第章实验动物模型 第一节实验动物选择的原则 第二节生物科学研究中的动物模型
实验动物模型 选择什么样的实验动物作实验是生物医学研究工作中一个重要环节，不能随便选用一种实验动物来作科学研究，因为在不适当的动物身上进行实验，常可导致实验结果的不可靠，甚至使整个实验徒劳无功，直接关系到科学研究的成败和质量。事实上，每一项科学实验都有其最适宜的实验动物。
第一节实验动物选择的原则 ?科学研究工作中实验动物的选择，首先应根据实验目的和要求来选择，其次再参考是否容易获得、是否经济，是否容易饲养和管理等情况。 ?在实验动物选择上必须注意三点，即实验动物的种类（Species）；品种（Breed）或品系（Strain）；质量和实验动物的健康状态。
尽量选择与研究对象的机能、代谢、结构及疾病特点相似的实验动物； ?生物医学研究的根本目的是要解决人类疾病的预防和治疗问题。因此，在选择实验动物时应优先考虑的问题是动物的种系发展阶段。在可能的条件下，尽量选择那些机能、代谢、结构和人类相似的实验动物作实验。一般来说，实验动物愈高等，进化愈高，其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类，猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类的理想动物。
第二节生物科学研究中的动物模型 一、动物模型的意义和优越性 ?生物科学研究的进展常常依赖于使用动物模型作为实验假说和临床假说二者的试验基础。人类各种疾病的发生发展是十分复杂的，要深入探讨其疾病的发病机理及疗效机理不能也不应该在病人身上进行。可以通过对动物各种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类，探索人类生命的奥秘，以控制人类的疾病的衰老，延长人类的寿命。
麻醉的分子机理研究进展 姓名：杨波动物医学10级3班学号：20101321 摘要：利用分子遗传学研究手段，在生物整体水平探索影响吸人麻醉药全麻敏感性的相关基因及其表达产物，是近年来开展的全麻机制研究的新方法，并在吸人麻醉药全麻敏感基因的定位、克隆及功能鉴定方面取得了长足进展，初步显示出其在全麻机制研究中的独特价值。 一、麻醉的概念及分类 麻醉是用认为的方法（包括化学的或物理的方法）局部或者全身地改变神经、体液活动，使整个机体或机体的一部分暂时失去知觉，以消除手术所致的疼痛。现代麻醉学是研究临床麻醉、重诊检测治疗、急救复苏、镇静镇痛的理论和技术的一门科学。麻醉的主要目的是消除手术中的疼痛，避免人、动物的意外损伤，其次是便于手术操作，为外科治疗创造有利的条件，保护重要脏器的功能。麻醉分类很多种，目前在兽医临床上重要分为局部麻醉和全身麻醉。研究麻醉机理主要是对全身麻醉的分子机理的研究，全身麻醉是利用某些药物对中枢神经系统产生广泛的抑制作用，从而暂时地使机体的意识、感觉、反射和肌肉张力部分或全部丧失的一种麻醉方法。 二、研究进展 对全身麻醉的分子机理的研究有助于我们对整个麻醉过程的更清晰的认识，让我们能清楚地了解到麻醉作用的方法，能开发出更多更好更适用的麻醉药，能准确地解释出麻醉的每个过程中，动物会出现怎样的临床表现，对手术过程中怎么的抢救动物、何时需要解除麻醉提供理论依据。为麻醉前准备和麻醉前用药提供一个参考依据。让兽医在临床上合理合方法地应用麻醉药或麻醉方法。便于对麻醉深度的控制，避免出现用药过重对动物中枢神经系统抑制太强而导致动物的休克甚至死亡等。 有关全身麻醉敏感基因的分子遗传学在体研究模型目前有哺乳类动物、酵母、线虫和果蝇等，对它们的麻醉敏感基因的分子遗传学研究为进一步阐明特异性的全麻分子靶位作出了有益的探索。吸入麻醉药是通过呼吸道吸入体内并产生全身麻醉作用的药物，吸入麻醉药的全身麻醉敏感基因的分子遗传学研究通常有顺向性和逆向性的研究：①顺向性研究(表型--基因)：通过对诱发或自发突变品系的遗传筛选，获得对吸入麻醉药全麻敏感性不同的生物品系，进一步进行敏感性相关基因的染色体定位或分离克隆。研究可用于探索与全身麻醉敏感性相关的已知或未知基因。②逆向性研究(基因--表型)：采用基因工程
项目名称:细胞分裂增殖调控的分子机理研究 完成人: 张传茂、蒋青、付文祥、傅静雁、王刚、陈强、刘沁颖 主要完成单位:北京大学 项目简介： 细胞分裂增殖是生物个体生长、发育和繁殖最重要的生命活动。它是由一系列高度动态且受到精密调控的细胞周期事件构成，包括细胞分裂起始时中心体复制、分离和成熟，核膜崩解，染色体凝集和列队，双极纺锤体装配等；以及细胞分裂结束时染色体去凝集，核膜重建等。这一复杂而精细的过程受到CDK、Polo 以及Aurora激酶家族严格的时空调控。细胞分裂增殖的异常会导致包括生长发育异常和肿瘤在内的多种疾病的发生。因此，有关细胞分裂增殖的机理研究具有重大的理论意义和应用价值。 本项目主要研究细胞分裂增殖过程中核膜崩解与重建的动态变化、中心体成熟、染色体凝集与列队以及双极纺锤体装配的调控机制，并取得了以下多项重要成果： 1. 建立了应用相关蛋白质小球和细胞(包括卵细胞)提取物为材料的非细胞体系核膜重建模式，并发现核转运蛋白importin-β参与核膜装配(Curr Biol, 2001, 2002)，使得核膜重建机理研究获得突破性进展。发现结合染色质的含有核定位信号的蛋白(如Nucleoplasmin)能够招募核转运蛋白importin-α，而importin-α又进一步招募importin-β。Importin-β通过结合被p34cdc2磷酸化了的核纤层受体蛋白LBR，将含有LBR的膜泡募集到染色质表面，并在RanGTP的作用下将它们释放下来以促进核膜重建(JBiolChem, 2010; JCell Sci, 2007; Cell Res,2012)，进一步为核膜装配的机理研究提供了重要理论基础。 