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(1997-06-17收稿,1997-11-11收修改稿)乳腺表达人凝血因子ù的转基因小鼠的研究
黄英1张克忠o黄文英1卢大儒o黄缨1马湛卢1任兆瑞1邱信芳o薛京伦o曾溢滔1黄淑帧1* (1上海市儿童医院上海医学遗传研究所,上海200040;o复旦大学遗传学研究所,上海200433.*联系人)
摘要通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子ù的表达载体pMCùm DNA导入586枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的499枚受精卵移植于假孕受体母鼠,获得216只F0代仔鼠.P CR和Southern印迹杂交分析证实有6只仔鼠(2a,4`)的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为3%(6/216);EL ISA测定2只F0代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子ù蛋白(hFù)的含量均已达100ng/mL以上,一期法测定其凝血活性分别为44167%和79143%.
关键词人凝血因子ù转基因小鼠乳腺表达
通过转基因动物技术,建立哺乳动物乳腺生物反应器来生产贵重的药物蛋白是近年生物工程领域发展的重要方向之一.而小鼠因其繁殖周期短,饲养管理方便,故常被作为动物乳腺生物反应器的经济而有效的实验动物模型.人凝血因子ù(hFù)是一种血浆凝血因子,它的缺乏会导致一种性连锁遗传的出血性疾病)))血友病B[1].目前,该病的治疗主要依靠从血制品中提取的hFù作替代疗法,若能通过动物乳腺生物反应器批量生产具有生物活性的hF ù,则对血友病B的治疗具有重大意义.本研究通过显微注射,将重组hFù基因导入小鼠受精卵,获得小鼠乳汁中含有hFù蛋白的转基因小鼠,从而为动物乳腺生物反应器的研究提供了科学依据.
1材料与方法
( )实验动物.昆明白种纯系小鼠,来自上海医学遗传研究所动物房(清洁级,医动字第02_56号).
( )表达载体构建.表达载体pMCùm按文献[2]方法构建(图1),并已证明该表达载体在离体细胞和活体细胞中可表达[2].
( )转基因小鼠制备.参照Reilly等人[3]方法作修改进行.采用正压手动显微操作技术向每一小鼠受精卵的雄原核中注射2pL终浓度为410ng/L L的pMCùm DNA,然后移植于同期发情的假孕母鼠输卵管中,得到的仔鼠称转基因小鼠F0代.
732
图1用于显微注射的表达载体(pM Cùm)示意图
M AR)))小鼠的M AR元件;B_casei n promoter)))牛的酪蛋白启动子及其上游的调控序列和外显子1;
hFù小基因)))包括h FùcDNA序列,800bp经改造的内含子?序列和hFù蛋白的信号肽序列;poly
A)))S V40pol y A序列;H)))Hindó酶切位点;空白框)))内含子?
( )目的基因整合的鉴定.剪下015~1cm长的仔鼠尾,抽提DNA进行PCR和Southern 印迹杂交分析,以鉴定hFù基因的整合.PCR的引物序列为5c_ATTCTGTGTAG-GCTCTAT CG_3c和5c_GAAGGGCAATGT CAT GGTT G_3c,扩增片段的长度为206bp.以(A_32P)dCTP标记的hFùcDNA为探针,Southern印迹杂交后的结果作为目的基因整合的确证.
( )乳汁中hFù蛋白的鉴定.收集已进入泌乳期的阳性整合的转基因母鼠乳汁,应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定乳汁中hFù蛋白的含量[4],并用ST4Bio型半自动血液凝固测定仪/一期法0直接检测hFù的凝血活性[5].
2结果
2.1外源DNA导入对胚胎生长发育的影响
通过显微镜注射导入pMCùm DNA后,受精卵的存活、移植、妊娠和产仔情况见表1.
表1小鼠受精卵显微注射后的实验结果
导入基因注射受精卵数移植受精卵数注射后受精卵存活率受体数妊娠数妊娠率产仔鼠数产仔存活率pM Cùm58649985.2%(499/586)383284.3%21643.3%(216/499)
2.2转基因小鼠hFùDNA整合的检测
采用PCR和Southern印迹杂交实验对216只F0代仔鼠进行了hFùDNA整合的鉴定,其中有6只转基因小鼠(2a,4`)的基因组中具有阳性整合(图2).在Southern印迹杂交图谱中,各阳性整合小鼠的杂交片段的大小并不相同,表明外源基因在小鼠基因组中的整合是非定点的.图3显示的是在乳汁中有hFù基因表达的2只F0代转基因雌鼠的Sourhern图谱.
