Lowry法检测蛋白质含量
本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的
1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器
2.1 待测样品：蛋白纯化后样品
2.2 实验试剂
100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部
2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器
2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸
3实验步骤
3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：
3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；
3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；
3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；
3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；
3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
4 方法学验证
4.1 精密度实验：将样品按照需要稀释到线性范围内（约50μg/ml）后取0.5ml 再加入等体积60μg/ml的蛋白标准品（0.5ml）。平行制备7份，按上述“3”方
4.2 稳定性实验：
4.2.1 不同浓度的样品的回收率（40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml）：将样品按照需要稀释到线性范围内（约50μg/ml）后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml 3个浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再
4.2.2 不同的供试样品浓度的回收率（样品稀释倍数0、2、4）：将已知蛋白质浓度的样品按照需要分别稀释0、2、4倍后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60μg/ml浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再分别检测其OD650
4.3 方法的重复性研究
4.3.1 3批不同样品的回收率：
将样品按照需要稀释到线性范围内（约50μg/ml）后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60μg/ml浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再
4.3.2 三个人同一批次的样品的回收率：三个人分别同时操作，将样品按照需要稀释到线性范围内（约50μg/ml）后取0.5ml，再依次分别加入等体积的60μg/ml 浓度的蛋白标准品（0.5ml）。按上述“3”方法操作，再分别检测其OD650吸光
5 实验结果
标准曲线的建立：以0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml 标准品的OD650吸光度的平均值作标准曲线回归方程：y=ax+b，标准曲线在20-100μg/ml浓度范围内均成线性相关，相关系数R2＞0.99。
加样回收率的计算公式为：
人体的蛋白质每天的摄入量应为多少？ 1.临床研究表明，缺钙会导致动脉粥样硬化、高血压、骨质疏松、结肠癌和老年痴呆症等疾病。而牛奶中含有丰富的钙，每天早餐后或者临睡前1 小时喝一杯牛奶，对补钙大有好处。 2.正常成人每天主食(米饭、面食)的摄入量一般应为300-400克左右。而有些人出于减肥或其他目的，每天只吃很少的主食甚至不吃主食，这种 做法是错误的。如果人们主食的摄入量长期不足，会使碳水化合物提供的热能降低，造成人体只能通过分解蛋白质来提供热能，这样会导致儿童停止生长发育，导致成年人精神不振。 3.大豆是一种蛋白质含量极高的食物。常吃豆制品既能补充人体所需要的蛋白质，又可以预防营养过剩，不像吃肉那样会增加胆固醇。 4.新鲜蔬菜中除了含有丰富的维生素和矿物质以外，还含有丰富的植物纤维，每天吃500克左右的新鲜蔬菜既可以防止便秘，又可以减少粪便中 有害物质对肠壁的刺激，起到预防肠癌的作用。 5.鸡肉和猪肉中都含有大量的动物蛋白，是人体必需的营养物质。但是，美中不足的是猪肉中含有大量的饱和脂肪酸，容易引起人体血管的动脉 硬化。所以，营养学家赞成多吃点鸡、鸭等禽类肉，少吃一点猪、牛、羊肉。 6.海鱼的鱼油中含有丰富的不饱和脂肪酸，能起到降低血脂的作用。其中鱼油中含有的多烯脂肪酸与血液中的胆固醇结合后，可降低血液黏稠度， 有效地消除血管内的脂肪沉积，是血管的“清道夫”。 7.香菇、猴头、黑木耳等菌类都是高蛋白、低脂肪的食品，其蛋白质的含量比一般蔬菜高，而且还含有大量人体所必需的各种氨基酸及多种微量 元素，长期食用菌类食品能起到良好的保健作用。 8.水果营养丰富，所含的主要成分是糖类，其中大部分是人体可以直接吸收的果糖和葡萄糖。此外，多数水果中所含的果酸、鞣酸、维生素、果 胶、矿物质、蛋白质和脂肪等都是人体必需的营养物质。