《生物制药工艺学》
第四章萃取分离法（答案）
一、填空题
1、常用的萃取方法有：单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取。
2、影响溶剂萃取的因素：乳化和破乳化、PH的影响、温度和苹取吋I'可的影响、盐析作用的影响、溶剂种类、用量及萃取方式的影响。
3、破乳方法有：加入表面活性剂、离心、加电解质、加热、吸附法破乳、高压电破乳、稀释法、超滤、反应萃収。
4、常用的破乳剂冇：阳离了表面活性剂、阴离子表面活性剂。
二、名词解释
1、液■液萃取：是指用一种溶剂将物质从另-?种溶剂（如发酵液）中提収出來的方法，根据所用溶剂的性质不同或萃取机制不同，可将液■液萃取分为多种类型。
2、萃取：在溶剂萃取屮，被提取的溶液称为料液，其屮与提取的物质称溶质，而用以进行萃取的溶剂称为萃取剂。料液与萃取剂接触后，料液中的溶质向苹取剂转移的过程称为萃取, 达到萃取平衡后，人部分溶质转移到萃取剂屮，这种含有溶质的萃取剂溶液称为萃取液，而被萃収出溶质以后的料液称为萃余液。
3、反萃取（slipping）：是将萃取液与反萃取剂（含无机酸或碱的水溶液，有时也可以是水）相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相，可把这种过程看作萃取的逆过程。
4、分配定律：即在一定温度，一定压力下，某一溶质在互不能相溶的两种溶剂间分配时, 达到平衡后，在两相中的活度Z比为一常数。
5、萃取因素：也称萃取比，其定义为被萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比，通常以E表示。
6^萃取率（percentage extraction）：生产上常用萃取率来表示一种萃取剂对某种溶质的萃取能力，计算萃取效果，其公式为：
7、分离因素：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。
三、问答
1、简述溶剂萃取法的优点。
答：①操作可连续化，反应速度快，生产周期短；②对热敏物质破坏少；③采用多级萃取时, 溶质浓缩倍数大、纯化度高。
2、简述选择萃取溶剂应遵守的原则。
答：①分配系数愈大愈好，若分配系数未知，则可根据“和似和容”的原则，选择与药物结构相近的溶剂；②选择分离因数人于1的溶剂；③料液与萃取溶剂的互溶度愈小愈好；④尽量选择毒性低的溶剂；⑤溶剂的化学稳定性要高，腐蚀性低，沸点不宜太高，挥发性要小, 价格便宜，来源方便，便于回收。
第五章沉淀法（答案）
一?填空
1.固相析出法主要包括盐析法,冇机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,结晶法及其它多种沉淀方
法等。
2.按照一?般的习惯，析出物为晶体II寸称为结晶法,析出物为无定形固体则称为沉淀法。
3.影响盐析的因素有：无机盐的种类、溶质（蛋口质等）种类的影响、蛋口质浓度的影响、
温度的影响、pH的影响
4.结晶包括三个过程：（1）形成过饱和溶液;（2）品核形成；（3）晶体生长。
5.影晶体大小的主要因素，归纳起來与过饱和度、温度、搅拌速度、晶种等直接冇关。
6.晶体的质最主要是指晶体的人小、形状和纯度等3个方血
二选择
1、在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作（A）
A.爲盐析法
B. B盐析法
C.重复盐析法
D.分部盐析法
2、当向蛋口质纯溶液小加入中性盐时，蛋口质溶解度（C ）
A.增大
B.减小
C.先增大，后减小
D.先减小，后增大
3、盐析法与有机溶剂沉淀法比较，其优点是（B ）
A.分辨率高
B.变性作用小
C.杂质易除
D.沉淀易分离
4、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（C ）
A.增人
B.减小
C.先增大，后减小
D.先减小，后增大
5、盐析常数Ks是生物大分子的特征常数，它与下列哪种因素关系密切。（B ）
A.盐浓度
B.盐种类
C.溶质浓度D介质pH
6、将配基与nJ溶性的载体偶联后形成载体■配基复合物，该复合物町选择性地与蛋白质结合，在一?定条件下沉淀出来，此方法称为（A）
A.亲和沉淀
B.聚合物沉淀
C.金属离子沉淀
D.盐析沉淀
7、将四环素粗晶溶于pH2的水中，用氨水调pH4.5—4.6, 28 —30°C保温，即有四环素沉
淀结晶析出。此沉淀方法称为（B ）
A.有机溶剂结晶法
B.等电点法
C.透析结晶法
D.盐析结晶法
8、影响体人小的主要因素与下列哪些因素无关（D ）
A.过饱和度
B.温度
C.搅拌速度
D.饱和度
9、下列沉淀试剂不属于表而活性剂的是（D）
A. CTAB
B. CPC
C. SDS
D. PEG
三名词解释：
1.盐析法：是利用各种生物分子在浓盐溶液屮溶解度的差异，通过向溶液屮引入一定数最的小
性盐，使目的物或杂蛋口以沉淀析出，达到纯化目的的方法。
2.Ks盐析：在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。Ks
盐析法多用于提取液的询期分离工作。
3?[3盐析：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作B盐析法。在分离的后期阶段，为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的冃的，冇时应用B盐析法。B盐析法由于溶质溶解度变化缓慢且变化幅度小，沉淀分辨率比岳盐析法好。