阳性整合的转基因小鼠与正常小鼠交配后已获得30只F1代小鼠,经PCR和Southern印迹杂交鉴定,有17只F1代小鼠的基因组中具有hFùDNA的序列,阳性小鼠占57%(表2).
733
图2转基因小鼠外源基因(hFù)整合的PCR检测结果
M)))1kb梯度DNA标志;1,3,7,8)))外源基因导入后整合阴性的小鼠;2,4,5,6,9,10)))外源基因导入后整合阳性的小鼠;B)))空白对照;C)))阴性对照;P)))hFù基因片段(阳性对照)
图3Southern印迹杂交分析转基因小鼠的整合结果
A_32P_dCT P标记的hFù基因片段为探针,小鼠基因组DNA用
H i ndó酶解.1)))转基因阴性小鼠;2,3)))转基因阳性小鼠
(在乳汁中有hFù基因表达的2只F0代转基因雌鼠)
表2转入hFù基因小鼠整合的检测
仔鼠基因仔鼠数PCR检测阳性数Southern blot检测阳性数整合率/%
转基因总有效率/% (阳性数/受精卵移植数)
F0216663 1.6
F130171757(50~64)
2.3转基因小鼠乳汁中hFù蛋白的检测
2只F0代雌鼠的乳汁中hFù蛋白含量和其凝血活性的测定结果见表3.从表3中可以看到,hFù蛋白在乳汁中的表达水平已高到100ng/m L以上,凝血活性的测定结果显示,2只
表32只F0代转基因雌鼠乳汁中hFù蛋白的检测结果
小鼠检测内容
结果
定性定量/ng#mL-1
非整合雌鼠(No.1)鼠乳中hFù蛋白阴性1155非整合雌鼠(No.2)鼠乳中hFù蛋白阴性1150
阳性F
代雌鼠(No.1)鼠乳中hFù蛋白阳性104185
阳性F
代雌鼠(No.2)鼠乳中hFù蛋白阳性10916 734
F0代小鼠的乳汁中活化的hFù分别为44167%和79143%,表明hFù小基因在小鼠的乳腺中已经过转译后加工(糖基化,羧基化和肽链的剪切等),表达出具有活性的hFù.
3讨论
hFù是人体中重要的血浆凝血因子,由肝脏细胞合成.最初在肝脏中生成的hFù是一种酶原,经过在第157和167位门冬酰胺部位的糖基化,N端第7,8,15,17,20,21,26,27,30, 33,36和40共12个谷氨酸的羧基化,以及在肽链中Arg145_Ala146和Arg180_Val181处精氨酰键断裂,剪除掉第146~180位共35个氨基酸的肽段,生成一条由145个氨基酸(第1~145位)构成的短链和另一条有236个氨基酸(第181~416位)构成的重链,并由二硫键连接起来,最终形成了具有丝氨酸蛋白酶活性的活化hFù[1].正因为hFù因子在体内代谢的这一特点,故被认为是采用动物乳腺生物反应器的途径批量生产的最佳候选蛋白.
本文通过小鼠受精卵显微注射导入hFù基因的途径,获得了在小鼠乳汁中的表达hFù蛋白并能在种系中传代的转基因小鼠品系.研究结果表明,牛酪蛋白基因5c端包括启动子及其上游调控序列和外显子1共210kb的结构框架,能指导hFù小基因在活体小鼠的乳汁中表达出有相当生物活性的hFù蛋白,显示出该基因在分泌信号肽序列,活性位点序列等的完整性,我们在另一组实验中,将hFù小基因表达载体注射入小鼠尾静脉后,通过对各器官组织总RNA的RT_PCR检测和免疫组织化学的测定,证实hFù小基因在乳腺中专一的转录表达[2].所有这些结果为进一步在大型家畜中进行乳腺生物反应器的研究和培育提供了较好的模式.
尽管目前利用显微注射技术培育转基因动物的总体效率还不尽人意,外源基因的整合率和表达率较低,但与其他基因导入技术,如反转录病毒法,胚胎干细胞法,电转移法和精子载体法等相比,在最终育成能够整合和表达外源基因的真正意义上的转基因哺乳动物方面,尤其是对转基因实验小动物的制备,它仍不失为最经典而有效的方法[6].此外,如何提高转基因动物的乳汁中目的基因产品的水平也是一个重要的问题.最近,Yull等人[7]在hFù转基因小鼠的研究中,就通过去除hFù基因的前体mRNA中隐匿的3c端剪切位点来增加乳汁中hFù蛋白的表达作了有意义的尝试.由于许多有经济价值的家畜的受精卵的核常常不能清晰地显示,故近年来已逐步发展起将显微注射与家畜卵母细胞体外成熟、体外培养以及胚胎移植前的外源基因整合的分子鉴定等相结合的综合技术.无疑,这对于转基因动物的成功率将起到积极的推动作用.