这些营养物质可以防治皮肤干燥、痤疮和老年斑，使人面色红润，皮肤细嫩，起到美容和抗衰老的作用。 9.一只约1两重的鸡蛋，其蛋黄中胆固醇的含量约为280毫克，正好满足一个成年人一天的生理需要。而蛋黄中的卵磷脂能降低血液的黏稠度， 起到避免胆固醇沉着的作用。 10.人不吃盐是不行的，但高盐饮食对人体健康危害更大。高盐饮食会造成人体内钙的流失;高盐饮食还是导致胃溃疡、胃癌的主要原因之一;另外， 盐的主要成分是氯化钠，人体吸收过量的钠会使血压明显升高。因此，三口之家每月的食盐摄入量应控制在500克左右。 ?添加评论 ?daggerbullet | 2009-06-16 10:43:28 ?有0人认为这个回答不错 | 有0人认为这个回答没有帮助 ?蛋白质食物是人体重要的营养物质，保证优质蛋白质的补给是关系到身体健康的重要问题，怎样选用蛋白质才既经济又能保证营养呢？ 首先，要保证有足够数量和质量的蛋白质食物．根据营养学家研究，一个成年人每天通过新陈代谢大约要更新300g以上蛋白质，其中3／4来源于机体代谢中产生的氨基酸，这些氨基酸的再利用大大减少了需补给蛋白质的数量．一般地讲，一个成年人每天摄入60g～80g蛋白质，基本上已能满足需要． 其次，各种食物合理搭配是一种既经济实惠，又能有效提高蛋白质营养价值的有效方法．每天食用的蛋白质最好有三分之一来自动物蛋白质，三分之二来源于植物蛋白质．我国人民有食用混合食品的习惯，把几种营养价值较低的蛋白质混合食用，其中的氨基酸相互补充，可以显著提高营养价值．例如，谷类蛋白质含赖氨酸较少，而含蛋氨酸较多．豆类蛋白质含赖氨酸较多，而含蛋氨酸较少．这两类蛋白质混合食用时，必需氨基酸相互补充，接近人体需要，营养价值大为提高． 第三，每餐食物都要有一定质和量的蛋白质．人体没有为蛋白质设立储存仓库，如果一次食用过量的蛋白质，势必造成浪费．相反如食物中蛋白质不足时，青少年发育不良，成年人会感到乏力，体重下降，抗病力减弱． 第四，食用蛋白质要以足够的热量供应为前提．如果热量供应不足，肌体将消耗食物中的蛋白质来作能源．每克蛋白质在体内氧化时提供的热量是18kJ，与葡萄糖相当．用蛋白质作能源是一种浪费，是大材小用． ?添加评论 ?kk1978726 | 2009-06-20 13:50:46 ?有0人认为这个回答不错 | 有0人认为这个回答没有帮助 ?人体每天所需的热量有10%～15%来自蛋白质。过量蛋白质不但是毒素的来源，更破坏细胞的渗透平衡。渗透平衡指的是细胞膜内外液体压力保持平衡。当平衡受到干扰，水分便进入细胞，除了试图恢复平衡，也会将细胞内过量蛋白质加以稀释。稀释是应付细胞内过剩物质的生理反应。各种刺激品中，蛋白质仅次于药物。和蛋白质相比较，咖啡、茶、可乐只能算是小儿科。含咖啡因饮料远不及一客牛排威力大。前者只持续一小时，后者则让你兴奋数小时之久。 人体每天所需的热量有10%～15%来自蛋白质。一般而言，机体不用蛋白质作为产热的来源，只有当人体摄入的热量不足时，机体才动用蛋白质产热。 蛋白质摄入量过多，不但是一种浪费，而且对人体有危害。蛋白质在人体内的分解产物较多，其中氨、酮酸及尿素等对人体会产生副作用，引发酸中毒,不仅增加肝脏负担，还 容易引起消化不良，长期以往，影响肝肾功能，造成消瘦及免疫功能低下。美国科学家发布一项声明指出，食用过量的蛋白质会增加患癌症的风险，如直肠癌、胰腺癌、肾癌及乳腺癌。食用动物性蛋白质如蛋类、奶类及肉类过多，还可以诱发心脏病。所以，正常人如果膳食结构合理，蛋白质、脂肪和碳水化合物的比例适当，膳食蛋白质的质量也较好，就没有必要额外补充蛋白质粉。痛风、肝肾功能衰竭的病人，更要限制蛋白质的摄入。 人体每天所需的热量有10%～15%来自蛋白质。一般而言，机体不用蛋白质作为产热的来源，只有当人体摄入的热量不足时，机体才动用蛋白质产热。 蛋白质摄入量过多，不但是一种浪费，而且对人体有危害。蛋白质在人体内的分解产物较多，其中氨、酮酸及尿素等对人体会产生副作用，引发酸中毒,不仅增加肝脏负担，还 容易引起消化不良，长期以往，影响肝肾功能，造成消瘦及免疫功能低下。美国科学家发布一项声明指出，食用过量的蛋白质会增加患癌症的风险，如直肠癌、胰腺癌、肾癌及乳腺癌。食用动物性蛋白质如蛋类、奶类及肉类过多，还可以诱发心脏病。所以，正常人如果膳食结构合理，蛋白质、脂肪和碳水化合物的比例适当，膳食蛋白质的质量也较好，就没有必要额外补充蛋白质粉。痛风、肝肾功能衰竭的病人，更要限制蛋白质的摄入。 蛋白质与高血压有何关系？ 蛋白质是生命活动的最重要的物质基础，从每个细胞的组成到人体的构造，从生长发育到受 损组织的修复，从新陈代谢到酶、免疫机制及激素的构成，从保持人的生命力到推迟衰老、延 年益寿都离不开蛋白质。 近年来，国内外学者对蛋白质的摄入与高血压的关系进行了深入的研究，结果表明，多摄入 优质蛋白质高血压的发病率下降，即使高钠饮食，只要摄入高质量动物蛋白，血压也不升高。 日本近年来脑血管病死亡率明显下降，据认为这与日本人膳食中肉、蛋、奶等动物蛋白增高有
《医学免疫学》实验教学大纲 实验名称：医学免疫学 学时：6学时 学分： 适应专业：护理学专业 执笔人：边藏丽 审定人：王恺兵 一、实验目的与任务 实验教学是医学免疫学教学的重要组成部分，通过实验教学加深对基础理论知识的理解，了解常用的免疫学检查方法，掌握免疫学基本实验技术（试管凝集、玻片凝集、对流免疫电泳、免疫细胞形态观察、淋巴细胞分离、ELISA等），培养学生严谨求实的科学态度以及观察、分析、综合能力、创造思维能力和初步的科研能力。 二、教学基本要求 医学免疫学实验对象多为具有传染性的材料，要求学生在实验教学中严格遵守实验室规则，牢固树立无菌观念，认真操作与观察实验结果，实事求是的记录实验结果，并对实验结果进行认真分析和讨论。 四、实验教学内容及学时分配 实验一凝集反应（试管凝集、玻片凝集） 3学时 1．目的要求 掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；掌握凝集反应原理、方法和用途。 2．方法原理 颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。 3．主要实验仪器及材料 试管、玻片、水浴箱、吸管、伤寒杆菌“H”“O”诊断菌液、大肠埃希菌、大肠埃希菌
