中国农业科学 2008,41(6):1822-1831 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.06.033
收稿日期：2007-05-04；接受日期：2008-01-08
基金项目：中央级院所社会公益性项目（2005DIB4J051）和上海科技兴农项目（2006710-4） 作者简介：张建武（1974-），男，河南舞阳人，博士，研究方向为动物病毒与基因工程。Tel ：021-********；E-mail ：lxxzjw@https://www.doczj.com/doc/6211665064.html, 。通讯作者袁
世山（1964-），男，山东章丘人，研究员，博士，研究方向为动物病毒与基因工程。Tel ：021-********；E-mail ：shishanyuan@https://www.doczj.com/doc/6211665064.html,
中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征
病毒的分子流行病学研究
张建武，庄金山，袁世山
（中国农业科学院上海兽医研究所/中国动物卫生与流行病学中心上海分中心猪传染病防治研究室/农业部动物寄生虫学重点开放实验室，
上海 200232）
摘要：【目的】对来自2006年猪病流行爆发地的组织样品进行多种病毒的检测，确定引起本次流行的致病病原及PRRSV 的分子流行病学特征。【方法】利用（RT-）PCR 对采集的样品进行PRRSV 北美型和欧洲型、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）以及瘟病毒的检测，对PRRSV 阳性的进行ORF5的序列测定并分析。【结果】检测到16份PRRSV 北美型阳性样品，PCV2阳性样品2份，其它病毒均未检到。PRRSV ORF5序列分析表明笔者分离到的PRRSV 株可分为2个群。【结论】（1）PRRSV 与2006年肆虐中国养猪业的猪病流行有直接关系；（2）2006年PRRSV 流行株主要是以JX0612株为代表，但不同遗传特征的PRRSV 也在流行。
关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF5；分子流行病学调查；遗传进化分析
Molecular Epidemiology Study on High Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Some Regions of China
ZHANG Jian-wu, ZHUANG Jin-shan, YUAN Shi-shan
(The Key Laboratory of Animal Parasitology, Chinese Ministry of Agriculture/Department of Porcine Infectious Diseases,
Shanghai Veterinary Research Institute, China Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200232)
Abstract:【Objective 】Various viruses were detected from tissue samples of porcine disease epidemic in 2006. Etiology of this epidemic and molecule epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus were determined. 【Method 】PRRSV North America type and Europe type, porcine circovirus Ⅱ, porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus, Japanese encephalitis virus and Pestivirus were identified by (RT-)PCR from tissue samples. Sequence of PRRSV ORF5 was amplified and analyzed. 【Result 】16 PRRSV North America type positive samples and PCV2 positive samples were detected; other viruses were not detected. Sequence analysis of PRRSV ORF5 indicated that the isolated PRRSV strains could be divided into two groups. 【Conclusion 】(1) PRRSV was the causative agent of porcine disease epidemic in 2006. (2) PRRSV prevalence strain was strain represented by JX0612, however defferent genetic characteristic PRRSV strains also spread in China.
