真核细胞常见表达载体
1. pCMVp-NEO-BAN载体
特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507
图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：
Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age1
3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507
图示为启动子和多克隆位点区域：
pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40 poly A+
4. pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：
Pvu11…pSV40….Hind111….SV40 IVS….SV40 polyA+
5. CMV4 表达载体
特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：
CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40 ori 其他常用克隆Vector：
pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
说明:
pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA扦入，转化lacZ 基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
保存液: TE Buffer
TE Buffer组成:
10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)
真核细胞表达外源基因的调控
1.真核基因组的复杂性
与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。
(1)真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍;大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。
(2)真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。
(3)原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。
(4)如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA;真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。
(5)原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。
(6)原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。
(7)原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：①高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10-300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10-60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。②中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100-500bp，重复101-105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3-×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。③单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。
从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。
2.真核基因表达调控的特点
尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。
(1)真核基因表达调控的环节更多
如前所述，基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。图1扼要地列出真核基因表达的各个可能的环节。
图1真核生物基因表达调控的可能环节
图1总结了以前章节叙述过的基因表达过程，并作了一些新补充。图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排(gene rearrangement)，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化，与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。
此外，真核细胞中还会发生基因扩增(gene amplification)，即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如
MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA区段扩增40?00倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。
(2)真核基因的转录与染色质的结构变化相关
真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中NA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象：
1)染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂
期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，其中从未见有基因转录表达;原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达;哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。
真核细胞表达外源基因技术
1.生化方法
(1)磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞
1)转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育20～24 h。转染前1 h换液。
2) 按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5 ml灭菌塑料管内混合100μl 2.5 mol/L CaCl2与25μg质粒DNA，如有必要用0.1×TE(pH7.6)将体积补至1 ml。室温下将以上2×钙-DNA溶液与等体积的2×HEPES盐溶液混合。迅速弹敲试管侧壁混匀溶液，静置1 min。
3)立即将磷酸钙-DNA悬液转移至上述单层细胞的细胞培养基中。每1 ml培养基加0.1 ml悬液。轻轻摇动平皿混匀培养基，培养基会变成混浊的橘黄色。一旦形成DNA沉淀，转染效率会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。如果是用氯喹、甘油与/或丁酸钠处理细胞，直接进行步骤5。
4)如果转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5%~7%CO2的37℃温箱孵育。2～6 h后，吸去培养基与DNA沉淀。加入5 ml 37℃预热的完全培养基，将细胞放回孵箱孵育1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者如果是稳定转化则直接进行步骤7。
5)在磷酸钙-DNA沉淀物的存在下用氯喹处理细胞或者吸去沉淀溶液后将细胞暴露于甘油与丁酸钠中会促进细胞吸收DNA。
(2)用氯喹处理细胞
氯喹是一种弱碱，推测是通过抑制细胞内溶酶体水解酶降解DNA而发挥作用(Luthman and Magnusson 1983)。细胞对氯喹毒性的敏感度限制了培养基中加入氯喹的浓度及时间，不同细胞所需氯喹最佳浓度根据经验而定。
1)在把磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞前或后按1：1000将100 mmol/L氯喹直接加入培养基中。
2)细胞于含5%~7%CO2的37℃温箱中孵育3~5 h。
3)在用DNA于氯喹孵育细胞后，移去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，加5 ml预热的完全培养基。细胞于孵箱中培养1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。
(3)丁酸钠处理细胞
丁酸钠的作用机制并不确定;但它是组蛋白乙酰化形成使外来质粒DNA趋于转录的染
色质结构(Workman and Kingston 1998)。
1)甘油休克处理后，将500 mmol/L丁酸钠直接加入生长培养基(甘油处理的步骤d)。细胞类型不同，所用丁酸钠的浓度也不同。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他细胞系所需浓度依经验而定。
2)细胞于孵箱中培养1~6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。
6)若要检测细胞转染后导入DNA的瞬时表达，可在转染后1~6天收获细胞。杂交分析DNA或RNA。通过体内代谢标记进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
7)分离稳定转染体
(1)用非选择性培养基孵育细胞24~48 h，使转染的DNA有足够时间表达。
(2)胰酶消化细胞并重铺细胞于选择性培养基中，或者直接加选择性培养基/
(3)每2~4天更换培养基，持续培养2~3周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。
(4)克隆独立菌路、繁殖，以用于检测(方法见Jakoby and Pastan 1979或Spector et al. 1998b [《细胞试验手册》的第86章])。
(6)用预冷的甲醇固定细胞15 min，然后室温下用10% Giemsa染色15 min，流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目。
2.物理方法
(1)电穿孔转染DNA
1)细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4℃、500g离心5 min(Sorvall H1000B转子用1 500r/min).