诊断血清等。 4．掌握要点 掌握凝集反应原理、方法和用途；血清效价；凝集现象的观察。 5．实验内容： （1）玻片凝集（抗原定性试验） （2）试管凝集（抗体定量试验） 实验二对流免疫电泳、血型鉴定 2学时1．目的要求 掌握沉淀的反应原理、方法和用途；了解对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；掌握血型鉴定的反应原理、方法及结果判断。 2．方法原理 对流免疫电泳是将经典沉淀反应与电泳技术结合而设计的一项实验。沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在一定条件下发生结合并出现肉眼可见的沉淀物的一种血清学反应。 带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。抗原在的缓冲带负电荷，将抗原加于琼脂板阴极端的小孔中，由阴极向阳极移动；抗体为球蛋因电渗作用而流向阴极。当抗原抗体在两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。此种在双向琼指扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。 血型鉴定属直接凝集反应。将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。 3．主要实验仪器及材料 标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）、酒精棉球、采血针、载玻片、待测血清、甲胎蛋白诊断血清，肝癌病人阳性血清， L巴比妥缓冲液，琼脂对流免疫板、打孔器、加样器、电泳仪等。 4．掌握要点 （1）对流免疫电泳的操作步骤，结果观察； （2）血型鉴定的方法及结果判断。 5．实验内容： （1）讲述沉淀的反应原理、方法和用途；对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；血型鉴定的反应原理、方法及结果判断； （2）对流免疫电泳的操作及结果观察； （3）血型鉴定的操作及结果观察； 实验三小鼠吞噬细胞及转化细胞形态观察 2学时 1.目的要求 观察吞噬细胞的吞噬现象；了解机体的非特异性免疫功能。观察转化细胞、淋巴母细胞的形态了解机体的特异性免疫功能。 2．方法原理 巨噬细胞可吞噬异种或异体细胞等体积较大的异物，中性粒细胞可吞噬多种细菌。观察这两类细胞的吞噬现象，可计算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数，用以评价机体的免疫状态。 淋巴细胞，在受抗原的刺激后，可转化为淋巴母细胞，淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平。
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质的测定方法 测定食物中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。 一．凯氏微量法 有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。 1.原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O （NH4）2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4 2.方法 本法参照GB 5009.5 -85 适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定 3.试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 3.1硫酸铜 3.2硫酸钾 3.3浓硫酸 3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸） 3.5 混合指示剂：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.6饱和氢氧化钠：500g氢氧化钠加入500ml水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。 3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液：需标定后使用(配制及标定方法见附录) 4.仪器 消化炉凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子天平 凯氏定氮蒸馏装置：如图所示 5. 