Key words: High pathogenicity porcine reproductive and respiratory syndrome virus ；ORF5；Molecule epidemiology ；Genetic
evolution analysis
0 引言
【研究意义】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS ），俗称“蓝耳病”，是由PRRS 病毒（PRRSV ）引起的一种
高度接触性传染病，主要临床表现为妊娠母猪流产、早产、死胎以及仔猪和育肥猪的呼吸道症状。目前PRRSV 在中国猪群中感染率高，所致经济损失巨大。2006年始于南方各省进而蔓延全中国的以高热为特征猪病的爆发流行，给当地养猪业带来了沉重的打击。
6期张建武等：中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究 1823
国内多位学者研究初步确定这次流行的主要致病病原为PRRSV，但为何这次PRRSV造成的损失如此之巨？它与经典的PRRSV毒株有何异同？有没有其它病原的参与？至今都困惑着广大兽医科技工作者。【前人研究进展】PRRS首先发现于20世纪80年代的美国北卡罗来纳州[1]，致病病原PRRSV于20世纪90年代初相继分离于欧洲[2]和美国[3]；自郭宝清等1996年首次发现并分离到PRRSV[4]以来，PRRS危害有增无减，近年来，PRRSV致病力似有所增强，表现为感染PRRSV的怀孕母猪流产和死亡率增高[5,6]，这些所谓非典型性（atypical）PRRSV可导致免疫猪群的“流产风暴”（abortion storm）[7,8]。另外，在PRRS高发猪群中分离到了嗜神经型（neurotropic）PRRSV[9]，提示PRRSV的靶组织或器官可能在扩大和改变。同时，因PRRSV 靶细胞为免疫系统重要的肺泡巨噬细胞，感染猪大多因免疫抑制而导致继发感染。PRRSV 常见与猪胸膜肺炎支原体、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）、以及猪圆环病毒2型（porcine circovirus-2，PCV-2）混合感染。后者造成使养猪业日益恐慌的猪产后多系统衰竭综合症（post-weaning multi-system syndrome，PWMS）。PRRSV与马动脉炎病毒（equine arteritis virus，EAV）、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV）和猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus，SHFV）同属于套式病毒目（Nidovirales）的动脉炎病毒科（Arteriviridae）[10~12]。PRRSV基因组为大小约15 kb、不分节段的单链正股RNA。PRRSV的欧洲型与北美洲型的分子与抗原间差异性很大，核苷酸同源性大约为63%[13]，且PRRSV遗传及抗原性差异很大且易发病毒间重组，导致病毒基因组极易发生变异，其中，PRRSV基因组中ORF5是高变区之一，其编码蛋白又是PRRSV主要的宿主保护性抗原，ORF5的变异从而直接导致PRRS疫苗株交叉保护率低下，这无疑对本病的防制增添了变数。【本研究切入点】因此如何弄清中国当前PRRSV流行毒株，特别是其ORF5的分子流行病学及变异规律，对有效诊断，并研制有针对性的疫苗，从而提高当前PRRSV疫苗保护率有着至关重要的作用。同时，本研究所用病料均从这次疫病发病现场采集，PRRSV遗传变异分析有助于进一步研究这次流行的致病病原，从而采取有针对性的措施来防控和消灭类似疫病的再次爆发和流行有着重要意义。【拟解决的关键问题】以组织样品的核酸提取物为模板，进行多种病毒的检测，对PRRSV检测阳性者对其ORF5进行克隆测序，同时进行核苷酸、氨基酸的比较与限制性内切酶多态性分析（RLFP）分型，确定其分子流行病学特征。
1 材料与方法
1.1 样品
血清样品共计90份2006年9月采自江西省高安、余江等地60份，2006年11月采自江西省樟树10份和12月采自河南省新乡、安阳等20份，血清样品采集地均爆发“猪高热综合症”，以患病猪体温升高，大批怀孕母猪流产，断奶仔猪死亡为主要特征，这些猪场均未免疫过PRRS疫苗。
1.2 质粒与菌株
pBS-T载体购自TIANGENE公司，TOP10感受态菌购自TIANGENE公司。
1.3 其它试剂
QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，Quant Reverse Transcriptase，DNA胶回收试剂盒均购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP，限制性内切酶XbalⅠ、Hin d Ⅲ均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
1.4 引物