致谢上海市儿童医院上海医学遗传研究所孙琼、陈美珏、陈坚、沈宇青、顾小锋医师等参加部分工作.本工作为国家/八六三0计划(课题编号:101_05_04_01)和上海市科技发展基金(批准号:955419001)资助项目.
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(1998-02-23收稿,1998_03_09收修改稿)
大麦染色体的激光微束切割、片段
分离及体外扩增
王槐周奕华党本元胡赞民王兰岚李良材陈正华
(中国科学院遗传研究所,北京100101)
摘要用Nd:YA G激光微束对大麦7H染色体进行切割并利用玻璃针分离了7HS端部片段,对获得的染色体片段DNA进行了2次LA_PCR(linker adaptor PCR)体外扩增,扩增片段长度为500~3000bp,大多数集中在1000bp,经Souther n杂交分析证实扩增片段来自大麦基因组.与前人报道相比,本研究具有以下特点: ( )切割染色体细致准确、易于操作,且费用较低.( )所需底物量少,用单一染色体片段即可进行有效扩增.
关键词大麦染色体微切割Nd:YAG激光微束LA-PCR
特定染色体或染色体片段的显微切割、分离和体外扩增对于基因组研究意义十分重大.这项技术自1981年建立以来[1],经过不断发展,现已成功地应用于人类及动物的基因组研究[2,3].但是由于植物细胞与染色体的特殊性,1991年才首次将此技术用于植物染色体的研究[4],而且进展相对缓慢,到现在为止仅有十几篇报道,主要原因是植物染色体的显微切割、分离及体外扩增技术尚不够完善,难度较大.
目前,微切割、微分离植物染色体的方法主要是玻璃针法[4~8]和Fukui[9]等人建立的激光法.前者是分离植物染色体较为成熟的方法,但难以对染色体进行准确的定位切割;后者切割细致,但需要底部带有特殊薄膜的小皿,费用高且步骤繁琐.另外,以往报道中多用几条甚至几十条相同染色体作为模板[4,5]进行体外扩增,如果没有特殊材料(如端体、三体、单体等),同时挑取几十条相同染色体不仅费时费力,也极难保证每次挑取染色体的准确性,该项工作难以进行.
针对上述问题,在本实验室工作基础上[7,10,11],本研究以大麦为材料,探索出一条简便有效的用Nd:YAG激光微束切割植物染色体、借助玻璃针分离染色体片段,并用单一染色体片段作为底物进行体外扩增的程序,为大麦染色体片段DNA文库的构建奠定了基础.
1材料与方法
(1)材料.以大麦(Hordeum vulgar e L.)/沪麦6号0为实验材料,种子由中国科学院遗传研究所李义文先生馈赠.