操作步骤 5.1样品处理：精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20ml，放入100ml或500ml凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜，0.3g硫酸钾及3~20ml浓硫酸，放置过夜后小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，取下放冷后用约2～10ml蒸馏水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小心加10~20ml水混匀，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。 5.2按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 5.3向接收瓶内加入10ml ,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3~10ml饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min取下接收瓶，以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10ml试剂空白消化液按5.3操作。 6. 计算
论蛋白质在人体中的功用与合理饮食习惯 经过一学期的生化学习，让我对生物这门自然科学有了更深的认识，他不单单是一门学科，更是探索人体奥秘一种途径，在学习中让我首次对蛋白质有了兴趣。蛋白质是人体的必须营养素，在生命活动过程中起着各种生命功能执行者的作用，几乎没有一种生命活动能离开蛋白质，所以没有蛋白质就没有生命。 那么什么是蛋白质呢？蛋白质是化学结构复杂的一类有机化合物，是人体的必须营养素。蛋白质的英文是protein，源于希腊文的proteios，是“头等重要”意思，表明蛋白质是生命活动中头等重要物质。蛋白质是细胞组分中含量最为丰富、功能最多的高分子物质，在生命活动过程中起着各种生命功能执行者的作用。 我们每天都吃饭，有五谷杂粮，有肉蛋奶等等之类。我们都知道肉蛋奶中富含蛋白质，有些植物中也富含蛋白质，所以蛋白质的食物来源可分为植物性蛋白质和动物性蛋白质两大类。植物大白质中，谷类含蛋白质10%左右，蛋白质含量不算高，但由于是人们的主食，所以仍然是膳食蛋白质的主要来源。豆类含有丰富的蛋白质，特别是大豆含蛋白质高达36%-40%，氨基酸组成也比较合理，在体内的利用率较高，是植物蛋白质中非常好的蛋白质来源。蛋类含蛋白质11%-14%，是优质蛋白质的重要来源。奶类（牛奶）一般含蛋白质3.0%-3.5%，是婴幼儿蛋白质的最佳来源。肉类包括禽、畜和鱼的肌肉。新鲜肌肉含蛋白质15%-22%，肌肉蛋白质营养价值优于植物蛋白质，是人体蛋白质的重要来源。 提到了摄入那么不得不说到吸收的问题，蛋白质是大分子物质但是蛋白质在胃液消化酶的作用下，初步水解，在小肠中完成整个消化吸收过程。氨基酸的吸收通过小肠黏膜细胞，是由主动运转系统进行，分别转运中性、酸性和碱性氨基酸。在肠内被消化吸收的蛋白质，不仅来自于食物，也有肠黏膜细胞脱落和消化液的分泌等，每天有70g左右蛋白质进入消化系统，其中大部分被消化和重吸收。未被吸收的蛋白质由粪便排出体外。所以每日所能吸收的蛋白质是有限制的。这就是为什么总有人说一天只吃两个鸡蛋吃了就不会消化的原因。 肉富含蛋白质，而且肉人们都爱吃。但是肉吃多了，会导致摄入过量动物蛋白质的摄入，就必然摄入较多的动物脂肪和胆固醇。其次蛋白质过多本身也会产生有害影响。正常情况下，人体不储存蛋白质，所以必须将过多的蛋白质脱氨分解，氮则由尿排出体外，这加重了代谢负担，而且，这一过程需要大量水分，从而加重了肾脏的负荷，若肾功能本来不好，则危害就更大。过多的动物蛋白摄入，也造成含硫氨基酸摄入过多，这样可加速骨骼中钙质的丢失，易产生骨质疏松。 同样有时也会出现缺乏的情况。蛋白质缺乏在成人和儿童中都有发生，但处于生长阶段的儿童更为敏感。蛋白质的缺乏常见症状是代谢率下降，对疾病抵抗力减退，易患病，远期效果是器官的损害，常见的是儿童的生长发育迟缓、体质量下降、淡漠、易激怒、贫血以及干瘦病或水肿，并因为易感染而继发疾病。蛋白质的缺乏，往往又与能量的缺乏共同存在即蛋白质—热能营养不良，分为两种，一种指热能摄入基本满足而蛋白质严重不足的营养性疾病，称加西卡病。另一种即为“消瘦”，指蛋白质和热能摄入均严重不足的营养性疾病。 我们既不能摄入过多的蛋白质，又不能缺少蛋白质，所以就涉及到如何挑选蛋白质食物来补充自身的蛋白质又不会过量含蛋白质多的食物包括：牲畜的奶，如牛奶、羊奶、马奶等；畜肉，如牛、羊、猪、狗肉等；禽肉，如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、驼鸟等；蛋类，如鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋等及鱼、虾、蟹等；还有大豆类，包括黄豆、大青豆和黑豆等，其中以黄豆的营养价值最高，它是婴幼儿食品中优质的蛋白质来源；此外像芝麻、瓜子、核桃、杏仁、松子等干果类的蛋白质的含量均较高。 蛋白质食物是人体重要的营养物质，保证优质蛋白质的补给是关系到身体健康的重要问题，怎样选用蛋白质才既经济又能保证营养呢？ 首先，要保证有足够数量和质量的蛋白质食物。根据营养学家研究，一个成年人每天通
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.doczj.com/doc/662659262.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