4.亲和沉淀：利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋口质结合，在一定条件下沉淀出来。
四问答
1 ?什么是盐析作用？盐析的原理是什么？
答：盐析作用：向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐，在高盐浓度时，蛋白质溶解度随Z减小, 发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分川和了蛋口质的电性，使蛋口质分子之I'可电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。盐析作用的另一个原因是山于中性盐的亲水性比蛋口质大, 盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。2.如何选择盐析所用中性盐？
（1）盐析作用要强。一般來说多价阴离子的盐析作用强，有时多价阳离子反而使盐析作用降低。
（2）盐析用盐要有足够大的溶解度，且溶解度受温度彫响应尽对能小。这样便于获得高浓度盐溶液，冇利于操作，尤其是在较低温度下的操作，不致造成盐结晶析出，影响盐析效果。（3）盐析用盐在生物学上是惰性的，不致彩响蛋白质等生物分子的活性，最好不引入给分离或测定带來麻烦的杂质。
（4）来源丰富、经济。
3.有机溶剂沉淀的原理是什么？
答：亲水性冇机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分了Z间的静电引力增加, 聚集形成沉淀；水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了白由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
4.有机溶剂沉淀影响沉淀效來的因素有那些？
答：（1）有机溶剂种类及用量
（2）pH的影响
（3）温度无机盐的含量
(4)某些金属离了的助沉淀作用
(5)样品浓度
第六章吸附分离法(答案)
一、填空
1、吸附剂按其化学结构可分为两大类：一类是冇机吸附剂，如活性炭、淀粉、人孔吸附树脂等;另一类是无机吸附剂，如口陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。
2、常用的吸附剂有活性炭、硅胶和门陶土等。
3、大孔网状聚合物吸附剂是在树脂聚合吋加入惰性致孔剂,待网格骨架固化和链结构单
元形成后，用溶剂萃取或蒸钿水洗将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的孔隙，其孔径远人于2?4nm,可达l()()nm ,故称“人孔”。
4、大孔网状聚合物吸附剂按骨架的极性强弱，可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。
二、选择题
1、用大网格高聚物吸附剂吸附的弱酸性物质，一燉用下列哪种溶液洗脱(D )
A.水
B.高盐
C.低pH
D.高pH
2、“类似物容易吸附类似物”的原则，一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质
(B )
A.极性溶剂
B.非极性溶剂
C.水
D.溶剂
3、“类似物容易吸附类似物”的原则，一般非极性吸附剂适宜于从下列何种溶
剂屮吸附非极性物质。(A )
A.极性溶剂
B.非极性溶剂
C.三氯甲烷
D.溶剂
4、下列属于无机吸附剂的是：(A)
A.白陶土
B.活性炭
C.淀粉
D.纤维素
5、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强？(A)
A.水
B.甲醇
C.乙醇
D.三氯甲烷
6、关于人孔树脂洗脱条件的说法，错误的是：(A)
A ?最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。
B.对弱酸性物质可用碱来解吸。
C.对弱碱性物质可用酸来解吸。
D.如吸附系在鬲浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。
三、名词解释
1、吸附法(adsorption method)：指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸
附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和朵质间吸附能力的差界, 使冃的
物和其它物质分离，达到浓缩和提纯冃的的方法。
2、大网格高聚物吸附剂(macroreticular adsorbent)：在合成树脂时，加入一种惰性组
分，它不参与聚合反应，但能和单体互溶，称为致孔剂。待网络骨架固化和链结
构单元形成后，用溶剂萃取或水洗蒸饰的方法将致孔剂去掉，就留下了不受外界
条件影响的永久孔隙，其孔径远大于2?4nm,可达到lOOnm甚至lOOOnm以上，
故称“大孔”。与大孔网状离子交换树脂相比，它不含离子交换树脂的功能团，
仅保留了多孔的骨架，其性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似, 称为人孔网状聚合
物吸附剂。
四、问答题
1、简述吸附法的定义和特点。
吸附法(adsorption method)指利川吸附作川，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差界，使口的物和其它物质分离, 达到浓缩和提纯目的的方法。吸附法具有下列特点：