736
转基因小鼠的鉴定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
转基因小鼠的鉴定 一、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好， 此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法 二、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1.剪取小鼠长度为的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混 匀。 2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡， 使样品均匀分离。 注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4.14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。 5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9.12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾 干。
HER2 阳性乳腺癌靶向治疗研究进展 乳腺癌是女性最常见的肿瘤相关性死亡原因之一， 全世界每年约有135 万妇女发生乳腺癌，约33万妇女死于乳腺癌[1]，近年来我国城市乳腺癌的发病率与死亡率上升明显。约20%-25%的乳腺癌患者人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性。HER2+乳腺癌患者预后差，术后复发风险高、生存期短[2-3]。HER2 是表皮生长因子受体家族（EGFR/HER1，HER2，HER3，HER4）中4成员之一，具有酪氨酸激酶活性，通过激活下游PI3K/Akt 和Ras/Raf/Mek/MAPK信号通路，参与细胞的生长、活化和增殖过程。针对乳腺癌以HER2为靶点的分子靶向治疗是近年来出现的有效的治疗途径，本文予以综述如下。 1 单克隆抗体 曲妥珠单抗 曲妥珠单克隆抗体（Trastuzumab）是人源化的重组抗HER-2单克隆抗体，95% 来自人和5% 来自鼠的IgG抗体。曲妥珠单克隆抗体能够选择性作用于HER-2的细胞外受体，通过降低细胞膜HER-2蛋白浓度、阻断HER-2介导的信号转导通路、加速HER-2受体蛋白降解、参与抗血管生成作用而导致细胞生长受抑制和诱导细胞凋亡，以及通过ADCC诱
导机体杀死肿瘤细胞。曲妥珠单克隆抗体是作为针对HER-2靶点设计的首个分子靶向药物，明显提高了HER-2阳性乳腺癌的治疗效果，乳腺癌分子靶向治疗的新时代由此展开。目前曲妥珠单抗已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于HER-2阳性乳腺癌的辅助治疗以及晚期解救治疗[4]。 对于HER2阳性的晚期乳腺癌患者，曲妥珠单抗从单药治疗到联合化疗均显示良好疗效。单一药物曲妥珠单抗对HER-2过度表达的晚期转移性乳腺癌安全有效，其作为一线药物的有效率为26%，HER-2（3+）患者有效率为35%[4];作为二、三线药物总有效率为15%，其中HER-2（3+）患者有效率为18%，且曲妥珠单抗能显著改善生活质量[5]。曲妥珠单抗联合应用化疗药物治疗HER-2过度表达的乳腺癌也可明显提高疗效，体外实验显示曲妥珠单抗与多种化疗药有相加或协同作用。曲妥珠单抗与长春瑞滨、吉西他滨、卡培他滨、脂质体阿霉素联用的有效率为24%～86%[6]。紫杉类中加入曲妥珠单抗能够显著提高晚期乳腺癌患者的有效率 和生存期[7]，相关实验证实联合治疗与单药化疗相比，有效率明显提高，更为重要的是患者的总生存期得以延长。临床常将曲妥珠单抗与一种化疗药联用，有关两种化疗药联合曲妥珠单抗的疗效的实验表明含曲妥珠单抗的三药联合较两 药联合方案略有优势[6]。对于激素受体阳性的患者，也可以
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
四综述四 乳腺癌免疫治疗的研究进展 薛静 王浩 DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0807.2018.01.009 基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(81602713)作者单位:750004银川,宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系 【摘要】 