根据NCBI中所发表的PRRSV北美型和欧洲型，PCV2，猪血凝性脑脊髓炎病毒（porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV），日本乙型脑炎病毒（japanese encephalitis virus，JEV）所登录的序列，针对这些病毒的保守序列分别设计一对引物，所引物名称、序列及所在位置如表1所示。
1.5 血清样品中病毒核酸的提取
每个血清样品各取140 μl，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit中提取病毒细胞培养上清中RNA的方法进行病毒的核酸提取，最终溶解于60 μl RNase free 的EB缓冲液中置－70℃冰箱保存备用。
1.6 血清样品中cDNA第一链的合成
取上述RNA 12 μl，加入dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μl，10×Buffer 2 μl，Qst（10 mmol·L-1）和pdN6（10 mmol·L-1）反转录引物各0.5 μl，Quant Reverse Transcriptase 1 μl，混合均匀后置37℃水浴1 h，置－20℃冰箱保存备用。
1.7 血清样品中各病毒PCR的扩增
各病毒检测的PCR反应体系如下：各病毒检测用的上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μl，10×Buffer 2 μl，
1824 中国农业科学41卷
表1 检测血清样品所用的引物
Table 1 The priemer used for detection of serum samples
检测对象Object for detect 引物名称
Priemer
引物序列
Sequence
所在基因组位置
Position PRRS5F GGCAATGTGTCA (G) GGCATCGTGG 13759-13780a
PRRSV北美型
PRRSV North America type PRRS5R GCGACTT (C) ACCTTT (C) AGG (A) GCATA 14652-14632a
LF7102 CAGCCGACTACAGAGACAGGGACTAT 7102-7127b
PRRSV欧洲型
PRRSV Europe type LR9087 ACTAGCTGTCGCCCTGCCTCAAT 9087-9065b
PCF1096 GGATATTGTAG (T) TCCTGGTCG 1101-1120c
PCV2
PCR1597 TCCCGCACCTTCGGATATAC 1600-1581c
PHEF26927 GGAATATCGCCTAAGAGTGG 26927-26946d
PHEV
PHER27272 TGTCCTTGAGATTGATGTAGC 27272-27252d
PJEF464 CTGCGCAGGAGCCATGAAGTTG 464-486e
JEV
PJER891 CCGCCAGAAAAGCATAGCCAGG 891-879e
FNS3959 TAGATGAA (G) TACCACTGTGC 6089-6107f
Pestivirus
RNS31140 AGATCTTCACCCTTCATCAC 6250-6269f
QST GAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTTT
反转录引物
Priemer for RT pdN6 6个寡核苷酸的随机引物Random priemer of six oligonucleotides
a. 为GenBank登录号为AF184212的PRRSV所在位置；
b. 为GenBank登录号为M96262的PRRSV所在位置；
c. 为GenBank登录号为NC_005148
的PCV2所在位置；d. 为GenBank登录号为NC_007732的PHEV所在位置；e. 为GenBank登录号为L48961的JEV所在位置；f. 为GenBank登录
号为AF037405的BVDV所在位置
a. The region of PRRSV for GenBank No.AF184212;
b. The region of PRRSV for GenBank No. M96262;
c. The region of PCV2 for GenBank No.
NC_005148; d. The region of PHEV for GenBank No. NC_007732; e. The region of JEV for GenBank No. L48961; f. The region of BVDV for GenBank No.
AF037405
2.5 mmol·L-1 dNTP 2μl，rTaq DNA聚合酶5 units。其中在检测PRRSV北美株和欧洲株，PHEV，JEV和时加入1 μl合成cDNA第一链，在检测PCV2时加入提取的病毒核酸1 μl，然后加水至20 μl。当PCR结束后在1%的琼脂糖进行电泳，在EB上染色，在紫外灯下成像。
1.8 血清样品中PRRSV ORF5的克隆及鉴定
在紫外灯下将上述PCR产物的目的条带取出，按照DNA胶回收试剂盒的步骤进行回收，取回收产物与pBS-T载体连接，连接反应体系为：回收的PCR 产物7 μl，10×连接Buffer 1 μl，pBS-T载体1 μl，T4 DNA连接酶1 μl，4℃连接过夜，然后转化TOP10感受态菌，在IPTG、X-gal诱导下37℃培养12～16 h，挑取白斑菌落接种LB液体培养培养基培养过夜后提取质粒，选取大小阳性的质粒用限制性内切酶XbalⅠ和Hin d Ⅲ进行阳性重组子的双酶切鉴定。