浅谈蛋白质与人体健康的关系 蛋白质是人体组织不可缺少的构成成分，是人体生命的物质基础，如果从生命活动过程去衡量，蛋白质加上核酸，是生命存在的主要形式。人体有无数细胞构成，蛋白质是主要部分。蛋白质不仅是人类机体的主要构成物质，而且蛋白质也是构成人体内各种生物活性物质的主要成份。人体内许多重要的生理活动均由蛋白质来完成，如酶、激素、抗体等；肌肉收缩，血液凝固等也都是通过蛋白质来实现的。如果人体内没有酶、激素等物质的存在，那么人体内的物质代谢、神经传导细胞分裂与分化等生理活动将无法进行；蛋白质是人体正常代谢的物质保证，是维持组织的生长、繁殖、更新和修复的必需营养素。蛋白质提供人体必需的部分能量。因此，可以肯定地讲没有蛋白质就没有生命，人体健康就无从谈起。 蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。蛋白质主要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。多个蛋白质可以一起，往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，折叠或螺旋构成一定的空间结构，从而发挥某一特定功能。人体中估计有10万种以上的蛋白质。生命是物质运动的高级形式，这种运动方式是通过蛋白质来实现的，人体内的一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、等都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。人体运动系统中肌肉的成分以及肌肉在收缩、作功、完成动作过程中的代谢无不与蛋白质有关，离开了蛋白质，体育锻炼就无从谈起。所以蛋
白质有极其重要的生物学意义。与人体健康更是息息相关。 人体的大部分都是由蛋白质所组成，皮肤、肌肉、内脏、毛发、指甲、大脑甚至骨骼等除了尿液、胆汁都是由蛋白质构成。蛋白质充足时，才能维持细胞正常的功能与新陈代谢。因为人体的肌肉组织中，蛋白质的含量最高，因此只要照照镜子，就可以看出自己所摄取蛋白质是否充足。 强壮而营养充足的肌肉，自然会使身体挺拔健壮。如果肌肉得不到所需的养分，便会失去弹性，向旧轮胎一样松松垮垮，姿势会不好看。一个要求孩子站有站相、坐有坐相的母亲，等于是承认自己对食物的忽视。一个健康的人，总是抬头挺胸，两肩自然下垂、小腹微缩、脊椎略微弯曲、步伐稳健有节奏。毛发与指甲也是由蛋白质所构成，因此需要充分的营养来维持他们的健康。没有光泽、没有弹性、甚至断裂的头发，只要补充适度的营养也能在几个星期内恢复健康。 摄取充足的蛋白质，可以是精力旺盛、心情愉快。倦怠的主要原因 除了血糖过低之外，还有缺乏蛋白质所造成的许多原因，如血压太低、贫血、身体机能障碍、无法产生将食物分解为能量的酶等。这些都无法在短期内得到改善。 血压是指血液对血管壁的压力。血管壁的组织坚韧才能维持正常的血压。如果血管壁变得脆弱或松弛，血管扩大，而血液的流量固定，血压相对降低，红血球输送养分的功能减弱，组织细胞的不到充足的养分，就会产生
第六节免疫药理学实验方法与技术简介 免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。 免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。 一、免疫细胞的分离与纯化 体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。 外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。 从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。 淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B 细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。 二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介 1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。 2、对免疫细胞功能的影响常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。 3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测T H细胞活性。 4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。 5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。 6、对超敏反应影响的体内外实验总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸 液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一) 、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6 ％，即1份氮素相当于6.25 分蛋白质,以此为换算系数6.25 ，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同. 如玉米、高梁、荞麦, 肉与肉制品取6.25 ，大米取 5.95 、小麦粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取5.17 ，动物胶 5.55 。