免疫治疗是继手术二放射治疗二化疗二内分泌治疗等之后的乳腺癌重要治疗手段三近年来,随着免疫学的不断发展,乳腺癌的免疫治疗取得了很大的进步,并日益受到临床医师的重视三笔者简述了针对乳腺癌治疗相关靶点的治疗性疫苗,如免疫检查点相关疫苗二特异性抗原疫苗二细胞疫苗二病毒载体疫苗和双特异性抗体疫苗等,同时,还介绍了近年来针对乳腺癌的预防性疫苗,这将有利于临床医师进一步了解乳腺癌免疫治疗的现状与进展三 【关键词】 乳腺肿瘤; 免疫疗法; 疫苗 【中图法分类号】 R737.9 【文献标志码】 A 乳腺癌是威胁女性生命健康的主要原因之一,当前发病率和病死率分别占女性恶性肿瘤的25%和15%[1]三随着免疫学与分子生物学的不断发展,免疫治疗成为了继传统放射治疗二化疗二手术等治疗之后的又一重要的乳腺癌治疗方法三笔者针对乳腺癌治疗相关靶点的治疗性疫苗和预防性疫苗的研究现状和进展作一综述三 一二治疗性乳腺癌疫苗 治疗性乳腺癌疫苗是一类通过消除患者体内免疫耐受,重建或增强免疫应答,起着治疗作用的新型疫苗三它是在使用常规手术二放射治疗二化疗以及新型生物治疗如单克隆抗体药物等的基础上,通过调动机体特异性抗肿瘤免疫,清除残存的零星癌细胞,防止肿瘤的复发,以便延长患者的生存期三笔者总结的相关治疗性乳腺癌疫苗临床试验见表1[2?29]三 (一)免疫检查点相关疫苗 在肿瘤微环境中,肿瘤抗原激活T 淋巴细胞的过程受多个受体二配体的相互作用,因此,这些受体或配体在肿瘤的发生二发展中扮演着重要的角色三目前,乳腺癌的研究主要针对的是淋巴细胞激活基因?3(lymphocyte activation gene?3,LAG?3)二细胞毒T 淋巴细胞相关抗原?4(cytotoxic T?lymphocyte antigen?4,CTLA?4)和程序性死亡受体?1(programmed cell death?1,PD?1)等相关免疫靶点三 https://www.doczj.com/doc/6e11935391.html,G?3 LAG?3是免疫球蛋白超家族成员之一,其分子质量为 70000,位于12号染色体上[30]三它主要表达于活化的NK 细胞二T 淋巴细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)的表面,能够抑制T 细胞的增殖和活化,并在调节性T 细胞 (regulatory T cells,Tregs)发挥抑制作用的过程中起着重要的作用[28]三重组可溶性LAG?3免疫球蛋白融合蛋白(recombinant soluble LAG?3immunoglobulin fusion protein,IMP321)与主要 组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)?Ⅱ分子有很高的亲和力,能够引起抗原提呈细胞(antigen?presenting cells,APC)和记忆性T 细胞活化三已有研究在30例转移性乳腺癌患者中评估了IMP321的疗效,患者接受每2周1次IMP321,每周1次80mg/m 2紫杉醇皮下注射,连续治疗6个疗程三结果表明:患者6个月无进展生存(progression?free survival,PFS)率达90%,并且,APC 数量二自然杀伤细胞与CD8+效应T 细胞的比例呈持续性增加,且未见与IMP321相关的不良反应[2]三而之前已有实验证明,抗LAG?3联合抗PD?1治疗具有协同效应,并且能够防止T 细胞耗竭和无能[31]三 2.CTLA?4 CTLA?4是一种免疫检查点受体,它既能在活化的CD8+ 效应T 细胞中表达,也能在肿瘤细胞中表达三并且,其能与T 细胞共刺激受体CD28竞争结合其配体CD80或CD86,抑制T 淋巴细胞活化,进而阻断CTLA?4,消除免疫系统对自身组织的外周免疫耐受和解除对T 淋巴细胞活化的抑制,从而发挥抗肿瘤活性[32]三目前,临床上有2种用于抑制CTLA?4的单克隆抗体三一种是ipilimumab,多项多中心3期临床试验已经证明其能延长患者存活时间,故美国FDA 已批准ipilimumab 用于未经治疗和难治性转移性黑色素瘤患者[33?34],而另外一种单克隆抗体tremelimumab 已经用于多种肿瘤的临床试验中[35]三研究者在26例转移性激素敏感型乳腺癌中评估了tremelimumab 的临床疗效三这些患者每28d 或90d,接受3~10mg /kg 的tremelimumab 治疗,同时每天给予25mg 依西美坦治疗,其主要不良反应为腹泻(46%)二瘙痒(42%)二便秘(23%)和疲劳(23%)三其中5例患者中,有4例出现剂量限制性毒性腹泻,还有1例患者出现短暂性转氨酶升高,并且,患者接受tremelimumab 联合依西美坦治疗,每90d 的最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD)为6mg /kg三在接受MTD 治疗的13例患者中,无一例出现3二4级治疗相关性腹泻,其最佳客观反应率(objective response 四 34四中华乳腺病杂志(电子版)2018年2月第12卷第1期Chin J Breast Dis(Electronic Edition),February 2018,Vol.12,No.1