1.9 各PRRSV分离株 ORF5核苷酸序列的测定与分析
取上述经双酶切鉴定的阳性重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定，并连同已发表的PRRSV ORF5的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列，利用DNASTAR软件进行比较，确定各PRRSV分离株与已发表的PRRSV ORF5核苷酸与氨基酸序列的同源性。同时绘制PRRSV ORF5氨基酸系统进化树，所用的PRRSV各毒株名称、GenBank登录号、登录时间和国别见表2。
表2 用于核苷酸序列、氨基酸序列和RLFP分析的各PRRSV 毒株
Table 2 PRRSV strains used for sequence comparison and RLFP analyses
毒株
Strain
GenBank登录号
Number of genbank
GenBank登录时间
Time of genbank
来源地
Origion
VR2332 AY150564 2002 丹麦Denmark
S1 DQ459471 2006 中国China
BJ-4 AF331831 2000 中国China
CC-1 EF153486 2006 中国China
HN1 AY457635 2003 中国China
SP AF184212 1999 新加坡Singapore LMY DQ473474 2006 韩国South Korea CH-1a AY032626 1999 中国China
HB-1 AY150312 2002 中国China
HB-2 AY262352 2002 中国China
MN184A DQ176019 2005 美国USA
JA142 AY424271 2004 美国USA
JXA1 EF112445 2006 中国China
6期张建武等：中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究 1825
1.10 各PRRSV分离株 ORF5核苷酸序列的RLFP分析
将所得到的各PRRSV分离株的ORF5的序列分别用DNASTAR软件进行MluⅠ、Hin cⅡ和SacⅡ的酶切电泳的片段数目及其大小分析，并用GenBank 登录PRRSV各毒株（表2）作为对照。
2 结果与分析
2.1 血清样品的（RT）-PCR检测结果
利用针对不同病毒设计的引物，分别进行（RT）- PCR扩增，经电泳分析，以扩增出预期大小的目的条带为PCR检测阳性，检测结果如表3所示。由此可见，2006年送检血清样品主要为PRRSV感染。应该说明的是，PRRSV阳性样品中有14份是笔者在发病现场采集的22份样品中的一部分；其余样品为养猪业主邮寄的性质不明的送检病料。本检测结果表明，PRRSV 在中国这次猪病流行中起主要致病作用。
表3 各病毒PCR的检测结果
Table 3 Detecting result of PCR of different viruses
发病猪场Outbreak 健康猪场
Health
随检未知组织
Unknown tissues
检测对象Object for detect
阳性Positive
阴性
Negative
阳性率
Positive ratio (%)
阳性
Positive
阴性
Negative
阳性率
Positive ratio (%)
阳性
Positive
阴性
Negative
阳性率
Positive ratio (%)
PRRSV北美型
PRRSV North America type
14 8 63.6 0 38 0 3 27 10
PRRSV欧洲型
PRRSV Europe type
0 22 0 0 38 0 0 30 0
PCV2 2
20
0.9
38
30
0 PHEV 0
22
38
30
0 JEV 0
22
38
30
0 Pestivirus 0
22
38
30
2.2 PRRSV各分离株ORF5基因的序列测定与遗传变
异分析
将PRRSV血清阳性样品的PCR产物回收后与pBS-T连接，筛选并鉴定阳性重组质粒，并以载体通用引物T7或T3进行序列测定，选取各PRRSV分离株的ORF5序列与同国内外发表的PRRSV HB-1株[14]、HB-2株、VR2332株、S1株、BJ-4株、CC-1株、HN1株、LMY株、MN184A株、JX142株、JXA1株、CH-1a 株和SP株中ORF5的基因序列进行同源性比较（表2），结果显示：各PRRSV分离株的ORF5序列和Genbank中登录的PRRSV 各毒株的序列差异性不一（表4），其同源性在85.9%～100%之间，笔者分离的各PRRSV分离株间的核苷酸同源性为95.4%～100%，其中的代表株JX0612与其它PRRSV分离株间的同源性最高（97.2%～99.8%），而与Genbank中登录PRRSV相比，与MN184A株的同源性最低（85.9%）；与中国动物疫病预防控制中心2006年分离的JXA1株的同源性最高99.7%，而与的其它PRRSV各毒株ORF5间的核苷酸同源性界于88.4%～96.8%。
利用DNASTAR软件将推导出PRRSV各分离株ORF5的氨基酸序列与已发表的PRRSV HB-1株[14]、HB-2株、VR2332株、S1株、BJ-4株、CC-1株、HN1株、LMY株、MN184A株、JX142株、JXA1株、CH-1a 株和SP株ORF5的氨基酸序列进行比较，确定各PRRSV分离株与已发表的PRRSV ORF5氨基酸序列同源性（图1），结果显示在各个PRRSV分离株ORF5内存在着大量氨基酸的点突变，多数分离株与JX0612突变位点相一致，但除HN0602株外，中国2006年所有PRRSV分离株的突变位点基本一致。
同时，各PRRSV分离株的ORF5氨基酸序列和GenBank中登录的PRRSV 各毒株间的氨基酸序列因毒株不同差异性较大（表5），其同源性介于82.6%～100%之间，但这次分离的各PRRSV分离株间的氨基酸同源性为93.5%～100%，其中的代表株JX0612与其它PRRSV分离株间的同源性较高，为：95.5%～100%，而与Genbank中登录PRRSV相比，与MN184A 株的同源性最低，为85.6%；与JXA11株的同源性最高99%，而与的其它PRRSV各毒株ORF5间的氨基酸同源性界于86.6%～94.5%。
1826 中 国 农 业 科 学 41卷
图1 各PRRSV 分离株间ORF5的氨基酸序列差异性分析
Fig. 1 Difference analysis of ORF5 amino acid sequence of isolated PRRSV strains
利用DNASTAR 软件对血清样品各PRRSV 分离株ORF5基因的氨基酸序列测定结果进行分析，绘制了系统进化树（图2）。从系统进化树的图中可以看
出：从江西、河南等地分离到的PRRSV 代表株JX0612，在ORF5氨基酸水平上，与JXA1株的亲缘关系最近，与HB-1株、CH-1a 株SP 株亲缘关系较远，
6期张建武等：中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究 1827
表4 各PRRSV分离株的ORF5核苷酸序列的同源性比较
Table 4 Homology comparison of ORF5 nucleotide sequence of isolated PRRSV strains
核苷酸序列比较所用的毒株Strains for sequence comparison
分离株
Isolated VR2332 S1 BJ-4 CC-1 HN1 SP LMY MN184A JA142 CH-1a HB-1 HB-2 JXA1 JX0612
D1 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.6 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
D2 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.6 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
D3 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.6 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
D4 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.6 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
HN0602 89.4 88.7 88.6 88.7 88.9 90.7 87.9 87.2 92 95.9 97.3 93.2 97.2 97.2
HN0610 88.9 88.2 88.1 88.2 88.1 89.9 87.2 87.4 91 95.0 96.8 92.2 99.3 99.3
JX0601 89.4 88.7 88.6 88.7 88.6 90.4 87.4 86.9 91.5 95.5 97.0 92.7 99.8 99.8
JX0603 89.6 88.9 88.7 88.9 88.7 90.5 87.6 87.1 91.7 95.7 96.8 92.9 99.7 99.7
JX0604 88.4 87.7 87.6 87.7 87.6 89.6 86.4 85.9 90.5 94.5 96.0 91.7 98.8 98.8
JX0608 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.9 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
JX0609 88.7 88.1 87.9 88.1 87.9 89.7 87.1 86.6 90.9 94.9 96.4 92.4 99.2 99.2
JX0610 89.4 88.7 88.6 88.7 88.6 90.7 87.7 86.9 91.5 95.5 96.7 92.7 99.5 99.5
JX0629 89.4 88.7 88.6 88.7 88.6 90.4 87.4 87.6 91.5 95.5 97.0 92.7 99.8 99.8