(1)设备简单、操作简便、价廉、安全。
(2)少用或不用有机溶剂，吸附与洗脱过程中pH变化小，较少引起牛.物活性物质的变性失活。
(3)天然吸附剂(特别是无机吸附剂)的吸附性能和吸附条件较难控制，吸附选择性差，收率不高，难以连续操作。
2、影响吸附的因素有哪些？
①吸附剂的特性：
吸附现象在界血发生，因此吸附剂比表面积愈大，吸附量愈多。通过活化的方法也可增加吸附剂的吸附容量。另外还要求吸附剂的机械强度好，吸附速度快
②吸附物的性质：
能使表而张力降低的物质，易为表而所吸附；一?般极性吸附剂易吸附极性物质，1F?极性吸附剂易吸附非极性物质；溶质从较易溶解的溶剂屮被吸附时，吸附量较少；对于同系列物质，吸附量的变化是有规则的；吸附物若能与溶剂形成氢键，则吸附物极易溶于溶剂Z中。
吸附条件:
温度：吸附热越人，温度对吸附的彩响越人。
PH值：溶液的pH值溶液pH值可控制吸附剂或吸附物解离情况，进而影响吸附量，对
蛋口质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大。
盐浓度：
溶剂的影响：单溶剂与混合溶剂对吸附作用有不同的影响。
@吸附物浓度与吸附剂用量
-般情况下吸附物浓度人时，吸附量也人。
第七章凝胶层析
一、填空题
1、凝胶层析的分离原理有凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动分离理论。这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下平衡排除理论起主导作川;扩散分离理论的作用随流速增加而加强;只有在流速很高时流动分离理论才起作用。
2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而上隆，
颗粒强度随浓度上升而提高。
3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率髙，多丿IJ于精制分离一等。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，多用于多用于脱盐等。
4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积人25 倍以上的林体积,
25 以上的柱比,较大吸液量、较细粒的凝胶固定和。5、溶质通
过色谱柱时造成的峰加宽效应包括分子扩散、涡流扩散、流动和中传质阻力、固定相屮传质阻力。
6、葡-聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度,其越小，凝胶孔径越一大；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度°
二、选择题
1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>l,其原因是（B ）
A.凝胶排斥
B.凝胶吸附
C.柱床过长
D.流速过低
2、凝胶层析中，冇时小分子溶质的Kd （A） A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（B） A.分子量最人的 B.体积最人的 C.分子量最小的 D.体积最小的 4、为了进一步检杳凝胶柱的质量，通常用一种人分了的有色物质溶液过柱，常见的检杳物 质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（C）A.观察柱床有无沟流 B.观察色带是否平整 C.测量流速 D.测量层析柱的外水体积 5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是 （A ） A.粗口长的 B.粗且短的 C.细几长的 D.细几短的 三、名词解禅 1 全排阻： 当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较大的分子完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。 2、类分离： 将分了址极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离?选择凝胶时，应使样品中人分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。大分子的分配系数Kd=O,小分子的Kd=lo 3、分级分离：将分了量相差不大的大分了物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，分级分离应尽量使待分离各物质的Kd值相差人些，并使分子量分布不在凝胶分离范围的一侧。 4、柱比：层析柱的长度与总径的比值一般称作“柱比”。 5、操作压：凝胶层析柱由于进出口之间液位圧力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。 6、全渗入：被分离组分的分子量小于该种凝胶的渗入限，其分子可以H由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。其流经体积最大，等于外水体积与内水体积Z和，V0 + Vi。 7、分离度Rs： 式中Vel> Ve2——对应于两个峰的淋出休积；Wl、W2和。1、。2——两个峰宽度和标准偏差。 