乳腺癌实验动物模型的研究及发展历程 摘要：乳腺癌动物模型根据建立方法可分为自发性、诱发性和移植性，以及转基因乳腺癌动物模型、乳腺癌远处转移动物模型。并列举现已发现的通过实验动物模型确定的有效治疗方法。 关键词：乳腺癌、实验动物模型、治疗作用 乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，全世界每年新发乳腺癌约150万例，死亡57万例，而且发病率目前有增高趋势。乳腺癌动物模型的制作进一步研究乳腺癌的病因、发病机理，这对于乳腺癌的治疗效果和预防有着极大的影响作用。一个理想、完整的的动物模型，首先应与人体内肿瘤病理生理过程相似，还要便于生产、观察及对各种处理方法进行监测和优选。 1.目前关于乳腺癌动物模型的建立方法有以下几个方面。 1．1 自发性乳腺癌实验动物模型 实验动物种群中自然发生或通过遗传育种培养而保留下来的一 类肿瘤称为自发性肿瘤。这种模型的特点为实验动物未经过人为处理，到一定时间发生乳腺肿瘤，多采用近交系小鼠。自发性肿瘤从其发生来看，与人类肿瘤更相似，因此，在自发性肿瘤中，影响肿瘤发生发展的因素更有可能被发现，但缺点在于应用时，肿瘤的发生情况可能参差不齐，不能在短时间内获得大量肿瘤学资料，观察时间长，实验耗费较大。 1.2 诱发性乳腺癌实验动物模型
所谓诱发性模型即使用化学物质、物理、生物因素等可在实验动物中诱发乳腺癌的发生，多数利用强化学致癌物，通过经口、涂抹、注射、埋藏等方法应用于实验动物使之发生乳腺癌。化学诱导乳腺癌发生的动物模型可用于乳腺癌的病因学研究及预防性研究。但由于化学诱导乳腺癌发生的动物模型建立的过程长，个体差异很大；而且肿瘤细胞的形态特征差别也很大，所以较少作为肿瘤药物治疗的动物模型。 1.3 移植性乳腺癌实验动物模型 移植性乳腺癌模型的移植物来源于自发性或诱发性乳腺肿瘤细胞株或人类乳腺癌细胞株。根据肿瘤来源不同可分为同种移植和异种移植。通过瘤细胞悬液注射、瘤组织小块接种等方法将肿瘤原位或异位植入动物体内。通过研究认为在对癌细胞的研究中，仅在乳腺癌细胞生长需依靠局部微环境情况下才需要同时移植间质细胞。 1.4 基因乳腺癌实验动物模型 是指染色体基因组中整合有人工导入的外源基因或特定DNA片段并能将其遗传给后代的一类动物。转基因和基因敲除鼠模型中肿瘤生长和进展快速，可以比较方便地获得肿瘤发展的整个过程，但不适于早期肿瘤预防的研究。 1.5腺癌远处转移动物模型 乳腺癌远处转移动物模型的建立首先有利于药物开发，其次可辨别肿瘤转移抑制或促进基因，使其作为一个新的靶点，用于开发新的治疗方法，并使人们更能理解肿瘤转移的复杂性。
作者简介:常卫华(1984-),男,硕士,主要从事肿瘤综合治疗的研究。 E 2mail:lansingasking@yahoo https://www.doczj.com/doc/6e11935391.html, 通讯作者:王留兴(1952-),男,教授,硕士生导师,主要从事肿瘤基础 与临床研究。E 2mail:wlx2246@yahoo https://www.doczj.com/doc/6e11935391.html, 乳腺癌分子靶向治疗的进展与展望 常卫华 综述,王留兴,樊锐太 审校 (郑州大学第一附属医院肿瘤科,河南郑州450052) 关键词:乳腺癌;分子靶向;进展 中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:1673-5412(2009)03-0270-02 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每 年约有120万妇女罹患乳腺癌,占所有女性肿瘤的18%。乳腺癌5年生存率约50%～60%,近50%患者治疗后复发转移。晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～30个月。分子靶向治疗已经成为继手术、放疗和化疗三大传统模式之后一种全新的生物治疗模式,也是当前乳腺癌治疗领域研究的热点。本文就乳腺癌分子靶向治疗的新进展作一综述。1 表皮生长因子受体:酪氨酸激酶抑制剂 表皮生长因子受体(ep ithelia gr owth fact or recep 2 t or,EGFR )表达于除造血细胞外的各种组织,属于Ⅰ 型酪氨酸激酶(tyr osine kinase,TK )受体[1] ,家族有4个成员,分别为HER 21(也称EGFR )、HER 22(也称Erb B2)、Erb B3和ErbB4,在乳腺癌中均有表达。EG 2FR 由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分组成。配体与 受体胞外区结合,引发两个相同或不同EGFR 形成同型或异型二聚体,刺激受体胞内区酪氨酸激酶活性,触发酪氨酸残端的自动磷酸化,通过丝裂原活化蛋白激酶(m it ogen activated p r otein kinase,MAPK )和磷脂酰肌醇3激酶(phatidylinosit ol32kinase,P I 3K )等信号传导途径,最终导致细胞的分裂、迁移、定植、分化等。 