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 ⑴消化反应：有机物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04 -T(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02 (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T +2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O T2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20- (NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾； 2、硫酸铜；
蛋白质对人体的六大作用 2008-3-4 13:34:3 在人体中，蛋白质的主要生理作用表现在六个方面： 1)构成和修复身体各种组织细胞的材料 人的神经、肌肉、内脏、血液、骨骼等，甚至包括体外的头皮、指甲都含有蛋白质，这些组织细胞每天都在不断地更新。因此，人体必须每天摄入一定量的蛋白质，作为构成和修复组织的材料。 2)构成酶、激素和抗体 人体的新陈代谢实际上是通过化学反应来实现的，在人体化学反应的过程中，离不开酶的催化作用，如果没有酶，生命活动就无法进行，这些各具特殊功能的酶，均是由蛋白质构成。此外，一些调节生理功能的激素和胰岛素，以及提高肌体抵抗能力儿保护肌体免受致病微生物侵害的抗体，也是以蛋白质为主要原料构成的。 3)维持正常的血浆渗透压，是血浆和组织之间的物质交换保持平衡 如果膳食中长期缺乏蛋白质，血浆蛋白特别是xx的含量就会降低，血液内的水分便会过多地渗入周围组织，造成临床上的营养不良性水肿。 4)供给肌体能量 在正常膳食情况下，肌体可将完成主要功能而剩余的蛋白质，氧化分解转化为能量。不过，从整个肌体而言，蛋白质的这方面功能是微不足道的。 5)维持肌体的酸碱平衡 肌体内组织细胞必须处于合适的酸碱度范围内，才能完成其正常的生理活动。肌体的这种维持酸碱平衡的能力是通过肺、肾脏以及血液缓冲系统来实现的。蛋白质缓冲体系是血液缓冲系统的重要组成部分，因此说蛋白质在维持肌体酸碱平衡方面起着十分重要的作用。 6)运输氧气及营养物质
血红蛋白可以携带氧气到身体的各个部分，供组织细胞代谢使用。体内有许多营养素必须与某种特异的蛋白质结合，将其作为载体才能运转，例如运铁蛋白、钙结合蛋白、视黄醇蛋白等都属于此类。 蛋白质原料前十位(每100xx） > (99.90xx) (84.10xx) (65.30xx) (64.70xx) (60.00xx) (55.60xx) (54.10xx) (50.20xx) (47.80xx) (47.60xx) 蛋白质菜谱前十位(每100xx） > (84.10xx) (74.22xx) (71.21xx) (66.94xx) (66.03xx)
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质的检测（参考GB/T6432-94） 一、原理 凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 二、试剂 （1）硫酸化学纯，含量为98%，无氮； （2）混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀； （3）氢氧化钠化学纯，40%水溶液（m/V）； （4）硼酸化学纯，2%水溶液（m/V）； （5）混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月； （6）盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定； a)0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。 b)0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。（7）蔗糖分析纯； （8）硫酸铵分析纯，干燥； （9）硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。
三、仪器设备 （1）实验室用样品粉碎机或研钵； （2）分样筛孔径0.45mm（40目）； （3）分析天平感重0.0001g； （4）消煮炉或电炉； （5）滴定管酸式，10、25mL； （6）凯氏烧瓶 250mL； （7）凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； （8）锥形瓶 150、250mL； （9）容量瓶 100mL； （10）消煮管 250mL； （11）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 四、分析步骤 （一）仲裁法 1.试样的消煮称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g）， 放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。 2.氨的蒸馏 （1）常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀，