜区等部位，与抗原一起形成免疫复合物，造成肾脏结构病理损害，引起的一系列临床症状，称为IGA肾病。 IGM：免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的缩写。根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM是三种免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgG、IgD和lgE.。
结核病是由结核杆菌引起的一种慢性传染病。全身各器官均可发生，但以肺结核最为多见。其病变特征是结核结节形成并伴有不同程度的干酪样坏死。目前，临床使用的抗结核化学药物基本分为一线和二线用药两类。一线抗结核药物主要有利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素。继利福平之后，利福霉素类的利福喷汀和利福布汀也得到广泛应用。二线抗结核药物有卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星和氯苯吩嗪等。近些年来的研究结果，综合起来，新型抗结核药物，主要分为九大类：首先是利福霉素类衍生物，如利福喷丁、利福布丁、苯并恶嗪、利福霉素；此外还有CGP7074、CGP27557，F22等长效抗结核药物；其次为喹诺酮类品种如氧氟沙星、左旋氧氟沙星、环丙沙星等，由于该类药物对结核杆菌有很好的抑制及杀灭效果，价格低廉，毒副作用较小，并且与其它抗结核药物不产生交叉耐药性，故而受到广泛重视，是当前抗结核病类药物研究中的一个主要方面；第三、氨基糖甙类主要有丁胺卡那霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、巴龙霉素等；第四、大环内酯类，如克拉霉素、罗红霉素、阿齐霉素等；第五、β-内酰胺类及其酶抑制剂，即阿莫西林、克拉维酸等；第六、多肽类主要是结核放线菌素-N，对耐链霉素或卡那霉素的结核病菌有效，可用于复治联合方案多药耐药的病患者；第七、为吩噻嗪类、主要有吩噻嗪，适合于耐药的结核病联合用药；第八，硝基咪唑类，其代表甲硝唑，与其它抗结核病药物配伍使用，不仅对各种状态的结核病菌有杀灭作用，而且对潜伏感染的患者也有预防发病的作用；第九，其它类，目前上市的有以氨基水杨酸与异烟肼的化合物力排肺痰，现在我国也开始使用，效果较好。[作用机制] 抗结核药亦可按作用机制的不同分为：⑴阻碍细菌细胞壁合成的药物，如环丝氨酸、乙硫异烟胺；⑵干扰结核杆菌代谢的药物，如对氨基水杨酸钠；⑶抑制RNA合成药，如利福平；⑷抑制结核杆菌蛋白合成药，如链霉素，卷曲霉素；⑸多种作用机制共存或作用机制未明的药物，如异烟肼、乙胺丁醇。[适应症] 抗结核病类药物主要对结核杆菌有良好的抗菌作用。[不良反应] 胃肠道反应，肝损害，关节损害，神经系统反应，过敏反应等。[禁忌] 肝功能不良者、孕妇慎用。[用药原则] 1.早期用药早期病灶内结核菌生长旺盛，对药物敏感，同时病灶部位血液供应丰富，药物易于渗入病灶内，达到高浓度，可获良好疗效。 2.联合用药联合用药可提高疗效、降低毒性、延缓耐药性，并可交叉消灭对其他药物耐药的菌株，使不致成为优势菌造成治疗失败或复发。联合用药二联、三联或四联则取决于疾病的严重程度，以往用药情况以及结核杆菌对药物的敏感性。 3.适量是指用药剂量要适当。 4.坚持全程规律用药。[药物相互作用] 和其他种抗结核病类的药物配合使用虽然对结核杆菌有协同的抗菌作用，但是同时也容易加强肝中毒性。
结核分枝杆菌抗体检测(胶体金法) 规程操作 1、检验目的 本试剂盒可定性检测人血清中结构分枝杆菌抗体，用于临床结构病的辅助诊断。 2、检验原理 本试剂盒利用斑点免疫胶体金渗滤技术（DIGFA），将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG 抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物标呈色（SPA能与IgG 特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。 3、样本要求 必须使用新鲜血清标本，血浆标本必须用玻璃棒剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀。 4、试剂 4.1试剂名称：结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法） 4.2生产厂家：上海奥普生物医药有限公司 4.3包装规格：20人份/盒 4.4贮存条件及有效期：2-8℃干燥处保存，有效期12个月。 5、检验方法： 5.1在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液，等待薄膜吸入；5.2 取40μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，等待薄膜吸入； 5.3 在反应孔中间加入6滴洗活液，等待薄膜吸入； 5.4 在反应孔中间加入2滴金标液，等待薄膜吸入；
5.4 在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸收，目测结果； 6、结果判断 6.1 阳性——质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。 6.2 阴性——质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。 检验方法的局限性 少数标本（急性感染、高血脂、溶血等）可出现背景偏红，一般不影响结果判断，可通过将标本用封闭液1:3稀释，加样80μl背景将获得改善。严重乳糜血标本可能会阻塞硝酸纤维素膜孔，使背景很红，影响中间红色斑点有无的判别，不宜用本法测定。 7、注意事项 7.1 必须以单人份操作，严禁多标本同时检测，每个标本的操作步骤需要连续进行，不宜停顿过长。 7.2 质控点显示红色表明试剂盒有效；阴、阳性对照也是确保定性结果可靠的一个环节，但临床阳性标本显色深浅可以与阳性对照不同。 7.3 血清、包括健康人血清属潜在生物危害物质，操作者应戴手套，测试后凡接触血清的物品应消毒后再丢弃。