JX0630 89.4 88.7 88.6 88.7 88.6 90.4 87.4 86.9 91.5 95.5 97.0 92.7 99.8 99.8
JX0669 89.1 88.4 88.2 88.4 88.2 90.0 87.1 86.6 91.2 95.2 96.7 92.4 99.5 99.5
XIO-1 88.9 88.2 88.1 88.2 88.1 89.9 86.9 86.9 91 95.0 96.5 92.5 99.3 99.3
JX0612 89.2 88.6 88.4 88.6 88.4 90.2 87.6 86.7 91.7 95.4 96.8 92.5 99.7
表5 各PRRSV分离株的ORF5氨基酸序列的同源性比较
Table 5 Homology comparison of ORF5 amino acid sequence of isolated PRRSV strains
氨基酸序列比较所用的毒株Strains for sequence comparison
分离株
Isolated VR2332 S1 BJ-4 CC-1 HN1 SP LMY MN184A JA142CH-1a HB-1 HB-2 JXA1 JX0612
D1 87.6 86.6 85.6 86.1 85.6 91.0 85.1 84.6 90.5 92.5 93.5 90.0 98.0 99.0
D2 87.6 86.6 85.6 86.1 85.6 91.0 85.1 84.6 90.5 92.5 93.5 90.0 98.0 99.0
D3 87.6 86.6 85.6 86.1 85.6 91.0 85.1 84.6 90.5 92.5 93.5 90.0 98.0 99.0
D4 88.6 87.6 86.6 87.1 86.6 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0 100.0
HN0602 90.0 88.6 88.1 88.6 89.1 93.0 87.6 85.1 93.5 95.5 97.0 92.5 94.5 95.5
HN0610 87.6 86.6 85.6 86.1 85.6 91.0 85.1 85.6 90.5 92.5 95.0 90.5 98.0 99.0
JX0601 88.6 87.6 85.6 87.1 86.6 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0 100.0
JX0603 88.6 87.6 86.6 87.1 86.6 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0 100.0
JX0604 86.6 85.6 84.6 85.1 84.6 90.0 84.1 82.6 88.6 91.5 92.5 89.1 96.0 98.0
JX0608 87.6 86.6 85.6 86.1 85.6 91.0 85.1 85.1 90.5 92.5 94.0 90.5 98.0 99.0
JX0609 88.1 87.1 86.1 86.6 86.1 91.5 86.6 84.6 91.0 93.0 93.5 90.5 98.0 99.0
JX0610 88.6 87.6 86.6 87.1 86.5 92.5 86.6 85.1 91.0 93.0 94.0 90.5 98.5 99.5
JX0629 88.1 87.1 86.1 86.6 86.1 91.5 85.6 85.6 91.5 93.0 94.0 91.0 99.0 99.5
JX0630 88.6 87.6 86.6 87.1 86.6 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0 100.0
JX0669 88.1 87.1 86.1 86.6 86.1 91.5 85.6 85.1 91.0 93.0 94.0 90.5 98.5 99.5
XIO-1 88.6 87.6 86.6 87.1 86.6 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0 100.0
JX0612 88.6 87.6 86.6 87.1 86.5 92.0 86.1 85.6 91.5 93.5 94.5 91.0 99.0
1828 中 国 农 业 科 学 41卷
图2 各PRRSV 分离株间ORF5的氨基酸系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of ORF5 amino acid sequence of
isolated PRRSV strain
而与HB-2株、VR2332株、S1株、BJ-4株、CC-1株、HN1株、JA142株、LMY 株和MN184A 株的亲缘关系更远。
2.3 PRRSV 分离株 ORF5核苷酸序列的RLFP 分析结果
对PRRSV 毒株以及所选取的GenBank 代表毒株按照Wesley [15]，Cai [16]和Cha [17]方法进行RFLP 亚类分析，应用DNASTAR 软件分析Mlu Ⅰ、Hinc Ⅱ和Sac Ⅱ 3种限制性内切酶的酶切片段分布模式，结果如表6所示，说明笔者所分离到的PRRSV 2006年流行株与中国动物疫病预防控制中心所报道的高致病性PRRSV 一样，构成一个1-4-3 RFLP 亚群。