2)用0.5体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目。
3)离心(同步骤1)收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至
2.5×106~2.5×107细胞/ml。
4)将400μl的各等份细胞悬液(106～107细胞)加入标记好的电转化池中，冰浴。
5)设置电转化参数。一般电容量为1050μF。电压在200 V和250 V之间，不同细胞系所需电压不同，平均为260 V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有PBS的电转化池放电至少两次。
6)每一装有细胞的电转化池内加入10～30μg、体积最大可至40μl的质粒DNA。用吸管将DNA与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第7步。
7)立即将电转化池移至电极间放电，1～2min后，取出电转化池，水浴，立即进行下一步操作。
8)用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至35 mm培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加入培养皿。培养皿置于含5%～7% CO2的37℃孵箱。
9)重复第6～8步，电转化所有DNA与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
现已分离出有作用的真核细胞可诱导性表达元件有多种，如重金属离子诱导的金属硫蛋白启动子，具有正负调控作用的糖皮质激素启动子及干扰素诱导的启动子系统等。将这些启动子元件与目的基因融合构成转基因，常可表现出相应基因的可诱导性表达。
.哺乳动物细胞表达系统
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法：一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时插入几种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。
由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因插
入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。另一种方法是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都插入laxP 位点，然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过Cre介导两个laxP位点之间的DNA发生重组，可获得重组腺病毒，这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。
利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导，但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导，这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱导表达特异性差;当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性，常对细胞造成损伤等。
为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。
外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞产生不利影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题便是外源基因不能持久稳定地表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA。内部的顺反子通过内核糖体进入位点(IREs)介导进行翻译，通过持续选择压力，无需繁琐的筛选过程，便可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体。
哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。
利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。
4.结语
目前已经建立了多种诱导表达系统，但它们都有其优点和不足，这就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。一般来说，一个理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求：
①特异性：该系统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化。
②非干扰性：该系统成分不能对细胞通路有干扰。
③可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速产生高水平的基因表达。
④诱导剂的生物利用率：调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。
⑤可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状态。
⑥剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。
总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。Van der GeId等利用不同的表达系统表达了蛋白激酶(PR30)，并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需表达的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、安全性等，权衡利弊后再选择相应的表达系统。
真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次（图真核生物基因表达中可能的调控环节）。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。（一）DNA水平的调控 DNA水平上的调控是通过改变基因组中有关基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。这一类的调控机制包括基因的扩增、重排或化学修饰。其中有些改变是可逆的。 1、基因剂量与基因扩增 细胞中有些基因产物的需要量比另一些大得多，细胞保持这种特定比例的方式之一是基因组中不同基因的剂量不同。例如，有A、B两个基因，假如他们的转录、翻译效率相同，若A基因拷贝数比B基因多20 倍，则A基因产物也多20倍。组蛋白基因是基因剂量效应的一个典型实例。为了合成大量组蛋白用于形成染色质，多数物种的基因组含有数百个组蛋白基因拷贝。 基因剂量也可经基因扩增临时增加。两栖动物如蟾蜍的卵母细胞很大，是正常体细胞的一百倍，需要合成大量核糖体。核糖体含有rRNA分子，基因组中的rRNA基因数目远远不能满足卵母细胞合成核糖体的需要。所以在卵母细胞发育过程中，rRNA基因数目临时增加了4000倍。卵母细胞的前体同其他体细胞一样，含有约500个rRNA基因（rDNA）。在基因扩增后，rRNA基因拷贝数高达2×106。这个数目可使得卵母细胞形成1012个核糖体，以满足胚胎发育早期蛋白质大量合成的需要。 在基因扩增之前，这500个rRNA基因以串联方式排列。在发生扩增的3 周时间里，rDNA不再是一个单一连续DNA片段，而是形成大量小环即复制环，以增加基因拷贝数目。这种rRNA基因扩增发生在许多生物的卵母细胞发育过程中，包括鱼、昆虫和两栖类动物。目前对这种基因扩增的机制并不清楚。 在某些情况下，基因扩增发生在异常的细胞中。例如，人类癌细胞中的许多致癌基因，经大量扩增后高效表达，导致细胞繁殖和生长失控。有些致癌基因扩增的速度与病症的发展及癌细胞扩散程度高度相关。 2．基因丢失 在一些低等真核生物的细胞分化过程中，有些体细胞可以通过丢失某些基因，从而达到调控基因表达的目的，这是一种极端形式的不可逆的基因调控方式。如某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育到一定阶段后，许多体细胞常常丢失整条染色体或部分染色体，而只有在将来分化生殖细胞的那些细胞中保留着整套的染色体。在马蛔虫中，个体发育到一定阶段后，体细胞中的染色体破碎，形成许多小的染色体，其中有些小染色体没有着丝粒，它们因不能在细胞分裂中正常分配而丢失，在将来形成生殖细胞的细胞中不存在染色体破碎现象。但是，基因丢失现象在高等真核生物中还未发现。 3．DNA重排（基因重排） 基因重排(gene rearrangement)是指DNA分子中核苷酸序列的重新排列。这些序列的重排可以形成新的基因，也可以调节基因的表达。这种重排是由基因组中特定的遗传信息决定的，重排后的基因序列转录成mRNA，翻译成蛋白质。 尽管基因组中的DNA序列重排并不是一种普通方式，但它是有些基因调控的重要机制，在真核生物细胞生长发育中起关键作用。
