操作流程
1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
凝胶浓度Buffer GM使用量
1.0％3个凝胶体积量
1.0％～1.5％4个凝胶体积量
1.5％～
2.0％5个凝胶体积量
6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。
7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y H 除了选择合适的方法外,实验中还要注意以下几点: (1)防止抽提过程中污染DNA酶 与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末 端时也会导致严重的连接困难. (2)紫外照射选择长波段 回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射. (3)实验操作要轻柔 特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离 心管等操作均应缓慢,轻柔. 综上所述,只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段,为以后的酶切,连接,标记等工作打下良好基础. 3 实验步骤 一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例) (1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率) (2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN) (3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀. (4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒. (5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟. (6)重复步骤5一次. (7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm 离心2分钟. (8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放 置2分钟. (9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA 片段. 胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1) 增加电泳时的上样量。 2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。 Promega Corporation ·2800 Woods Hollow Road ·Madison, WI 53711-5399 USA Toll Free in USA 800-356-9526·Phone 608-274-4330 ·Fax 608-277-2516 ·https://www.doczj.com/doc/6716078911.html, Printed in USA.Part# TB308Revised 11/09Page 1 1. Description ..........................................................................................................12. Product Components and Storage Conditions ............................................33. General Considerations ....................................................................................44.Gel Slice and PCR Product Preparation .. (4) A.Preparing the Membrane Wash Solution (4) B.Dissolving the Gel Slice (5) C. Processing PCR Amplification Products (6) 5.DNA Purification (6) A.DNA Purification by Centrifugation (6) B.DNA Purification by Vacuum............................................................................76. Troubleshooting .................................................................................................97. References .........................................................................................................118.Appendix .. (11) https://www.doczj.com/doc/6716078911.html,position of Buffers and Solutions (11) B. Related Products (12) 1.Description The Wizard ?SV Gel and PCR Clean-Up System is designed to extract and purify DNA fragments of 100bp to 10kb from standard or low-melt agarose gels in either Tris acetate (TAE) or Tris borate (TBE), or to purify PCR products directly from a PCR amplification. Up to 95% recovery is achieved depending upon the DNA fragment size (see Table 1). PCR products are commonly purified to remove excess nucleotides and primers. This membrane-based system, which can bind up to 40μg DNA, allows recovery of isolated DNA fragments or PCR products in as little as 20 minutes, depending on the number of samples processed and the protocol used. The purified DNA can be used for automated fluorescent DNA sequencing, cloning, labeling, restriction enzyme digestion or in vitro transcription/translation without further manipulation.?Clean-Up System All technical literature is available on the Internet at https://www.doczj.com/doc/6716078911.html,/tbs Please visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Bulletin. Please contact Promega Technical Services if you have questions on use of this system. E-mail techserv@https://www.doczj.com/doc/6716078911.html,. 常用试剂的配制 1．无Ca2+、Mg2+Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO 3 0.175g Na 2HPO 4 ·12H 2 O 0.076g KH 2PO 4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中, 最后补加双蒸水至500ml, 以5.6%NaHCO 3调整 pH 值至7.4，4℃冰箱保存备用。 2．甲基红试剂 （1）成份 甲基红 0.1g 蒸馏水 200ml 95％乙醇 300ml （2）用途：测定甲基红反应。 3．Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO 4·7H 2 O 2g MgCl 2·6H 2 O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl 2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 原液乙： Na 2NPO 4 ·12H 2 O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 使用时甲,乙原液按下列比例配成Hanks 液使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，8磅20min灭菌，放4℃冰箱保存，使用前用NaHCO 3 调整PH值。 4．0.4%酚红溶液 称取0.4g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.lmol/LNaOH并不断研磨，直到所有的颗粒 几乎完全解，加入0.lmol/LNaOHl0ml，然后倒入容量瓶中，并加蒸馏水至l00ml,棕色瓶保存备用。 5．pH7.2 Tris-NH 4 CI溶液(红细胞崩解液） Tris (三羟甲基氨基甲烷) 1.03g NH 4 Cl（氯化氨) 3.735g 加双蒸水至500ml，用浓HCl调pH=7.2，10磅15min灭菌后放4℃保存。 6．0.05moI/L pH8.6 巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 加蒸馏水 200ml 加热溶解 巴比妥纳 10.3g 叠氮纳 0.2g 加蒸馏水溶解 , 并补加到 1000ml 。 7．磷酸盐缓冲液(PB) A 液：为 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液 ,NaH 2PO 4 ·H 2 O 27.6g, 溶于蒸馏水中, 最 后补加蒸馏水至 1000ml 。 B 液：为 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液 ,Na 2HPO 4 .7H 2 O 3.6g（或 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g, 或Na 2HPO 4 · 2H 2 O 35.6g ）, 加蒸馏水溶解，最后加水至 1000ml。若再加 蒸馏水至200ml则成为0.1mol/LPB。 8．0.1mol/LPH8.4 硼酸缓冲液（BBS） 硼酸钠（Na 2B 4 O 7 .10H 2 O） 0.46g 硼酸（H 2BO 3 ） 0.51g 加蒸馏水至100ml 溶解。9．PH7.4 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法一： 0.2mol/L Na 2HPO 4 （ Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g加蒸馏水至1000ml） 0.2mol/L NaH 2PO 4 （NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 35.6g加蒸馏水至1000ml） 取0.2mol/L Na 2HPO 4 81.0ml 加0.2mol/L NaH 2 PO 4 19ml,再加1900mlH 2 O和 17gNaCl即为PH7.4 0.01mol/L PBS。 PH7.4 0.01mol/L PBS再加入0.05%Tween-20即为ELISA试验的洗涤液。 配制方法二： 甲液（0.1mol/LKH 2PO 4 溶液）：KH 2 PO 4 13.608g，加蒸馏水至1000ml。 乙液（0.1mol/L Na 2HPO 4 溶液）：Na 2 HPO 4 35.814g，加蒸馏水至1000ml。 取甲液19ml，乙液81ml NaCl8.5g、Tween-20 0.5ml混合后加蒸馏水至1000ml即可。 来源于：财富网废旧橡胶回收利用的方法 废旧橡胶的回收利用主要有两种方法：通过机械方法将废旧轮胎粉碎或研磨成微粒，即所谓的胶粒和胶粉；通过脱硫技术破坏硫化胶化学网状结构制成所谓的再生橡胶。本文简单介绍一下胶粉的生产技术。 1、胶粉的制造方法 废橡胶的预加工。废旧橡胶制品中一般都会有纤维和金属等非橡胶骨架材料，加之橡胶制品种类繁多。所以在废旧橡胶粉碎前都要进行预先加工处理，其中包括分拣、去除、切割、清洗等加工。对废旧橡胶还要进行检验、分类，对不同类别、不同来源的废橡胶及其制品按要求分类，最理想是采用回收管理循环方法，根据废胶来源有目的地进行处理。对于废轮胎这类体积较大的制品，则要除去胎圈，亦有采用胎面分离机将胎面与胎体分开。胶鞋主要回收鞋底，内胎则要除去气门咀等。 经过分拣和除去非橡胶成分的废橡胶，由于长短不一，厚薄不均，不能直接进行粉碎，必须对废橡胶切割。国外对轮胎普遍采用整胎切块机切成25MMX25MM不等胶块。 废橡胶特别是轮胎、胶鞋类制品，由于长期与地面接触，夹杂着很多泥沙等杂质，则应先采用转桶洗涤机进行清洗，以保证胶粉的质量。 冷冻粉碎法。低温冷冻粉碎法的基本原理是：橡胶等高分子产材料处在玻璃化温度（TG）以下时，它本身脆化，此时受机械作用很容易被粉碎成粉末状物质，硫化胶粉即按此原理制成的。 冷冻粉碎工艺有两种：一种是低温冷冻粉碎工艺。另一种是低温和常温并用粉碎工艺。前者是利用液氮为制冷介质。使废橡胶深冷后用锤式粉碎机或辊筒粉碎机进行低温粉碎。微细橡胶粉生产线即是采用后一种方法进行生产的。利用液氮深冷技术把废旧轮胎加工成80目以上的微细橡胶粉，其生产过程中的温度、速度、过载均为闭环连锁微机控制，对环境无污染。该生产线的生产全过程均采用以压缩空气为动力的送料器和封闭式管道输送，除废旧轮胎投入和产品包装时与空气接触外，全线均为封闭状态。另外，由于采用冷冻法生产，无高温气味，所以不产生二次污染。并通过微细胶粉和粗粉的热交换过程达到了充分利用能源、降低能耗即降低产品成本的目的。 常温粉碎法。废橡胶经过预加工后进行常温粉碎，一般分粗碎和细碎。目前中国的再生胶工厂中常采用两种粉碎方式，一种是粗碎和细碎在同一台设备上完成；另一种是粗碎和细碎在两台不同的设备上完成。前者适合于小型工厂的生产厂生产。 粗碎和细碎同时进行的方式：进行该操作的两个辊筒其中一个表面带有沟槽，另一个表面无沟槽，即为沟光辊机。首先通过输送带将洗涤后的胶块送入两辊筒间进行破胶，然后将破碎后的胶块和胶粉落入设备底部的往复筛中过筛，达到粒度要求的从筛网落下，通过输送器入仓；未达到要求的胶块，通过翻料再进入沟光辊机中继续进行破碎。 1、如何计算提取率 1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率； 2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比； 3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。 2、如何简易测算提取率 取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5-10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。 3、如何看待提取得率 影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 4、回收率为什么与点样量和片段大小有关 DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。 5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因 1）胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例； 2）胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收； 3）紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内； 4）洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率； 5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好； 6）回收前的样品量太少，加大点样量； 7）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象 1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。 7、琼脂糖凝胶块不溶 1）琼脂糖质量不好； 2）含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃； 3）制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 胶回收方法全攻略 说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳片断回收没有1—2个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而 烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如 酶切连接、转化筛选、测序或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。 一、胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。 回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。 回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。 其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代，1973年冷泉港实验室的Joseph Sambroo k和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA 和EB染料观测DNA 相结合的技术。现在，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法： 1.柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，（区别在于这里）加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清， 就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，这样就避免了上述的问题。 3.低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。想当年经费紧张的时候，低熔点琼脂糖贵，不舍得这么浪费的，比较取巧省钱的法子就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再将那块家伙切出来，就可以非常非常节约了。除了直接酚抽低熔点琼脂糖凝胶，还有人用琼脂糖酶来消化琼脂糖凝胶，条件也相当温和，只是那酶价格并不便宜（光那酶的成本就至少5-6块，还不算其他的麻烦事），多数的酶只适合用低熔点琼脂糖，问题是我不用酶也可以直接酚抽，费时间还特长，所以，并不觉得特别好用。后来据说T家的琼脂糖酶可以用于常规琼脂糖，前提是你有办法在65度把那胶化了。但那需要极好的耐心。 Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量） 目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- 废橡胶现状及回收 橡胶材料在硫化后具有粘弹性、高弹性和电绝缘性，耐久性和耐溶剂性等性能都很优越，广泛应用于人们的生活和生产，其中在汽车轮胎和胶鞋等方面使用最多[1]。橡胶在硫化以后是一种热固性聚合物，由于它在硫化成型过程中，分子链间形成交联键，使整个分子呈空间网络状结构。受到分子链间交联键的作用，分子链无法移动，使橡胶材料不能溶于相关的溶剂中，在加热以后也不会熔化，使其在使用过后难以进行回收成型利用[2]。随着我国工业、农业跟交通运输的高速发展，橡胶的消耗量越来越大。目前，在废旧高分子材料中，废旧橡胶所占的比重仅次于废旧塑料的，其中又以废旧轮胎为主。由于废橡胶不会自然分解，使得废橡胶的量非常接近于橡胶的生产量，大量废旧轮胎的堆积和不适当处理，在造成资源浪费的同时，还严重的污染环境，造成“黑色污染”。将废旧轮胎进行适当处理和资源回收，不仅能够保护环境，还关系到高分子材料工业是否可持续发展[3]。 截至2011年，全球橡胶产品的总量已经达到了3100万吨，实现橡胶资源的回收再生利用，或者对废旧橡胶产品进行回收改性再利用，既能减少全球橡胶产品的生产和消耗，又能使产品广泛应用于其它领域，具有非常大的经济效益[2]。目前，脱硫、回收废橡胶的主要方法是通过物理、化学、微生物等方式使其脱硫化、解交联，将交联网络结构转变为线性可塑结构[4]。废橡胶具有很多的利用途径： 表1-1. 废橡胶综合利用的途径 1.1 废橡胶利用现状 目前，全世界每年产生的废橡胶有1000多万吨，而我国每年生产废橡胶约80 万~100万吨，自2002年起，我国的橡胶消耗量已经超过美国，持续成为世界第一大橡胶消耗国。同时，我国的橡胶资源非常紧缺，橡胶产量供不应求，充分回收利用我国的废旧橡胶资源，可以很大程度地缓解我国橡胶资源贫乏状况。橡胶再生利用主要是将废橡胶制成再生胶或者胶粉[5]。 目前国内废橡胶的回收利用状况与国外正好相反，国外的废橡胶利用是以废胶粉为主再生胶为辅，而国内废橡胶主要是用于制造再生胶，我国是再生胶生产第一大国，年产量已超过30万吨。尽管我国的再生胶生产已经较好的处理里国内生产的废橡胶，同时还解决了部分的环境污染问题，但是仍存在能耗大、效率低、生产流程长、工作条件差等缺点[2]。 在20世纪80年代后期，我国的胶粉生产开始起步，90年代时慢慢步入活跃期，使用不同的生产工艺陆续建成了一批工厂，并且有国有企业已在美国、加拿大和澳大利亚等国建设了胶粉厂，但由于我国废橡胶是有偿使用的，且废橡胶冷冻粉碎工艺的制冷剂液氮价格昂贵，导致国内橡胶冷冻粉碎技术的发展非常艰难，使得我国的胶粉生产的规模小，产量低，产业发展十分缓慢[6]。 1.2 橡胶的回收机理 橡胶的相对分子质量为10~100万，它在大的变形下能够迅速的恢复其变形，并且能够被改性，即硫化。硫化是指通过一定的温度、压力和时间后，使橡胶大分子与硫磺等物质发生化学反应，并交联形成具有三维网络状结构的高分子弹性体。因此，要把具有网络状结构的硫化橡胶再生成为具有线塑性结构的高分子材料，必须要选择性地破坏橡胶分子中已形成的交联键，即“脱硫”。橡胶再生的目的，就是通过物理、化学或其他的手段，把已硫化橡胶尽可能地还原为未硫化状态，即将橡胶中的多硫化物逐步转化一硫化物，最后将一硫化物切断，使其最终成为具有原来橡胶塑性的再生胶[7]。由于在脱硫过程中，橡胶主链有可能会与橡胶交联键同时被切断，导致主导橡胶性能的结构遭到破坏，使再生橡胶的分子量下降，影响其再使用性能，所以在脱硫过程中，要尽可能的保护C-C本身不被破坏，使交联键发生选择性断裂。 Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8 ●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。 来源于：注塑财富网https://www.doczj.com/doc/6716078911.html, https://www.doczj.com/doc/6716078911.html, 废旧橡胶回收利用的方法 废旧橡胶的回收利用主要有两种方法：通过机械方法将废旧轮胎粉碎或研磨成微粒，即所谓的胶粒和胶粉；通过脱硫技术破坏硫化胶化学网状结构制成所谓的再生橡胶。本文简单介绍一下胶粉的生产技术。 1、胶粉的制造方法 废橡胶的预加工。废旧橡胶制品中一般都会有纤维和金属等非橡胶骨架材料，加之橡胶制品种类繁多。所以在废旧橡胶粉碎前都要进行预先加工处理，其中包括分拣、去除、切割、清洗等加工。对废旧橡胶还要进行检验、分类，对不同类别、不同来源的废橡胶及其制品按要求分类，最理想是采用回收管理循环方法，根据废胶来源有目的地进行处理。对于废轮胎这类体积较大的制品，则要除去胎圈，亦有采用胎面分离机将胎面与胎体分开。胶鞋主要回收鞋底，内胎则要除去气门咀等。 经过分拣和除去非橡胶成分的废橡胶，由于长短不一，厚薄不均，不能直接进行粉碎，必须对废橡胶切割。国外对轮胎普遍采用整胎切块机切成25MMX25MM不等胶块。 废橡胶特别是轮胎、胶鞋类制品，由于长期与地面接触，夹杂着很多泥沙等杂质，则应先采用转桶洗涤机进行清洗，以保证胶粉的质量。 冷冻粉碎法。低温冷冻粉碎法的基本原理是：橡胶等高分子产材料处在玻璃化温度（TG）以下时，它本身脆化，此时受机械作用很容易被粉碎成粉末状物质，硫化胶粉即按此原理制成的。 冷冻粉碎工艺有两种：一种是低温冷冻粉碎工艺。另一种是低温和常温并用粉碎工艺。前者是利用液氮为制冷介质。使废橡胶深冷后用锤式粉碎机或辊筒粉碎机进行低温粉碎。微细橡胶粉生产线即是采用后一种方法进行生产的。利用液氮深冷技术把废旧轮胎加工成80目以上的微细橡胶粉，其生产过程中的温度、速度、过载均为闭环连锁微机控制，对环境无污染。该生产线的生产全过程均采用以压缩空气为动力的送料器和封闭式管道输送，除废旧轮胎投入和产品包装时与空气接触外，全线均为封闭状态。另外，由于采用冷冻法生产，无高温气味，所以不产生二次污染。并通过微细胶粉和粗粉的热交换过程达到了充分利用能源、降低能耗即降低产品成本的目的。 常温粉碎法。废橡胶经过预加工后进行常温粉碎，一般分粗碎和细碎。目前中国的再生胶工厂中常采用两种粉碎方式，一种是粗碎和细碎在同一台设备上完成；另一种是粗碎和细碎在两台不同的设备上完成。前者适合于小型工厂的生产厂生产。 粗碎和细碎同时进行的方式：进行该操作的两个辊筒其中一个表面带有沟槽，另一个表面无沟槽，即为沟光辊机。首先通过输送带将洗涤后的胶块送入两辊筒间进行破胶，然后将破碎后的胶块和胶粉落入设备底部的往复筛中过筛，达到粒度要求的从筛网落下，通过 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8μg DNA（70bp-10Kb），回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA 在高温下降解，然后在DE-B 溶液的作用下使DNA 选择性结合到膜上。纯化的DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 2ml离心管1.5ml离心管说明书 Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含DNA 保护剂，防止DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B：结合液（促使大于70bp 的DNA 片段选择性结合到DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（用100%乙醇或95%乙醇），混合均匀，室温密闭贮存。 Eluent：洗脱液，室温密闭贮存。 二、注意事项 1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇)、Buffer DE-B 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 2. 在步骤1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。 3. 在步骤2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。 4. 将Eluent 或去离子水加热至65°C，有利于提高洗脱效率。 5. DNA 分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0-8.5 洗脱液中保存。 三、实验准备 1. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 4. 使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C温浴加热熔化并冷却至室温后再使用。 四、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl 体积）。 2. 加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C 加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。 * Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3. 加0.5 个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA 片段小于400bp 时，需再加入1 个凝胶体积的异丙醇。 精品好文档，推荐学习交流 切胶回收的步骤 1．琼脂糖凝胶电泳目的基因，紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul） 2．尽量切碎凝胶 3．向离心管中加入3倍体积的NAL溶液，55（视具体胶定）度加热，使凝胶完全融化， 4．按每20ul硅胶树脂结合（树脂使用前要充分混匀）约3ugDNA加入适量比例的硅胶树脂，充分混合，室温放置20min， 5．10000rpm离心1分钟，去上清（上清液暂保存，如回收率不过可重复4） 6．加入800ul清洗液（清洗液加入56ml100%的无水乙醇），振荡混匀后，室温静置10min，10000rpm离心1分钟，去上清 7．重复步骤6，尽量去除上清，完全风干至不残留乙醇味道； 8．加入和硅胶树脂等体积的TEbuffer或灭菌蒸馏水混匀，55度水浴20min 9．10000rpm离心1分钟，吸上清为DNA回收液， 重复8，9初一语文讲义 辨析和修改病句的基本方法 辨析并修改病句是语文实际运用能力的具体表现之一，也是中考中长“考”不衰的常青树。本专题主要就是帮助学生了解句子的致病原因，掌握辨析和修改病句的基本方法，提高“诊断和施治”的能力。 “病句的辨析及修改”是近年来各地中考的重点，也是难点。这类题的主要考查方法有客观题和主观题两种。病句的辨析一般以客观选择题出现。这是一种比较传统的考察题型，它面广量大，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢1 精品好文档，推荐学习交流 以思维见长，是近年中考中常见的题型，也是学生最易失分的题目，这就要求同学们复习过程中要重视这一类题的复习和训练。 主观题多指修改性的题目，多用于对句子或文段的修改。不仅要求学生们了解这是病句，是什么样的病句，而且要求知道如何修改，难度更大。目前学生对病句尚处于感性认识的阶段，而且这种认识是分散和不完全的，往往还不能自觉地综合应用，这一专题的复习指导是非常必要的。 一、何为“病句” 如果一个句子文不从，字不顺，不合乎语法规范，那它就有语病。通俗地说就是，凡是读起来不通顺，感觉别扭、含混不清的句子都是病句。 二、如何辨析病句 （1）感读——凭语感，凡是读起来别扭，听起来含混的，就可能有语病。 如：她有一个女儿，同许多年轻的妈妈一样，愿意把孩子打扮的漂亮一些。 10． 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2胶回收
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