表6 PRRSV 分离株 ORF5核苷酸序列的RLFP
Table 6 RLFP of ORF5 nucleotide sequence of isolated
PRRSV strains
RLFP 模式 RLFP model PRRSV 毒株 PRRSV strains
2-5-2
BJ-4, CC-1, HN1, S1, VR2332
1-4-1 CH-1a 1-4-3
D1, D2, D2, D4, JXA1, HN0610, JX0601, JX0603, JX0604, JX0608, JX0609, JX0610, JX0612, JX0630, JX0669, XIO-1
1-4-2
HB-1, HN0602, JA142
1-2-2 LMY, HB-2 1-8-4 MN184A 1-4-4 SP
3 讨论
自2006年5月以来，中国江西南昌周边地区部分猪场开始出现以呼吸急促、全身发红等症状病例；6月中旬，整个南昌周边地区出现相同症状病例，并频频出现死亡；随后在江西抚州、东乡、万年、余干、高安等地爆发；7月～8月，传入福建、湖南、湖北、河南、江苏等地，入秋以后又相继在山东、河北、辽宁、内蒙等地爆发流行，这次以高烧持续不退、呼吸急促、全身发红为主要临床症状的猪病疫情。本次流行以高热持续不退为主要特点，且传播速度，猪病发病率在50%以上，死亡率10%～30%，部分猪场达100%，根据中国动物疾病控制中心统计：本次流行导
致数百万头受影响，至少40万头猪死亡，给猪场及养猪户造成严重经济损失[17]。因当时病因还没有得到明确定论，所以，许多专家把此次疫情定名为“猪无名高热”。经大量流行病学研究，初步确定这次所谓的“猪高热综合征”主要致病病原为PRRSV [18]（童光志等；杨汉春等；个人通讯）。PRRS 在国内的存在和流行由来已久，但象本次流行所造成的死亡率之高、损失之巨尚属首次，这也是众多兽医工作者的难解之谜。本研究对采自江西、河南等“猪高热综合症”爆发地的90份患病猪血清样品进行PRRSV 北美型和欧洲型，PCV2，PHEV ，JEV 的PCR 检测，结果检测到16份PRRSV 北美型阳性样品，阳性率17.8%；对JX0612为代表的PRRSV 分离株进行Nsp2序列测定，表明这些毒株均含有30个氨基酸缺失（吕健等，待发表），与中国动物疫病预防控制中心所界定的PRRSV 变异株特征一致[18]；PCV2阳性样品2份，阳性率2.2%；其它病毒均未检测到。同时对PRRSV 各分离株的ORF5进行了克隆和序列测定，并对本次“猪高热综合征”流行的PRRSV 株的遗传变异规律进行分析，证明中国高致病性PRRSV 大多为一个以PRRSV JX0612株为代表的变异株组成。对28日龄猪进行了试验感染，发现致死率高达100%（袁世山等未发表资料），说明PRRSV 至少是肆虐中国养猪业之“猪高热综合征”的主要病原之一。当然，后者的发生有很多原因，例如因疏于生物安全以及病猪运输等所发生的人为造病现象。尽管如此，本研究对最终确定“猪高热综合症”的致病病原、及其有针对性地预防和控制爆发流行提供了重要的理论依据。
PRRSV 为RNA 病毒，病毒是在依赖RNA 的RNA 聚合酶的作用下进行的，由于PRRSV 的依赖RNA 的
6期张建武等：中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究 1829
RNA聚合酶校正能力较低，导致PRRSV基因组中点突变的大量产生，另外RNA重组为RNA病毒进化过程中提供了有力且有效的手段，基因交换能力使RNA 病毒适应外界环境经受自然选择的考验，并为RNA 重组病毒提供了进化上的优势[19]。并且各型不同株间的核苷酸变异可高达10%。而在PRRSV的众多蛋白中GP5蛋白是最易发生变异的蛋白基因之一，GP5的变异主要集中在一级序列的变化，糖基化位点的缺失或修饰等方面。在本研究中，不同PRRSV分离株间的核苷酸同源性为86.4%～100%，HN0602与之同源性最低，核苷酸的同源性为96.8%～97.3%。其中以JX0612为代表的“猪高热综合征”PRRSV分离株，与GenBank中登录的PRRSV株相比，核苷酸的同源性为86.7%～99.7%。其中与国际上的PRRSV标准毒株VR2332株和疫苗SP株有较大差异，核苷酸的同源性为89.2%～90.2%；说明PRRSV JX0612株随着时间的推移发生了变异。而PRRSV JX0612株与美国2005年登录的强毒株MN184A株差异最大，核苷酸的同源性为86.7%；与2006年国内PRRSV分离株JXA1株的核苷酸的同源性最高，为99.7%；说明“猪高热综合症”的PRRSV代表株JX0612是中国所特有的PRRSV分离株。同时PRRSV各毒株分别应用MluⅠ、HincⅡ和SacⅡ3种限制性内切酶的RLFP模式有6种模式，其中按照PRRSV ORF5的RLFP模式可将国内PRRSV流行毒株分为5个群，ORF5的RLFP模式分别为2-5-2、1-4-1、1-4-3、1-2-2和1-4-2，而包括JX0612在内的所有“猪高热综合征”PRRSV分离株与GenBank中登录的PRRSV毒株JXA1的RLFP模式完全相同（1-4-3），可划为一个群。而HN0602与PRRSV毒株HB-1、JA142有相同的RLFP模式（1-4-2）。从而为依靠RT-PCR-RLFP快速诊断PRRSV 并进行基因分型奠定基础，也说明引起中国这次“猪高热综合征”的PRRSV毒株可能为两个群。