拉帕替尼(lapatinib )是一种口服的小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂,可同时作用于HER 21与 HER 22[2]。拉帕替尼双通道抑制酪氨酸激酶[3] 可减少EGFR 异型二聚体,而单一受体的抑制可能提高其他 受体活性的发生率。 在疾病的发生、发展过程中,细胞表面会出现胞外 配体结合域缺失的Erb B2,称为P95ErbB2 ,其酪氨酸激酶活性比野生型更强,可能是曲妥珠单抗耐药的原因之一,并可作为乳腺癌无病生存时间、复发率、死亡率及淋巴结转移等病情判断的独立不良因素,而拉帕替 尼可结合胞内区,抑制BT474乳腺肿瘤细胞的P95 ErbB2 磷酸化[4] 。乳腺癌患者脑转移的几率为10%～16%,但近年来研究提示,HER 22过度表达时脑转移的几率明显升高(34%),其中约50%的患者死于严重的中枢神经系统病变。新近一项随机多中心Ⅱ期临床试验就拉帕替尼治疗乳腺癌脑转移进行了初步研究,在先前接受过赫赛汀及颅内放射治疗的HER 22阳性颅内转移患者,应用拉帕替尼可以缩小脑转移灶体积,给乳腺 癌脑转移的治疗提供了新的途径[5] 。 赫赛汀(trastuzumab,hercep tin )是针对癌细胞HER 22基因靶点的第一个分子靶向药物,给乳腺癌临床治疗带来了新的突破,可单独用于二线、三线治疗或与紫杉醇联合用于一线转移性乳腺癌的治疗。第二个用于HER 22依赖性肿瘤治疗的抗体是帕妥珠单抗(pertuzu mab,omnitarg ),可与HER 22受体胞外结构域Ⅱ区结合,阻止了配基诱导的HER 22二聚化。已经进 入第二、三阶段临床试验[6]。Portera 等[7] 研究显示,赫赛汀加帕妥珠单抗对于先前接受过赫赛汀治疗的患者有治疗效果(客观应答率18%),但可出现与治疗相关的左心室收缩功能不全的毒副反应,整体风险和患者获益有待进一步评估。新近,帕妥珠单抗和卡培他滨联合应用一期临床试验显示在所有规定的剂量水平 都有很好的耐受性,可以进入二期临床试验[8] 。国内报道帕妥株单抗和厄洛替尼对移植到小鼠的人乳腺癌 细胞均有抑制作用,两药合用时效果更好[9] 。2 多药耐受分子的分子靶向治疗 多药耐药性(multidrug resistance,MDR )指肿瘤细 胞不仅对原药耐药,而对结构和作用机制不同的其他药物产生耐受的特性。针对耐药产生机制的靶向治疗能有效逆转MDR 效应,提高化疗效果。热休克蛋白90(heat 2shock p r otein 90,HSP90)是热休克蛋白家族的一员,作为分子伴侣,影响在乳腺癌疾病进程和耐药机制中起重要作用蛋白的稳定性和功能,影响雌激素受体(estr ogen recep t or,ER )的量和结合激素的能力。 Plescia 等[10] 报道了一种新的HSP90抑制剂,细胞可渗透性模拟肽(shepherdin ),一种选择性的不会引起正 ?072?JOURNAL OF BASI C AND CL I N I CAL ONCOLOGY Vol 122No 13Jun 12009
小鼠乳腺癌模型的建立 乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，目前，国内外乳腺癌发病率均呈显著上升趋势，在西方发达国家和我国主要城市女性乳腺癌发病率已居妇女恶性肿瘤的首位。与某些恶性肿瘤不同的是，及时正确的诊断与干预能显著改善乳腺癌患者的生存率及生活质量，甚至能获得终生治愈的效果。为了探索乳腺癌的生物学特征和探讨新的治疗方法，国内外研究者借助乳腺癌动物模型，对乳腺癌的病因、发病机制、早期诊断和治疗等方面开展研究。 目前乳腺癌动物模型的建立可分为自发型、诱发型和移植型三种，每种方法各有利弊，实验室使用最多的是移植型。自发型乳腺癌模型多采用近交系小鼠，如C3H，其生长到一定年龄便自然发生乳腺肿瘤。这种模型最大的特点是实验动物未经任何有意识的人工处理，其发生的条件比较自然，与人类患病过程更为相似。目前此种动物模型是乳腺肿瘤多级预防、治疗和研究发病机制的良好模型。但自发型乳腺癌模型生长缓慢，不易同时获得大批病程基本一致的动物，观察时间长，实验耗费大。诱发型乳腺癌模型是通过经口、涂抹、注射和埋藏等方法应用于实验动物，使之发生乳腺癌。用二甲基苯蒽为诱癌剂诱发乳腺癌，是应用较多的一种方法。这种方法形成的肿瘤与人体肿瘤增殖动力学基本类似，但诱癌过程较长，成功率不高，肿瘤发生的潜伏期个体变异较大，不易同时获得病程或肿块大小均一的模型。相比之下，移植型动物模型克服了上述缺点。迄今，进入移植型动物