2. 发现单个氨基酸位点突变可以在细胞定位和功能上实现Aurora-A向Aurora-B的转变，证实Aurora-A和Aurora-B激酶在调控细胞分裂时通过与不同底物结合，调控其自身的定位和功能，为分析Aurora-A和Aurora-B在细胞增殖过程中的调控模式及其在进化上的联系提供了新认识，也为特异性激酶抑制剂的筛选提供了新思路(PNAS, 2009)。该成果受到国际同行的积极评价，并被《NatRevCancer》、《Cur Opin Cell Biol》等广泛引用。 3. 发现Aurora A通过磷酸化TACC3蛋白，促进TACC3与纺锤体定位的clathrin结合并共同参与调控纺锤体装配(JCell Sci, 2010)。发现TACC3能够促进非中心微管成核、小星体装配和动粒-微管结合，再通过分选等关键调控步骤，建立纺锤体与染色体之间的联系(PNAS, 2013)，为双极纺锤体的装配、染色体列队和分离以及细胞分裂奠定了基础。上述成果对认识细胞分裂的机理具有非常重要的意义，受到国际同行的积极评价，并被《NatRevMolCell Biol》、《JCell Biol》等广泛引用。 4. 发现有丝分裂期激酶CDK1和Plk1时序性磷酸化中心体蛋白Nedd1，促进Nedd1与γ-tubulin的结合以增强γ-TuRC 在中心体的募集和微管锚定，进而促进中心体成熟和纺锤体装配(JCell Sci, 2009)。发现Plk1在细胞进入有丝分裂期之前促进纤毛的解聚(JCell Sci, 2013a)，为研究中心体成熟、纤毛解聚与细胞周期调节之间的内在联系提供了全新的机制，并受到了国际同行的认可和广泛引用。其中，针对Plk1在纤毛解聚中的研究，《JCell Sci》在出版当期以“PLK1 links ciliary disassembly andmitosis”为题作出配图评述和亮点文章推介。同时，国际顶级期刊《NatRevMol Cell Biol》也为该成果刊发了题为“Coordinating ciliary dynamics and cell proliferation”的研究亮点短评。
附件1 G6PD基因G487A位点突变调控黑色素瘤增殖 的分子机制 一、项目基本情况 候选人：朱月春，杨银峰，况应敏，田兴亚，胡滔， 张春华，蔡天池，唐琼玲，李丹怡，吕会茹， 任娜，张正 完成单位：昆明医科大学 推荐单位：云南省教育厅 项目所属学科：基础医学 任务来源：国家计划 计划名称和编号： 1.国家自然科学基金项目《红细胞G6PD缺乏时溶血机理的研究》，项目编号：39960027，2000/01-2002/12、13万元，主持人田兴亚。 2.国家自然科学基金项目《云南阿昌族G6PD基因扫描及其克隆表达》，项目编号：30460049，2005/01-2007/12、20万元，主持人朱月春。 3.国家自然科学基金项目《G6PD与人皮肤黑色素瘤STAT5信号传导通路的研究》，项目编号：30860322，2009/01-2011/12、20万元，主持人朱月春。 4.国家自然科学基金项目《G6PD和NADPH氧化酶调控人黑
色素瘤细胞ROS水平及STAT5活性的分子机制》，项目编号：81160246，2012/01-2015/12、55万元，主持人朱月春。 二、项目简介 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是磷酸戊糖途的关键酶。人G6PD基因位于Xq2.8，G6PD缺陷不仅引起新生儿黄疸、药物或食物诱导的急性溶血和慢性非球形红细胞性贫血等血液病，还与其他疾病如疟疾、肿瘤、糖尿病、艾滋病等有关。G6PD缺陷是人类最常见的遗传病之一，全世界患病人数超过4亿；云南省是G6PD缺乏症的高发区，并且G6PD 基因变异存在民族及地域性差异，是云南省少数民族高发的基因变异之一。同时，云南也曾经是疟疾流行区，而G6PD缺陷常被认为是疟疾阳性选择的结果。 该研究结合云南地域和民族的特点，在上述4项国家基金资助下，应用生化与分子生物学技术，历时16年，从云南少数民族G6PD基因变异及其溶血机理、到阿昌族G6PD基因克隆表达及酶动力学，重点研究了G6PD在UV密切相关黑色素瘤发生发展中的作用与分子机制，构成了从溶血性疾病到肿瘤的G6PD基因-功能系列研究并获得了如下发现： 1.调查了云南阿昌族G6PD缺陷的发病率，鉴定了云南阿昌族G6PD新单体型G6PD 487G>A/IVS5-612(G>C)，并从酶动力学和分子建模阐明了G6PD 487G>A所致急性溶血的可能机理。 2.构建了稳定敲低G6PD、NOX4表达的人黑色素瘤A375稳转细胞株（A375-G6PDΔ、A375-NOX4Δ），构建了G6PD过表达的A375-G6PDΔ-G6PDWT和A375-G6PDΔ-G6PDG487A稳转细胞株。
项目名称：作物应答盐碱胁迫的分子调控机理首席科学家：郭岩中国农业大学 起止年限：2012.1-2016.8 依托部门：教育部
一、关键科学问题及研究内容 拟解决的关键科学问题： 在前期973项目研究的基础上，本项目以水稻、玉米和拟南芥为材料，拟解决的主要科学问题是：作物重要耐盐碱基因的克隆，植物盐碱胁迫信号感受和重要调控单元的鉴定、作用机制分析以及作物耐盐碱品种培育的分子设计。我们将针对我国不同地区的盐土、碱土和苏打盐土的特殊性、围绕植物响应盐碱胁迫的信号感受-信号转导和基因转录调控两个网络交叉互作的重要节点进行重点研究、并根据得到的重要节点组成的调控单元（Regulatory module），通过“智能型”转化系统进行初步耐盐碱作物的分子设计。这些问题的解决，不仅对解析植物耐盐碱机理和阐明植物适应其它非生物逆境的机理有重要的理论意义，同时对耐盐碱作物分子设计育种和耐盐碱作物新品种培育以及我国盐碱土地的开发利用具有重要的应用前景。 主要研究内容： 在前期973项目顺利实施的基础上，根据作物应答盐碱胁迫的“信号感受—转导—蛋白修饰—染色质修饰/转录调控—离子平衡/细胞活性—反馈互作及网络调控”的基本过程和研究思路，围绕植物响应盐碱胁迫的信号转导和基因转录调控两个网络的交叉互作调控，寻找负责调控植物盐碱胁迫反应的两个网络的重要节点以及由包括这个（或这些）重要节点组成的重要调控单元，重点探讨植物对盐碱胁迫的感知、染色质修饰与盐碱胁迫反应关键基因转录活性调控和植物耐盐碱的关系。使我们能够比较系统和深入地了解植物对盐碱胁迫反应的分子机制，并为通过分子设计培育耐盐碱作物（玉米、水稻）新品种提供理论基础和遗传材料。 通过创造（人工诱变、渗入系等）主要农作物耐盐碱材料和寻找地方品种耐盐碱资源，分离、克隆耐盐碱基因或QTL，明确它们在抗逆调控途径中的位置，初步阐明其耐盐碱的分子调控机理，为作物品种改良提供有利的抗逆新基因。 项目拟研究的主要内容包括： 1）作物感应高盐胁迫的分子机制；
缺血性中风动物模型研究 2013级硕士8班陈林伟南京中医药大学 摘要:实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难，动物模型与临床的拟合具有重要意义。脑缺血动物模型为研究脑缺血后病理过程.病理生理机制及评价潜在的治疗干预效果等提供了极其重要的手段。 关键词:缺血性中风；动物模型；大脑中动脉闭塞 脑卒中，俗称中风，包括脑出血、脑血栓和脑梗塞等。缺血性中风是由大脑主动脉或其分支血栓形成，或内栓子阻塞引起，且多为大脑中动脉(MCA)栓塞。利用实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难，过去二十年，经动物模型研究证明有效的700多种药物中，除一种新自由基消减剂(NXY-059)外，其余全都未能在三期临床得到阳性结果，从而无法证明其有效性，故研究建立与人类发病机理相近、可长期观察、结果稳定可靠、便于操作、价格低廉而实用的符合人类中风的动物模型成为一个迫切需要解决的问题。 1 实验动物的选择 在新药研发与脑缺血基础工作中，选择恰当的动物模型是非常重要的。缺血性中风动物模型中使用的实验动物有两大类：即灵长类和啮齿类。对于中风的生理病理的了解，最初来源于中风患者。因此，灵长类动物对中风的基础研究具有重要作用。与人类相似的多脑回灵长类动物种属(如猕猴)，在行为和感觉运动整合方面与人类有密切的相似性，是中风基础研究、探索性研究和临床前评价的最佳动物模型。利用非人灵长类动物制备模型，已有了几十年的经验积累，如狒狒。STAIR会议提出，药物一旦用小动物做出阳性结果，应该在较高的物种进行验证，然后才能开始临床试验[1]。最近报道，利用狨猴模型发现了神经保护药物氯美噻唑。国内也有学者采用光化学法成功造成树鼩局部脑缺血模型呤[2]，其造模方法亦被多人借鉴采纳。但是，到目前为止，尚无标准化的、被广泛接受的灵长类动物中风模型。 与灵长类较大的动物相比，啮齿类动物模型，如大鼠和小鼠，具有价格便宜、来源充足、品种纯化、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理较接近于人类、易于监测生理参数，脑标本制作容易等多面的优势[3]。但是啮齿类动物的大脑与人和非人灵长类
（生物科技行业）生物固氮作用的分子机理研究
项目名称：生物固氮作用的分子机理研究首席科学家：王忆平北京大学 起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部
一、研究内容 生物固氮研究的关键科学问题是获得最佳生物固氮体系（包括共生固氮、联合（内生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮体系，具体包括：（1）阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传递环境和植物信号，调节自身基因表达的分子机理；（2）揭示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制；（3）阐明共生固氮体系中植物与微生物相互作用的机理，如植物与微生物相互识别及分子信号的传导机制，克服宿主特异性，从而扩大根瘤菌的宿主范围；（4）利用单细胞真核生物--酵母菌的线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物自主固氮体系的奠定基础。（5）阐明固氮酶结构、功能和催化机理。 围绕上述提高生物固氮效率、扩大共生固氮植物范围、建立自主固氮体系的关键问题，主要研究内容有： （1）以模式豆科植物共生固氮体系为材料，分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因，研究和建立根瘤菌与宿主植物共生关系蛋白相互作用网络；通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制，为探索扩大根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学资料；分离和鉴定LysR、GntR等家簇转录因子及其靶基因，阐明根瘤菌主代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理；开展根瘤菌群体感应系统、Ⅲ型分泌系统及胞外多糖合成基因表达调节的双组分调控系统的研究，阐明这些代谢系统在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性。 （2）碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。固氮基因调控
畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控机制研究
一、研究内容 （一）项目的总体设想 动物骨骼肌和脂肪细胞的分化、生长和组织发育的调控过程实际上是内在的遗传和表观遗传基础和外在的各种信号分子互作的结果。目前在该研究中存在的主要问题包括：（1）对组织器官的发育学研究还多半停留在单个基因或单个分子调控作用的水平，从系统、多层次和调控分子之间网络联系开展的研究不足，因而不利于对组织器官的发育从整体和完整过程的角度解析其发育的分子机制；（2）一些调控层次，如表观遗传学、RNA、信号分子、内在代谢与微环境等层次上的研究尚属新兴，缺乏深入研究的资料，因而难以客观把握组织器官系统发育多重控制的机制；（3）对骨骼肌和脂肪发育的研究大多集中在人和实验鼠上，由于有限的物种资源，难以从比较生物学角度全面揭示细胞分化调控网络的发生、发展机制。而且已有的研究多是针对骨骼肌和脂肪代谢疾病有关的发病机理，研究存在一定的局限性。（4）近年来，通过干细胞技术和基因敲除等手段，在大小鼠等经典模式动物的骨骼肌和脂肪发育研究方面取得了一系列的进展，揭示了控制干细胞分化及骨骼肌和脂肪发育的多种重要基因和调控通路。但在猪和鸡上，相应的手段和资料相对不足，尤其是猪、鸡骨骼肌和脂肪的胚胎干细胞技术还不够成熟，因而多能胚胎干细胞分化为猪、鸡骨骼肌和脂肪前体细胞的分子机制认识不足；其他模式动物大许多数据尚未在猪和鸡上印证，因而不够明了猪和鸡骨骼肌与脂肪发育机制的特点；骨骼肌和脂肪发育表观遗传学方面的研究尚属新兴，因而不能能解析猪和鸡品种品系发育差异的机制。（5）虽然转基因猪和鸡都有成功的报道，但技术方法尚未能达到实际生产应用的要求，也未见涉及针对调控发育基因方面的研究。 本项目运用干细胞、功能基因组、非编码RNA、RNA和蛋白组学、信号传导等先进研究手段，采用比较生物学研究策略，分别从基因转录与转录后沉默、DNA与蛋白质修饰，外周信号转导通路等层次深入研究猪和鸡的肌肉和脂肪组织发生、细胞生长和分化过程中，DNA、RNA、蛋白质以及外周信号分子之间互作的调控网络关系和系统发生机制，并在miRNA鸡的培育方面进行攻关，填补发育研究领域的一些不足，可望在猪和鸡等畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控理论及其应用方面取得重要突破。 基于上述设想，本项目重点解决下列关键科学问题：
分子生物学主要研究内容 1. 核酸的分子生物学。 核酸的分子生物学研究 核酸的结构及其功能。由于 核酸的主要作用是携带和传 递遗传信息，因此分子遗传 学是其主要组成部分。由于 50年代以来的迅速发展，该 领域已形成了比较完整的理 论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则是其理论体系的核心。 2. 蛋白质的分子生物学。 蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。 3.细胞信号转导的分子生物学。 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。 4.癌基因与抑癌基因、肽类生长因子、细胞周期及其调控的分子机理等。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。
项目名称：糖脂代谢稳态调控的分子机制首席科学家：林圣彩厦门大学 起止年限：2011.1至2015.8 依托部门：教育部
二、预期目标 1. 总体目标 确定机体和细胞在不同生理状况和环境因素下维持糖脂代谢稳态的分子机制，阐明在细胞生长和应激反应中起重要作用的调节因子调控细胞代谢的信号通路网络，为糖脂代谢紊乱造成的肥胖、脂肪肝、糖尿病和癌症的早期诊断和治疗提供理论依据。 2. 五年预期目标 (1) 建立对实验动物代谢相关的生理生化指标分析的技术平台，发现相关基因敲 除或转基因小鼠造成糖脂代谢紊乱的信号通路。 (2) 较系统地描述在逆境下机体和细胞调控糖脂代谢的分子网络以及调控过程 中关键蛋白质和蛋白质复合体的动态调控机制。 (3) 发现新的参与代谢调控的基因，为代谢性疾病和肿瘤的防治提供新的分子靶 标。 (4) 培养高质量博士研究生20-30名，培养3-5名享有国际知名度的专家和5-8名 中青年学术带头人。 (5) 在国际重要刊物发表SCI论文15-25篇，其中争取在Cell、Nature、Science或其 子刊等影响因子10以上杂志发表研究论文5-10篇，申请发明专利3-5项。
三、研究方案 1. 总体研究方案 细胞能量代谢是细胞最基本、最重要的活动之一，与细胞的繁殖、分化、凋亡、运动、信号转导及多种重要疾病的发生密切相关，是生命科学的一个重要领域。细胞要通过能量感应系统随时监测其能量水平状态，在不同的物质和能量状态下要不断地通过细胞内的代谢调控途径来调节其代谢水平以达到一种稳态。同时，细胞在面对内外界一些不良因素时也会做出相应的代谢变化，这些应激反应对细胞正常的生长和功能是极其重要的。如果这些应激反应失调，就会使细胞代谢发生异变，导致如前所述的多种人类重大疾病的发生。本项目的总体研究方案拟利用我们在蛋白质科学、细胞代谢、细胞信号转导等研究领域的研究优势和技术手段，结合细胞生物学、动物生理学等学科的研究方法，集中力量多层次、多角度地研究与细胞代谢调控相关的信号通路网络，分离和鉴定参与细胞代谢调控的新的基因和信号通路，探讨各个信号通路之间的动态调控机制，并研究细胞异常代谢的信号通路，揭示代谢异常与糖尿病、肿瘤等重大疾病的关系。项目总体研究方案如下图1：
项目名称-糖脂代谢稳态调控的分子机制-首席科学家-林圣 彩厦门大学- 项目名称: 糖脂代谢稳态调控的分子机制首席科学家: 林圣彩厦门大学 起止年限: 2011.1至2015.8 依托部门: 教育部 二、预期目标 1. 总体目标 确定机体和细胞在不同生理状况和环境因素下维持糖脂代谢稳态的分子机制～阐明在细胞生长和应激反应中起重要作用的调节因子调控细胞代谢的信号通路网络～为糖脂代谢紊乱造成的肥胖、脂肪肝、糖尿病和癌症的早期诊断和治疗提供理论依据。 2. 五年预期目标 (1) 建立对实验动物代谢相关的生理生化指标分析的技术平台～发现相关基因敲 除或转基因小鼠造成糖脂代谢紊乱的信号通路。 (2) 较系统地描述在逆境下机体和细胞调控糖脂代谢的分子网络以及调控过程 中关键蛋白质和蛋白质复合体的动态调控机制。 (3) 发现新的参与代谢调控的基因～为代谢性疾病和肿瘤的防治提供新的分子靶 标。 (4) 培养高质量博士研究生20-30名～培养3-5名享有国际知名度的专家和 5-8名 中青年学术带头人。
(5) 在国际重要刊物发表SCI论文15-25篇～其中争取在Cell、Nature、Science或其 子刊等影响因子10以上杂志发表研究论文5-10篇～申请发明专利3-5项。 三、研究方案 1. 总体研究方案 细胞能量代谢是细胞最基本、最重要的活动之一～与细胞的繁殖、分化、凋亡、运动、信号转导及多种重要疾病的发生密切相关～是生命科学的一个重要领域。细胞要通过能量感应系统随时监测其能量水平状态～在不同的物质和能量状态下要不断地通过细胞内的代谢调控途径来调节其代谢水平以达到一种稳态。同时～细胞在面对内外界一些不良因素时也会做出相应的代谢变化～这些应激反应对细胞正常的生长和功能是极其重要的。如果这些应激反应失调～就会使细胞代谢发生异变～导致如前所述的多种人类重大疾病的发生。本项目的总体研究方案拟利用我们在蛋白质科学、细胞代谢、细胞信号转导等研究领域的研究优势和技术手段～结合细胞生物学、动物生理学等学科的研究方法～集中力量多层次、多角度地研究与细胞代谢调控相关的信号通路网络～分离和鉴定参与细胞代谢调控的新的基因和信号通路～探讨各个信号通路之间的动态调控机制～并研究细胞异常代谢的信号通路～揭示代谢异常与糖尿病、肿瘤等重大疾病的关系。项目总体研究方案如下图1: 内外环境因素(缺氧、营养缺乏或过剩、癌基因突变等)内外环境因素(缺氧、营养缺乏或过剩、癌基因突变等)
癌细胞分子机理的研究进展 【摘要】癌细胞分子机理是生命科学中最重要的研究领域之一。癌基因一直是当今肿瘤基础和应用研究方面的中心课题。人们从癌基因激活表达，癌基因协作，癌基因表达调控等方面入手，了解到细胞癌变的分子基础，为癌症的诊断和治疗，开辟了新的视野。本文试从癌基因入手，从细胞生物学和分子生物学等角度，就细胞癌变研究较活跃的几个方面内容综述如下。 【关键词】癌基因；癌基因激活表达；癌基因协作；癌基因表达调控 癌细胞的特点是细胞无控制的增殖和生长，不分化，丧失正常的接触抑制能力，并在体内出现浸染性的转移。针对细胞癌变，许多学者提出假说来解释细胞癌变的原理，如化学致癌假说、病毒致癌假说等等。癌基因在细胞癌变中的作用并不是孤立的，必须考虑癌基因调控以及表达活性的激活和表达产物对细胞多酶体系的作用等一系列问题，因此在基因水平上阐明癌变原理比单从形态或表形来考虑要复杂得多。本文从癌基因入手，从细胞生物学和分子生物学等角度，用通俗易懂的语言，就当前细胞癌变研究较活跃的几个方面内容作了综述。为广大读者认识癌症和防止癌变提供一定的理论知识。 1.癌基因的激活机理 正常细胞中存在着癌基因，但得癌者毕竟是极少数，这说明在一般情况下癌基因是不活动的。据观察，在正常细胞中各种癌基因的表达产物的量极低甚至检测不出来，而在癌细胞中某种癌基因的表达产物的量以数十数百倍计增加，看来细胞癌变首先需要癌基因的激活表达。最初提出的一种癌基因激活机理叫促进子（Promoter）插入致癌模式。有人认为在正常细胞中癌基因是以原癌基因状态存在着，可能经点突变的刺激开始活化变为活泼的癌基因。从而证实，虽然有的癌基因确实存在多态性，不过其出现频率较低。至于癌基因的多态性是否使癌细胞对癌变因素变得敏感起来，目前还不得而知。 癌基因的协作问题，是多年争论焦点。从肿瘤临床和病理过程来看，癌组织的形成需要一个较长的发展过程，其中包括癌前期（增生期），癌变期和癌形成期等。按照这个时间表，有理由认为细胞癌变是经过多阶段变化过程完成的，这实际上是由于细胞在处理外环境中的有害因素或不测因素发生差错，而使错误逐渐累积及恶性循环造成的后果。 2.癌基因产物的功能 已知癌基因的产物种类主要有四类：酪氨酸特异性蛋白激酶、膜糖蛋白、结构蛋白和核内结合蛋白。研究最多的是第一类产物的作用。如src、abl、tps和tes 等癌基因的产物都是酪氨酸特异性蛋白激酶，以src产物（称为PP60）为例，具有酪氨酸激酶活性的PP60Src能使磷脂酰肌醇磷酸化，增加聚磷酸肌醇的形成，后者经酶解后形成1、4、5三磷酸肌醇和二酰基甘油。二酰基甘油（DG）是蛋白激酶C（PKC）的激活剂，它可通过活化PKC引起一系列信号刺激反应，参与细胞增殖和癌化的调控。PKC参与了细胞形态变化、DNA复制、细胞分化等多种生理功能调节；它可激活与增殖有关的原癌基因表达，如c-fos，c-jun，c-myc 等；并可通过影响有关的转录因子的作用，在DNA合成和增殖调控中发挥作用。 多种癌基因的表达产物具有蛋白质酪氨酸激酶活性并参与肿瘤形成过程，提示蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶可能抑制肿瘤形成。 此外，还有一种癌基因的产物是细胞膜上糖蛋白，膜表面糖蛋白是接受外界
实验动物学论文乙型肝炎动物模型研究现状 学院：食品学院 专业：食品质量与安全 班级：2010级1班 姓名：辛建英 学号：2010013238
乙型肝炎动物模型研究现状 摘要：乙型肝炎动物模型的研究随着人类乙肝病毒携带者的不断增多而越来越深入。国内外学者乙肝动物模型的研究有很多，并取得了一定的成果。本文就不同乙肝动物模型的研究发展做一综述。 关键词：乙肝病毒；动物模型；研究 乙肝又是由乙肝病毒（HBV）引起的传染性疾病。可通过血液与体液等途径传播。乙肝主要在亚洲国家流行，全世界约有3.5～4亿人感染乙肝病毒，中国乙肝病毒携带者也为人口总数的十分之一，感染人数是艾滋病感染者的八倍以上。乙型肝炎在全球因疾病造成的死亡中位列第10，且其与肺结核以及艾滋病被列为世界上最常见的三种传染病。因此对乙型肝炎病毒的研究非常有必要，而乙型肝炎的研究只能通过动物模型的建立来研究，因此不同的动物模型对乙肝的研究与防治尤为重要。 1.HBV转基因小鼠模型 1985年，Chisari等利用显微注射法，首次建立了HBV转基因小鼠模型[1]。 HBV转基因小鼠是在小鼠体内导入人HBV基因，以用来评价抗HBV药物的作用。细胞因子、siRNA等均对抗HBV，而用HBV转基因小鼠可很好的对这两种方法的治疗效果进行评价，从而选出最优方法。转基因HBV小鼠不会被HBV感染，因为转基因小鼠本身携带有HBV基因，因此会将外来的HBV组分当作自身组分而不会对其产生病理反应。但是，如果在HBV转基因小鼠体内注入CTL细胞，小鼠则可被感染，造成急性肝炎，因此可建立急性肝炎小鼠模型，利用这种小鼠模型可获得大量与HBV相关的免疫学信息。2.土拨鼠动物模型 土拨鼠属于啮齿类动物，在生物学上与人类有近似性。土拨鼠是土拨鼠肝炎病毒（WHV）的自然宿主[3]。土拨鼠WHV与人HBV的性质并不完全相同，故利用土拨鼠模型研究人类HBV时，存在一定限制。慢性感染WHV的土拔鼠在其生长过程中发生的病理变化表现与人类感染HBV的病理变化很相似[9]。有研究发现动物感染WHV还与动物的年龄、种类等也有关。因此，土拨鼠动物模型是良好的研究人类HBV病毒的动物模型，且其对抗病毒药物的评价与筛选具有良好的效果。 3.人鼠嵌合型动物模型 在正常成人肝脏中，肝细胞的中间丝细胞骨架中仅存在CK8 和CK18，而胆管上皮细胞比中间丝细胞骨架还多了CK7和CK19。在蒋黎[10]等人将人、鼠肝组织细胞进行嵌
眼睛发育分子机制及发展研究 姓名：王星学号：M201171507 导师：张贤钦 有关于眼睛发育的近期研究： 在2000年，美国科学家发现晶状体对眼睛发育起重要作用发表在《Science》：美国科学家对没有视觉的盲鱼进行健康晶状体移植手术后使之恢复了视力，由此表明晶状体具有激发盲鱼眼睛发育的作用。为了弄清晶状体在激发眼睛生长中的作用，研究人员将盲鱼和跟它有密切关系、具有视觉功能的同一类鱼进行眼睛互相移植实验。他们在实验前将盲鱼眼部退化的晶状体组织去掉，然后从明眼鱼的胚胎中取出晶状体早期组织，将之移植到发育中的盲鱼眼窝内。研究人员对每条盲鱼只移植一个晶状体，这样可以用同一盲鱼对比眼睛发育情况。8天之后，杰弗里等人注意到盲鱼眼部有所长大。两个月后，盲鱼长出了一个有清晰瞳孔、角膜和虹膜的大眼睛。此外，移植过晶状体的盲鱼眼睛的视网膜上还长出了感光细胞，这种细胞在盲鱼眼中原先不存在或极其稀少。另外，研究人员将盲鱼退化的晶状体移植到了有视觉的鱼眼中，但这一组织没有发育成正常的眼睛。这一发现将有助于研究人员找到与眼睛生长和发育有关的遗传因素。科学家指出，导致失明的原因很多，但他们的发现将帮助科学家从遗传角度找到影响眼睛发育的因素，并将最终帮助科学家弄清失明机理。 一、眼睛发育四个阶段：1、胚眼的发生和形成；2、眼球主要组成部分的发生；3、眼附属器的发育；4、出生后眼的发育。 第一阶段：胚眼的发生和形成，在神经胚形成之后，视窝、视泡来源于前脑泡头褶的两侧出现凹陷，称视窝，是眼的原基。视泡与表皮外胚层接触后，诱导该处的预定晶状体外胚层增厚，形成晶状体板，为晶状体始基。视杯早期下方为一裂缝，称为胚裂。围绕视杯的中胚叶组织经胚裂进入视杯内形成透明样血管系统（原始玻璃体动脉），营养视杯内层、晶状体泡及视杯间质。视裂于胚胎第五周开始闭合，由中部开始，向前后延伸，当胚长达17mm时，除视茎下面外，完全闭合。玻璃体动、静脉穿经玻璃体的一段退化，遗留一残迹，称玻璃体管（Cloquet管）；其近段分化为视网膜中央动、静脉。在视泡形成至胚裂闭合过程中，包绕视杯、视柄、晶状体泡的中胚叶逐渐分化为脉络膜始基和巩膜始基。此时，眼的各部组织已具雏形，即形成胚眼。 第二阶段：眼球主要组成部分的发生，（1）视网膜的形成：视杯外层形成视网膜色素上皮层，并保持为单细胞层。胚胎4周时，细胞内开始出现色素颗粒，至第5周时细胞内充满色素。视杯内层急剧进行细胞增殖，最终分化成视网膜感觉部（内9层）。二层之间的空隙不久消退，形成潜在间隙。（2）视网膜睫状体和虹膜的形成：胚胎第3个月时，视杯前缘向前生长，并包绕晶体，形成睫状体和虹膜内面的两层上皮。睫状体内面的上皮，外层有色素，内层无色素。而虹膜内面的两层上皮都有色素。虹膜中的瞳孔括约肌和瞳孔开大肌，也是从视杯缘的外层分化而来，属于外胚层组织。睫状肌由睫状体部位的中胚层增厚分化而成。（3）视神经的形成：由胚眼的视柄发育而来。逐渐增多的视网膜神经节细胞轴突向视柄内层汇集，视柄内层增厚并与外层融合。视柄细胞演变为星形胶质细胞和少突胶质细胞，与节细胞轴突混杂，于是视柄演化为视神经。仅视盘中央处有视柄细胞残留，出生时即萎缩形成生理凹陷。视神经的髓鞘由脑部沿视神经
?综述? M OD S 动物模型研究进展 胡 森(综述),盛志勇,周宝桐(审校) (解放军第三○四医院烧伤研究所,北京 100037) 基金项目:全军“九五”医学科研规划指令性课题(96L 053) 获奖项目:1996年解放军总后勤部科技进步一等奖(961102) 作者简介:胡 森(1959),男(汉族),山东临沂人,博士,副研究员,全军“九五”指令性课题负责人之一。主要研究严重创伤后全身炎症反应及多器官功能障碍综合征,已获国家科技进步三等奖1项,军队科技进步一等奖1项,二等奖2项,主编专著1部,发表学术论文50余篇。 中图分类号:R 365;R 332 文献标识码:A 文章编号:10030603(1999)08050404 多器官功能障碍综合征(M OD S )动物模型是研究M OD S 发病机制和临床防治的基础,同时也是M OD S 研究的一个难点。M OD S 是多因素诱发的临床综合征,发病机制复杂,再加上治疗因素的 干扰,使得模拟M OD S 的病理变化和临床特征十分困难。因此,建立标准化的和符合临床实际的M OD S 动物模型一直是国内外学者在探索的课题〔13〕。在本文中,作者将根据国内外M OD S 模型研究的进展,结合本人的研究经验,对M OD S 模型的标准化、 致伤因素等问题进行讨论,并介绍一些实用的M OD S 模型,供读者参考。 1 MOD S 模型的标准 复制M OD S 模型的目的在于:模拟M OD S 的发病因素、 病理过程和临床特征,研究M OD S 的发病机制及防治方法。根据90年代的最新认识,M OD S 是全身炎性反应综合征(S I R S )的常见并发症,多器官衰竭(M O F )仅是M OD S 的终末表现;而S I R S 是机体对各种致病因素〔包括感染和(或)非感染因素〕的全身炎症反应,脓毒症仅指感染引起的 S I R S 。正确理解上述概念,对于成功的 复制M OD S 动物模型具有重要意义。因此,作者认为,一个符合临床实际的理想的M OD S 实验模型应具备的标准是:①致伤因素与临床M OD S 常见诱因基本一致;②发病在致伤24小时以后;③有 S I R S 的表现;④有2个以上器官或系统 的功能障碍;⑤有足够的发病率和死亡率。 111 致伤因素:即在M OD S 模型复制 时,对动物施加的各种可能诱发或加重 M OD S 的损伤性因素。采用何种致伤因 素,主要根据M OD S 临床常见诱因、不同研究目的、动物种属和实验条件决定。根据临床常见M OD S 诱因,M OD S 模型的致伤因素主要包括各种休克、再灌注损伤、创伤和烧伤、感染或脓毒症、过度炎症、肺或肠屏障功能损害等。这些因素可以单独或复合使用,采用一次或多次打击施加于动物。必要的器官支持(主要是循环、呼吸和代谢支持)在复制符合临床实际的M OD S 模型过程中(尤其是双相迟发M OD S 模型),也是一种不可缺少的关键因素。此外,不同种属的动物对各种M OD S 致伤因素的耐受力和反应性差别较大,不同的研究目的和实验条件对致伤因素也有一定的要求。 112 M OD S 的诊断依据:根据临床M OD S 的定义,发病或较伤后24小时 以上出现M OD S 方可诊断,而24小时内发生M OD S 或死亡者,应视为复苏失败,与休克和创伤造成器官的直接损伤和死亡相区别。同样,动物M OD S 诊断也定在致伤后24小时。实验动物M OD S 的诊断依据与人类基本一致〔1,4〕,即:诱发因素+S I R S +多器官功能障碍。 113 S I R S 的表现:目前尚缺乏动物 S I R S 的诊断标准。 作者根据复制M OD S 模型的实践,在人类S I R S 临床诊断依据的基础上,提出以下动物S I R S 的诊断依据:①直肠温度较正常或伤前升高或降低1℃;②呼吸频率超过对照值2倍或PaCO 2较对照值降低25%;③白细胞总数超过对照值的2倍或减少50%;④心率较对照值增加50%。值得注意的是,受动物麻醉或紧张等因素的影响,常 难于测得准确的呼吸和心率。因此,上述几项中,采用直肠温度、PaCO 2、白细胞计数和分类的变化进行诊断相对较为准确。若实验条件许可,最好能持续监测动物的血流动力学和氧代谢指标的变化以及炎性介质的水平,以便更全面和精确地判断S I R S 发生的时间和程度。动物发生S I R S 时,心排血量减少,外周阻力增加,氧耗量和氧摄取增加,血浆急性期蛋白和多种炎性介质(如肿瘤坏死因子、白细胞介素和磷脂酶A 2等)水平升高;多脏器组织呈炎症改变。 114 多器官功能障碍:动物的多器官功 能障碍的诊断依据与人类基本一致,所采用的实验室诊断指标也大致相同。目前,国内外还没有统一和公认的动物器官功能障碍的诊断标准。各实验室往往根据其对M OD S 模型的认识、研究目的以及检测条件,制定各自的诊断标准。作者根据长期从事M OD S 动物模型研究的经验,也提出动物的多器官功能障碍诊断和评分标准供读者参考〔1,57〕。动物的诊断标准与人类比较有如下特点:①以实验室检查为主,以排除主观和治疗因素的影响;②动物标准多采用对照值 (尤其是自身对照),能减少种属和个体 差异的影响;③采用功能评分方法,以反映器官功能障碍的程度。 115 发病率和死亡率:一个理想的M OD S 动物模型应有较高的发病率和 死亡率,根据M OD S 早期诊断和防治研究的要求,较适宜的M OD S 发病率和死亡率应在50%以上。多次打击、复合致伤,特别是进行器官功能监护和支持能提高M OD S 模型成功率。 2 常用的MOD S 动物模型 211 一次打击模型(single h it model ): 一次打击模型又称单相打击模型,是指用单一致伤因素一次实施或者2个以上致伤因素同时或相继实施复制M OD S
疾病动物模型 1复制方法和应用 动物疾病模型的复制，是用人为的方法，使动物在一定的致病因素（物理的、化学的、生物的）作用下，造成动物组织、器官或全身一定损害，出现某些类似人类疾病的功能、代谢、形态结构方面的变化或各种疾病，通过这种手段来研究人类疾病的发生、发展规律，为研究人类疾病的预防、治疗（包括新药物试用）提供理论依据。所以动物疾病模型的复制，在医学科学研究中占有十分重要的地位。 目前我国生物医学科学研究中，动物疾病模型主要用于三个方面：即实验生物学、实验病理学和实验治疗学（新药筛选亦属于实验治疗学范畴）。由于研究目的不同，对于疾病模型的要求也有所区别。如实验病理学，它着重于研究用某种特定方法复制出某些疾病。整个疾病复制过程，就是它的研究内容，目的是通过疾病的复制去探讨疾病的病因学和发病原。而实验治疗学则完全不同，疾病的复制仅是它研究的开始，因为它的主要目的是为了阐明在该病的发生发展过程中，某些治疗措施或药物的疗效如何。 诱发性动物模型的复制方法不外是用生物的、物理的、化学的和各种环境因子作用于动物而产生。 生物学因素包括细菌、病毒、寄生虫、细胞、生物毒素、激素等各种致病原，通过接种而使正常动物发生疾病。如接种细菌、病毒于敏感动物使其产生各种传染病。目前已知的150余种人畜共患病提供了极有意义的传染病材料。从流行病学、病理学或并发症等不同角度研究，首先要充分了解动物与人在疾病易感性和临床表现等方面的同异处。例如轮状病毒可引起婴儿急性坏死性肠类，犬感染轮状病毒后的表现只是亚临床的。然而严重威胁幼犬的肠道病毒是细小病毒，而人对细小病毒则并不易感。 物理因素是多方面的。例如在机械力作用下产生各种外伤性脑损伤、骨折等模型，气压变动复制高空病、潜水病；温度改变产生各种烧伤和冻伤；放射线照射可复制各型放射病，引起免疫功能抑制或诱发Spragae-Dawley系大鼠乳腺癌；闪光刺激诱发癫痫模型；噪音刺激引起听源性高血压及改变行为记忆功能等。复
作者：吴俊杰，洪小珍，许先国，何吉，傅启华，严力行 【摘要】为了研究部分d表型的分子机理，用间接抗人球蛋白方法 (iat)筛选弱表达的d变异体，pcr-ssp（polymerase chain reaction-sequence sepecific primer）方法扩增rhd基因特异的外显子及其侧翼序列，用pcr产物直接序列分析测定核苷酸的变异。结果表明：从22例弱d中检测到10例部分d表型，其中d va（kou.）、d va（hus.）和d va-like （yh.）各1例，d vi type ⅲ表型7例。结论：10例部分d表型的分子机理得到明确，其中d va（kou.）、d va-like （yh.）表型为国内首次报道。 【关键词】 rh血型 molecular basis of partial d phenotypes in chinese rh血型系统是目前已知的29个人类红细胞血型系统中最复杂的一个［1］。rh血型的核心抗原包括rhd和rhce（主要有ce、ce、ce、ce 4种组合）蛋白，它们分别由1条417个氨基酸组成的肽链所编码。疏水性分析表明，它们都包括6个胞外环、12个跨膜区域和7个胞内环。rhd和rhce多肽链仅有30-35个氨基酸的差异。d 抗原因为具有较强的免疫原性在临床上有重要的意义。对d抗原表位的分类已经从最初的7个细分到37个［1］。通过鉴定这些表位，可以明确部分d的具体表型。但是，目前针对这些表位的一系列单克隆抗体谱散布于国外一些大型的输血医学研究机构和血型参比实验室中，只有通过国外会议交流或者私人赠送的途径才能获得。因此，单克隆抗体的匮乏影响了部分d表型的血清学鉴定。另外一个有效的途径是从基因水平去研究d变异体的分子机理，明确其变异位点，从而鉴定部分d。目前，d变异体的分子机理研究已经有很多报道，但是对部分d表型的分子机理研究主要集中在白人、非裔黑人和日本人中，在中国人群中的相关研究报道很少［1］。我们从弱d 中通过分子水平的研究鉴定了10例部分d表型，报道如下。 材料和方法 研究对象 以工作或者生活在浙江省的无偿献血员为研究对象。在2002-2004的3年研究期间，共收集到rh阴性样本1 272例。根据抗d试剂说明，对rh阴性血型做进一步的iat实验确认，筛查得到22例弱d样本。对弱d样本做rhd基因序列分析，发现其中10例为部分d表型，12例为弱d表型。本研究以10例部分d表型为研究对象。 rh表型血清学鉴定 rhd表型鉴定采用常规盐水平板法或试管法，使用加拿大dominion公司的navaclonetm 混合单克隆抗d试剂（人单克隆igm抗d，d175-2细胞株；人单克隆igg抗d，d415 1e4细胞株）。根据试剂说明，盐水实验rh阴性的rh血型用iat方法进一步确认。如果iat实验阳性，并且直接抗人球蛋白实验阴性，则鉴定为弱d表型或者部分d表型；如果iat实验阴性，则鉴定为rh阴性。抗人球蛋白试剂用美国immuco公司的兔源抗igg。rhc、rhc、rhe和rhe 鉴定采用盐水试管法，试剂为加拿大titus公司的单克隆抗体。 基因组dna提取 采用puregene dna 纯化试剂盒 (gentra，minneapolis，usa)，从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组dna，严格按试剂说明书操作。 d杂合性检测和单倍体型推测 根据perco等的方法［2］，用特异性引物u1-s和rnb31 pcr检测rhesus hybrid box。如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在rhesus hybrid box，有rhd基因的缺失；反之，则不存在rhesus hybrid box，没有rhd基因的缺失。最大可能的单倍体型根据rhce基因的c/c和e/e等位基因和rhd基因是顺式共遗传，并且rhd基因缺失的单倍体型按cde推算。