根据猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗原特性，可将其分为欧洲型和北美型2个血清型。PRRS 基因片段ORF5编码囊膜糖蛋白GP5是该病毒的3个主要结构蛋白之一。含有4个糖基化位点。GP5有一段31个氨基酸的信号肽及3个跨膜功能区，分别位于62～83位，90～106位，113～130位氨基酸。该蛋白还含有一段很大的内部疏水区，可能起锚定作用，GP5通过二硫键和M蛋白形成二聚体。GP5具有6个抗原决定簇，其中一个血清型特异的线形决定簇，能在体外中和病毒的感染[20,21]。GP5除了在诱发机体免疫保护方面有重要作用外，最近，又有研究表明PRRSV 感染的康复猪血清中针对GP5的抗体滴度与中和病毒的能力呈显著相关性，但与感染宿主的特异性无关[22]。该蛋白能在猪体内诱导产生中和抗体，且起主要作用的表位是构象型中和表位[23]，与GP5蛋白的二级结构密切相关；同时GP5还可诱导体内、外的细胞凋亡[24]。含有ORF5基因质粒DNA能诱导猪抗GP5特异性中和抗体的产生；且免疫猪的外周血单核细胞在GP5重组蛋白存在时能够发生转化反应，显示了GP5特异性细胞免疫的产生[25,26]。Meng[27]将GP5基因克隆入巨细胞病毒（CMV）早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒而制备出DNA疫苗，用其免疫仔猪后可诱导抗体的产生，实验室攻毒后显示出良好的保护效果。本研究发现，不同PRRSV分离株间的氨基酸同源性为84.1%～100%，HN0602与之的氨基酸同源性为93.5%～96%。PRRSV JX0612株与GenBank中登录的PRRSV株的氨基酸同源性为85.6%～99%。其中与国际上的PRRSV标准毒株VR2332株和疫苗SP株有较大差异，氨基酸的同源性分别为88.6%和92%；而PRRSV JX0612株与美国2005年登录的强毒株MN184A株的氨基酸的同源性为85.6%；与2006年国内PRRSV 分离株JXA1株的氨基酸同源性最高为99%；也同样说明“猪高热综合征”的PRRSV代表株JX0612是中国所特有的PRRSV 分离株。笔者研究还发现：分离到的PRRSV基因组ORF5中存在着较高水平的氨基酸点突变，胞外结构域与PRRSV标准毒株相比发生了氨基酸的变异，其中在L39Q40L41中，所有分离株均由L39突变为I39，而位于中和表位之前一个非中和表位（A/V）27L28A29N30在所有分离株均由A29突变为V29，而该非中和表位是PRRSV的诱骗（decoy）表位，能够延缓机体产生中和抗体达3周之久[28]，从而也延缓中和抗体对病毒的中和作用，促进了病毒逃避机体的体液免疫。因此研究PRRSV的ORF5的变异对PRRS的免疫预防有着重要的作用。氨基酸遗传进化分析结果表明：HN0602与其它PRRSV分离株有较远的亲缘关系而与HB-1有较近的亲缘关系；而以JX0612为代表“猪高热综合症”PRRSV分离株与MN184A株有较远的亲缘关系，而与国内毒株JXA1有着较近的亲缘关系，说明：引起中国“猪高热综合征”的PRRSV毒株可能属于至少两个群。
PRRSV具有广泛的抗原变异能力，这种变异性不仅表现于不同基因型的PRRSV之间，而且表现于同
1830 中国农业科学41卷
一基因型的PRRSV不同分离株之间，不同毒株之间抗原的交叉保护是有限的，由于PRRSV各分离株之间存在着广泛的抗原多样性，根据某一PRRSV分离株制备的疫苗是不可能有效地保护猪群对抗具有抗原差异的PRRSV野毒株的感染的。目前用于预防PRRS 的主要疫苗是弱毒苗和灭活苗，在一定程度上，这些疫苗对控制PRRS的传播和蔓延起了很大的作用。但弱毒苗存在毒力返强的危险，灭活苗的效果不稳定，而且经常导致免疫失败，为此各国学者正致力于研制安全、效果可靠、广谱的基因工程疫苗。在PRRSV 的蛋白中，GP2、GP3和GP4在病毒粒子中含量低，抗原性较差，而GP5是公认的中和作用相关抗原。因此明确当前中国PRRSV主要流行毒株的ORF5的分子特征，是有效诊断PRRS并研制有针对性的PRRS 基因工程疫苗的关键，本研究从当前中国主要PRRS 流行区的江西、河南等地采集猪血清样品，从猪血清样品中提取RNA，并利用RT-PCR对PRRSV的ORF5进行克隆和序列测定，从而确定了中国当前PRRSV 主要流行毒株的ORF5的分子特征，为RT-PCR快速诊断PRRS，并进一步应用限制性酶切多态性分析（RLFP）鉴定主要流行PRRSV的基因型奠定了基础，同时为研制保护性高、针对性强的PRRSV基因工程疫苗指明了方向。
4 结论
针对采集自“猪高热综合征”爆发地的血清或病变组织的多种病毒检测，初步确定猪繁殖与呼吸综合征病毒可能为2006年中国爆发“猪高热综合征”的主要致病病原之一，且流行的主要是以JX0612为代表猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株，但也有其它群的毒株流行。
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（责任编辑林鉴非）