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将
真核生物基因表达的调控 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、 2、 3、 4、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、无操纵子和衰减子。 大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。
生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。 从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。 c.基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。
真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。 真核基因表达调控的环节更多 如前所述：基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。 图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排（gene rearrangement），即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化、与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。 此外，真核细胞中还会发生基因扩增（gene amplification），即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育程中其rRNA 基因（可称为rDNA）可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量蛋白质要求有大量核糖体的需要。又如MTX （methotrexate）是叶酸的结构类似物，能竞争性抑制细胞对叶酸的还原利用，因而对细胞有毒性，但当缓慢提高MTX浓度时，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40-400倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。 真核基因的转录与染色质的结构变化相关 真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象： 染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质（euchromatin），松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质（hetrochromatin），其中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。 组蛋白的作用早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。 发现核小体后，进一步观察核小体结构与基因转录的关系，发现活跃进行基因转录的染色质区段常有富含赖氨酸的组蛋白（H1组蛋白）水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基等现
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。
一、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 1. 真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在 109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 2. 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传 成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 3. 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。 4. 如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元， 共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 5. 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中 仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 6. 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码 的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 7. 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组 中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：1）高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。2）中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。3）单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。 从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。 二、真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。
第十章作业 1. 简述真核生物基因表达调控的7个层次。 ①染色体和染色质水平上的结构变化与基因活化 ②转录水平上的调控，包括基因的开与关，转录效率的高与低 ③RNA加工水平的调控，包括对出事转录产物的特异性剪接、修饰、编辑等。 ④转录后加工产物在从细胞核向细胞质转运过程中所受到的调控 ⑤在翻译水平上的控制，即对哪一种mRNA结合核糖体进行翻译的选择以及蛋白质成量的控制 ⑥对蛋白质合成后选择性地被激活的控制，蛋白质和酶分子水平上的剪接等的控制 ⑦对mRNA选择性降解的调控 2. 真核基因表达调控与原核生物相比有何异同？ 相同点：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后水平的调控，并且也以转录水平调控为最重要； ②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 不同点：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。 ②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。 ③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。 3. DNA 甲基化对基因表达的调控机制。 甲基化抑制基因转录的机制：DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNaseⅠ超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 直接影响了转录因子与启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。 4. 转录因子结合DNA的结构基序（结构域）有哪几类？ ①螺旋-转折-螺旋 ②锌指结构 ③碱性-亮氨酸拉链 ④碱性-螺旋-环-螺旋 5. 真核基因转调控中有几种方式能够置换核小体？ ①占先模式：可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。 ②动态模式该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构 6. 简述真核生物转录水平调控过程。 真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程：①转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