四、问答题 1、试述公式Ve=VO+KdVi各字母的物理意义。 答：公式Ve=VO+KdVi中Ve代表被分离组分的流经体积，V0代表外水体积，Vi代表内水体积。Kd称作“排阻系数”或“分配系数”，它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。对一定种类规格的凝胶，物质的Kd值为该物质的特征常数。排阻系数： 当Kd=l时，洗脱体积Ve=VO+Vi,为全渗入。 当Kd=O时，洗脱体积Ve=VO,为全排卩11。 0 2、利用凝胶层析如何测定蛋片质的分了量？ 答：当具冇一定分了虽分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分了在柱中停留时间比大分子停留的吋间耍长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2 分）。对于一个特定休系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式 Ve=-KlogM +C 先以3个以上（最好更多些）的己知分子量的标准蛋口过柱，测取各占的Ve值。以Ve作纵坐标，logM作横他标制作标准曲线（2分）。在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分了量（2分）。 3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。 当具冇一定分了虽分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分了在柱中停留时间比大分了停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。应用： 一、脱盐：脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。此时溶液中蛋白质等大分子的 Kd=O,盐类的Kd=U由于交联度人，凝胶颗粒的强度较好，加之凝胶粒度人，柱层操作比较便利，流速也高。 二、分子量测定：对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式 Ve=-KlogM+C 先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各口的Ve值。以Ve作纵绝标,logM作横处标制作标准曲线。在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可山标准曲线求得分子量。 三、分离纯化：根据分了量不同流岀先示顺序不同，收集单一洗脱峰的物质，得以纯化。 第八章离子交换法 一、填空题 1、离子交换剂由惰性的不溶性载体、功能基团和平衡离子组成。平衡离子带丄电荷为阳离了交换树脂，平衡离了带负电荷称阴离了交换树脂。 2、常见的离了交换剂有离了交换树脂,离了交换纤维素,葡聚糖凝胶离了交换剂等。 3、离子交换树脂的基本要求有有尽可能人的交换容最、有良好的交换选择性、化学性质稳定、化学动力学性能好和物理性能好o 4、影响离子交换选择性的因素主耍有离子价与离子水合半径、离子价与离子浓度、交换环境、树脂结构、偶极离了排斥等。 5、请写岀下列离子交换剂的名称和类型：CM-C的名称是竣甲基纤维素,属于弱酸型阳离了交换纤维索;DEAE-C的名称是二乙基氨基乙基纤维素,属于强碱型阴离f交换纤维素:。 6、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨的新型的蛋口质纯化技术。它是根据蛋口质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱,能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率很高，操作简单。 7、写出下列离子交换剂类型：732强酸型阳离了交换树脂,724弱酸型阳离了交换树脂， 717 强碱型阴离了?交换树脂,CM-C阳离了交换纤维索,DEAE-C阴离了交换纤 维素 ,PBE94 阴离子交换剂o 8、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点Z pH 值下降到蛋白质组分PI（等电点）值以下时，它因带正电荷而下移，如果柱屮有两种蛋白组分,pl值较人（高）者会超过另一组分,移动至柱下部pH较高 的位点进行聚焦（交换）。 9、影响离子交换选择性的因素有离子水合半径、离子价与离子浓度、交换坏境、树脂结构、偶极离子排斥。 二、选抒题 1、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为（C） A.偶极排斥 B.离了竞争 C.解离低 D.其它 2、在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量（C ） A.梵型阴 B.氯型阴 C.氢型阳 D.钠型阳 3、在尼柯尔斯基方程式中，K值为离子交换常数，K>1说明树脂对交换离子吸引力（）。 A.小于平衡离子 B.大于平衡离子 C.等于平衡离子 D.其它 三、名词解释 1、蛇笼树脂：由内烯酸或甲基内烯酸在季胺型阴离子交换树脂（如Dowex）H喋合而成的-?类树脂称蛇笼树脂。它是-?种两性树脂，它适宜于从有机物质（如甘油）水溶液中吸附盐类，再生时用水洗，就可将吸着的离子洗F来。 2、尼柯尔斯基方程式：即 其屮ml、m2及Cl、C2分别代表树脂上和溶液屮的两种离子的浓度。K值的人小取决于树脂和交换离子的性质，以及交换条件。K>1时说明离子Al比离子A2对树脂有较人的吸引力；反之，K<1时树脂对A2的吸引力大于A1。 3、偶极离子排斥作用：许多生化物质都是两性物质。其中有些是偶极离子。因为它们即使净电荷为零时，止电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。偶极离了在离了交换过程中的行为是很特殊的。现以氨基酸的离子交换为例。 式中由于使用了钠型树脂,被吸附氨慕酸的竣基所带的负电荷与树脂碱酸基Z负电荷产生排斥力。这就是所谓偶极离子的排斥作用。因此使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。 四、问答题 1、简述离子交换纤维素的特点有哪些？ 答：离子交换纤维素的特点是：离子交换纤维素为开放的长链骨架，人分子物质能自山地在其中扩散和交换，亲水性强，表而积大，吸易附大分子；交换阜团稀疏，对大分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨力强，能分离复杂的生物人分子混合物。 2、请以CM-C为例说明离子交换纤维索分离纯化蛋口质时的洗脱方法有哪些？并说岀各种方法的洗脱原理。 答：无论是升高环境的pH还是降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。现以竣甲基纤维素为例加以说明，图中H2N-P表示蛋白质，C表示纤维素。 （1）、升高环境的pH,使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与CM-C结合力而被洗脱下來。 （2）、降低环境的pH,使CM-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋口质而被洗脱下来。（3）、用高浓度的同性离子根据质量作用定律将冃的物离子取代下来。 3、请以DEAE-C为例说明离了交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法冇哪些？并说出各种方法的洗脱原理。 答：无论是升高环境的pH还是降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱卜?來。（1）、升高环境的pH,使DEAE-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋白质而被洗脱下来。（2）、降低环境的pH,使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与DEAE-C结合力而被洗脱下来。 （3）、用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下來。 4、由下图,利用给出的两种离子交换剂（El, E2）分离3种蛋白质（Pl、P2、P3）,用箭头流程图表示（并指出El, E2的类型）。 E1为阴离了交换剂 E2为阳离子交换剂 5、下图为离子交换法应用实例，请填写生产工艺流程小的空格（可选因素：阴离子交换树脂，阳离子交换树脂,0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水）。简述从“滤液”开始，以后步骤的分离原理？ 答：阳离了交换树脂，0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水 滤液调节到P H2.5时，氨基酸带正电荷，因此选用阳离子交换树脂，之后根据氨基酸等电点的不 同,依次用0.05mol/L氨水，0.1moI/L氨水,2mol/L氨水洗脱。酸性氨基酸等电点低, 因此用 0.05mol/L氨水就可洗脱卜?來，而碱性氨基酸等电点高，因此需用2mol/L氨水才能将Z洗脱 下来。 第九章亲和纯化技术 一、填空题 1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱，特殊洗脱，专一性洗脱。 2、亲和力大小除山亲和对本身的解离常数决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境、载体空间位阻、载体孔径、配基和配体的浓度、配基结构等。 3、亲和层析中常用作分离酶的配基有酶抑制剂，辅酚，底物 和底物结构类似物。 4、亲和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水基团、复合亲和力。 5、亲和过滤指的是将亲和层析和膜过滤技术结合运用，它包括亲和错流过滤 和亲和膜分离两大方法。 二、选择题 1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是（B ） A.载体必须能充分功能化。 B.载体必须有佼好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。 C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。 2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是（A ） A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作 （C ） A.阴性洗脱 B.剧烈洗脱 C.竞争洗脱 D.非竞争洗脱 4、亲和层析的洗脱过程小，在流动相中减去配基的洗脱方法称作（D ） A.阴性洗脱 B.剧烈洗脱 C.正洗脱 D.负洗脱 三、名词解释 1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）： 是指在反胶团和中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另-种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表而活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性。 2、亲和膜： 利川亲和配慕修饰微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化冃标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。将一张微滤膜比喻为一?个固定床，则膜厚即为床层高度.优点是传质阻力小，达到吸附平衡的吋间短，配基利用率髙；压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。 3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）: 利用在物理场（如pH、离了强度、温度和添加金属离了等）改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配忠制备亲和沉淀介质。亲和介质结合冃标分了后, 通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法成为二次作用亲和沉淀。 4、亲和萃取： 利用聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）或聚乙二醇/无机盐等双水相系统萃取分离蛋111质等大生物分了，特别是胞内酶的双水相萃取法。利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配棊的亲和结合作用下促进冃标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。 5、亲和吸附剂： 山载体及配基偶联构成，在亲和层析中起可逆结合的特界性物质称为配基（Ligand）,与配革结合的层析介质称为载体（Mnlrix）。 6、负洗脱：在双底物反应屮，与配基互补的酶的亲和吸附，如果吸附取决于A物的存在与否，则洗脱液中除去A物时，吸附在配基上的互补分子也会洗脱下来，这种洗脱方法也称负洗脱。 四、问答题 1、亲和层析的原理是什么？主耍特点是什么？ 答：亲和层析的设计和过程大致分为以下三步：1）配棊固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶链，或共价结合成具冇特异亲和性的分离介质；2）吸附样品：亲和层析介质选样性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；3）样甜解析：选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其他牛?物活性物质解析下柱。 亲和层析技术的最大优点在于，利川它从提取液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。此外亲和层析还有対设备要求不高、操作简便、适用范围广、特界性强、分离速度 快、分离效果好、分离条件温和等优点：其主要缺点是亲和吸附剂通用性较差，故要分离一种物质差不多都得重新制备专用的吸附剂。另外山于洗脱条件较苛刻，须很好地控制洗脱条件，以避免生物活性物质的变性失活。 2、对亲和层析的公式进行说明。设KL=10-7,求[L0] （6分） Ve为洗脱体积（1分）； V0固定相（柱床）体积（1分）； [L0]为固定化配基浓度（1分）； KL为亲和对解离常数（亲和势）（1分）； 只冇当阻留值210时，亲和层析才是冇效（分离）的。 1+[LO]/KL N10,将KL=10-7 代入得：[L0]/10-7>9,所以,[L0]^9X10-7 （2 分）。 3、何谓“手臂” ？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？ 答：有吋候用小分子物质（如酶的辅因子）作为配基直接偶联至琼脂糖凝胶珠粒上制备亲和层析介质时，尽管配基和酶间的亲和力在合适的范I韦I内，但其吸附容量往往是低的。这是由于酶的活性中心常是埋藏在其结构的内部，它们与介质的空间障碍影响其与亲和配棊的结合作用。为了改变这种情况可在载体和配基间插入一个物质称为“手臂”，以消除空间障碍。 手臂的长度是有限的，不可太短也不可太长，太短不能起消除空间障碍的作用，太长往往会使非特界性吸附增加。 4、从亲和沉淀的机理和分离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。 答：从亲和沉淀的机理和分离操作的角度可以看出，亲和沉淀纯化技术具有如卜?优点：1）配基与目标分子的亲和结合作用在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；2）亲和配基裸露在溶液Z中，可更有效的结合目标分子，即亲和沉淀的配基利用率高；3）利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大；4）亲和沉析法可用于高粘度或含微粒的料液中冃标产物的纯化，因此可在分离操作的较初期采用，有利于减少分离操作步骤，降低成木。同时，在分离过程的早期阶段除去对冃标产物冇毒的杂质（如蛋H酚），冇利于提高日标产物质最和 第十章离心技术 收率。 一、填空： 1、制备型离心机的转子有—角度_转子、_水平—转子、垂直_转子、区带。—转子。 2、密度梯度的制备方法有:手工制备法、梯度混合仪制备法、离心形成法反复冻融法 3、梯度的取出和收集方法：取代法、穿刺法、切割法、虹吸法 二、选择题： 在离心分离过程中，若离心机的转速为4000转/分种，离心半径为10厘米，则相对离心力为 （A ） A. 1789 (g) B. 4000 (g) C. 8000 (g) D. 2000(g) 三、名词解释: 1、相对离心力：山于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 2、离心力：在一定角度速度下作闘周运动的任何物体都受到的向外的力。离心力（Fc）的人小等于离心加速度宀2i?与颗粒质最m的乘积，即：F=m w2r 3、沉降速度：即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。 4、沉降系数：在单位离心力场中，颗粒的沉降速度谓Z “沉降系数” 四、问答题 1、试述等密度离心法及其特点。 2、试述差分离心法： 3、试述速度区带离心法及其特点。 4、密度梯度介质应具备哪些基本条件？ 5、影响沉降速度的因素冇哪些？ 6、简述螺旋卸料离心机的特点 7、密度梯度离心常用的介质有哪几类 四、问答题 1、答：当不同颗粒存在密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到与其密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，这种离心分离方法称为等密度离心法。 等密度离心法是根据颗粒的密度差异进行的离心分离的一种方法。 特点： （1）加样位置口由. （2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间的影响。 （3）梯度的密度范I韦I包括样品所冇组分颗粒的密度。 （4）分离依据是密度，与颗粒大小形状无关。 （5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状、黏度等影响离心时间和分辨率。 2、答：差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。 过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一?定吋间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再 用加大的离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。 3、答：概念： 在离心前于离心管内先装入连续或不连续的密度梯度介质(如蔗糖、甘汕、KBr、 CsCl等)，待分离的样站铺在梯度液的顶部同梯度液一起离心，控制离心吋间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成一系列区带，达到各组份彼此分离的H的。特点(1)样品在介质顶部。 ⑵ 最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即P > P O O样品溶液的密度v梯度密度最小值。 (3)离心时间要严格控制，既要有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在所冇粒了一起沉淀。如果离心时间过长，所冇的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。 (4)分离依据是个组分Z沉降系数。 (5)分辨率受组分沉降系数，离心吋间，颗粒扩散系数，介质黏度及梯度范围和形状的影响。4、答：(1)梯度介质应口身密度大，口溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度(2)理化性质稳定，生物惰性；离了强度低，渗透压小，粘度小。 (3)具某种可测性(如折射率)以测其浓度(密度)，但不干扰分离组分的测定。 (4)便于除去或回收。此外还有纯度，价格筹因素。 5、答：沉降速度的计算公式为 式中3为角速度，x为离心半径，d为粒子的直径，八为离心介质的粘度，P()介质密度P 粒了密度，u为沉降速度。 从公式可知：粒子的沉降速度与a)2 , x (P-PO) d2成正比，而与H成反比。 6、答：螺旋卸料离心机的重要特点是： ①料液浓度变化不影响分离效率，适应范围广，从1%的稀悬浮液到50%的浓悬浮液的分离都适用；②对固体颗粒大小适应范围广；③占地而积小，处理量大；④一般耐受压力为1.01 X 105Pa 左右，特殊型号可耐受压力为1.05X106Pa,并可用于易燃、易爆及密闭的含冇毒物的操作场合； ⑤对难于沉降的固体颗粒，可通过调节转鼓与螺旋的转速羌来提高分离效率；⑥可加入凝聚剂， 令其与物料接触，以加快固体沉降作用。 7、答：（1）盐梯度介质；（2）小分子有机物如蔗糖；（3）三碘化苯衍牛:物；（4）有机高聚物；⑸ 胶态二氧化硅
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