基因表达调控 一、选择题 （一） A 型选择题 1 ．基因表达调控的最基本环节是 A ．染色质活化 B ．基因转录起始 C ．转录后的加工 D ．翻译 E ．翻译后的加工 2 ．将大肠杆菌的碳源由葡萄糖转变为乳糖时，细菌细胞内不发生 A ．乳糖→ 半乳糖 B ． cAMP 浓度升高 C ．半乳糖与阻遏蛋白结合 D ． RNA 聚合酶与启动序列结合 E ．阻遏蛋白与操纵序列结合 3 ．增强子的特点是 A ．增强子单独存在可以启动转录 B ．增强子的方向对其发挥功能有较大的影响 C ．增强子不能远离转录起始点 D ．增强子增加启动子的转录活性 E ．增强子不能位于启动子内 4 ．下列那个不属于顺式作用元件 A ． UAS B ． TATA 盒 C ． CAAT 盒 D ． Pribnow 盒 E ． GC 盒 5 ．关于铁反应元件（ IRE ）错误的是 A ．位于运铁蛋白受体 (TfR) 的 mRNA 上 B ． IRE 构成重复序列 C ．铁浓度高时 IRE 促进 TfR mRNA 降解 D ．每个 IR E 可形成柄环节构 E ． IRE 结合蛋白与 IRE 结合促进 TfR mRNA 降解 6 ．启动子是指 A ． DNA 分子中能转录的序列 B ．转录启动时 RNA 聚合酶识别与结合的 DNA 序列 C ．与阻遏蛋白结合的 DNA 序列 D ．含有转录终止信号的 DNA 序列 E ．与反式作用因子结合的 RNA 序列 7 ．关于管家基因叙述错误的是 A ．在同种生物所有个体的全生命过程中几乎所有组织细胞都表达 B ．在同种生物所有个体的几乎所有细胞中持续表达 C ．在同种生物几乎所有个体中持续表达 D ．在同种生物所有个体中持续表达、表达量一成不变 E ．在同种生物所有个体的各个生长阶段持续表达 8 ．转录调节因子是 A ．大肠杆菌的操纵子 B ． mRNA 的特殊序列 C ．一类特殊的蛋白质 D ．成群的操纵子组成的凋控网络 E ．产生阻遏蛋白的调节基因 9 ．对大多数基因来说， CpG 序列高度甲基化 A ．抑制基因转录 B ．促进基因转录 C ．与基因转录无关 D ．对基因转录影响不大 E ．既可抑制也可促进基因转录 10 ． HIV 的 Tat 蛋白的功能是 A ．促进 RNA po l Ⅱ 与 DNA 结合 B ．提高转录的频率
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
原核生物基因表达调控概述 基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。 1.基因表达调控意义 在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。 2.原核基因表达调控特点 原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。 细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。 二.原核生物表达调控的概念 （1）细菌细胞对营养的适应
细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长 的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。 （2）顺式作用元件和反式作用元件 基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。RNA聚合酶是典型的反式作用因子。 顺式作用元件是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其 自身同处于一个DNA分子上的基因；这种基因DNA序列通常不编码蛋白质， 多位于基因旁侧或内含子中。位于转录单位开始和结束位置上启动子和终止子，都是典型的顺式作用元件。 （3）结构基因和调节基因 结构基因是编码蛋白或RNA基因。细菌的结构基因一般成簇排列，多个结 构基因受单一启动子共同控制，使整套基因或者都不表达。结构基因编码大量功能各异的蛋白质，其中有组成细胞核组织器官基本成分的结构蛋白，有催化活性的酶和各种调节蛋白等。调节基因是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异性DNA序列。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点 结合控制转录是调控关键。 （4）操纵基因和阻遏蛋白 操纵基因是操纵子中的控制基因，在操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放状态，使RNA聚合酶能够通过并作用于启动子启动转录，阻遏蛋白是负调控系统中由调节基因编码的调节蛋白，它本身或与辅阻遏蛋白物一起合成于操纵基因，阻遏蛋白操纵因子结构基因的转变，阻遏蛋白可被诱导物变构失活，从而导致不可阻遏或去阻遏。
真核生物基因表达的调控 河南大学民生学院王磊生物技术 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。 2、无操纵子和衰减子。 3、大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 4、个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。 a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多
标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。
原核生物和真核生物基因表达调控、复制、转录、翻译特点的比较 1.相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节 ①结构基因均有调控序列； ②表达过程都具有复杂性，表现为多环节； ③表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性； 2.不同点: ①原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平。真核基因的表达调控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。 ②原核基因表达调控主要为负调控，真核主要为正调控。 ③原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启动子,由sita因子决定基因表的的特异性，真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用调控转录激活。 ④原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。 ⑤真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子与RNA聚合酶结合、阻遏蛋白、负调控、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。 真核生物基因表达的调控环节较多： 在DNA水平上可以通过染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。 在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TA TA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。 在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。 在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA的稳定性调节及小分子RNA。 真核基因调控中最重要的环节是基因转录，真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。 真核生物和原核生物复制的不同点： ①真核生物DNA的合成只是在细胞周期的S期进行，而原核生物则在整个细胞生长过程中都可进行DNA合成 ②原核生物DNA的复制是单起点的，而真核生物染色体的复制则为多起点的。真核生物中前导链的合成并不像原核生物那样是连续的，而是以半连续的方式，由一个复制起点控制一个复制子的合成，最后由连接酶将其连接成一条完整的新链。 ③真核生物DNA的合成所需的RNA引物及后随链上合成的冈崎片段的长度比原
真核细胞常见表达载体 欧阳光明（2021.03.07） 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位