模型实验研究的人乳腺癌细胞系有20多种，其中较为常用的有MCF7、MDA．MB-231和MDA．MB-435等。采用移植法建立的乳腺癌模型周期短，成本低，可使实验动物均带有同样的肿瘤，生长速度也较一致，个体差异小，无自发缓解，成瘤率高，是目前实验室应用最多的模型。 对此，重点查阅资料关于移植性乳腺癌动物模型制作的具体步骤。 材料与方法 （1）实验材料 a.动物及分组：取20只昆明鼠随机分成A组（10只），B组（5只），C 组对照组（5只），编号饲养。 b.试剂：无菌水，生理盐水，台酚蓝，2%冰醋酸，甲醛，乙醇，二甲苯，石蜡等。 c.仪器：离心机，显微镜，计数板，电子称，超净工作台，温箱，切片机等。 （2）实验方法 a.模型建立：取H22肿瘤细胞，3000转离心分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4%台酚蓝染色并镜检计数，制成浓度为3*106个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。 b.细胞计数：细胞计数液2%冰醋酸溶液。取50微升细胞悬液加入450微升的细胞计数液中计数。 （3）记录： 接种完成后,逐日观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退,
乳腺癌自杀基因治疗的研究进展 摘要：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来，随着对肿瘤分子病理学认识的不断深入，乳腺癌的基因治疗研究快速发展，某些靶向药物已成功应用于临床并取得了良好的效果。 自杀基因疗法的出现，为乳腺癌的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。 关键词: 乳腺癌自杀基因基因疗法 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。基因治疗是继手术、放化疗以及内分泌治疗之后的一种新兴治疗手段，与传统的治疗模式相比，有更好的靶向性、针对性，更适于对乳癌患者实施个体化治疗。近年来，随着对肿瘤分子病理学认识的不断深入，乳腺癌的基因治疗研究快速发展，某些靶向药物已成功应用于临床并取得了良好的效果。自杀基因（suicide gene）疗法的出现，为乳腺 癌的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略，本文就自杀基因治疗乳腺癌的研究进展作一综述。 1.自杀基因的基本概念 自杀基因是指能将无毒的药物前体转化为细胞毒性物质的基因。转入自杀基因的肿瘤细胞可以被前药的有毒代谢产物选择性破坏。旁观者效应是另一作用机制，是指除了破坏这些整合了自杀基因的肿瘤细胞外，自杀基因对邻近的未被转染的肿瘤细胞也有破坏作用，从而大大提高了该治疗对肿瘤细胞的杀伤能力。 2.自杀基因疗法的机制直接杀伤作用即转染了前药转换酶基 因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒药物，从而直接杀伤肿瘤细胞。1986年Moolten应用逆转录病毒将TK基因导 入肿瘤细胞，被转导的肿瘤细胞（TK+）对丙氧鸟苷（GCV）高度敏感。GCV是一种核苷酸类似物，在TK作用下形成 一磷酸丙氧鸟苷，然后再转化为三磷酸丙氧鸟苷，作为链终止剂，干扰肿瘤细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞 分裂阻抑或死亡。因此，肿瘤细胞内前体药物产物的高浓度淤积，发挥了细胞毒杀伤作用。 旁观者效应（bystander effect）在Moolten还观察到，TK+与TK-肿瘤细胞以一定比例混合时，在GCV的作用下，TK-肿瘤细胞几乎全被杀死。转染了自 杀基因的肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的下拨也被杀死的现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基因载体系统在体内转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀伤作用比较小，因而旁观者
乳腺癌动物模型的研究现状与评价 【摘要】乳腺癌动物模型的建立方法主要可分为自发性、诱发性和移植性3种，每种方法都有其各自的特点和应用条件。 【关键词】乳腺癌;动物模型;现状与评价;综述 乳腺癌是一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤。乳腺癌在世界范围内呈上升趋势［1］，乳腺癌动物模型的制作对进一步研究乳腺癌的病因、发病机理，从而对其进行有效预防、提高治疗效果将起到非常关键的作用。在这方面，国内外有关学者已做了大量工作，现将其研究状况作一综述。 1 实验动物的选择 建立乳腺癌模型时对动物一般要求其癌诱发率高，饲养方便。常选用的动物主要有大鼠、小鼠、裸鼠、猫、犬及兔。其中，大鼠、小鼠由于成本低，易饲养，且诱癌周期相对较短，故多用于大批量的实验研究。但由于不同科系、性别乃至不同鼠龄的大鼠均会直接影响到诱癌率和造模时间，因此，诱癌率较高的Wistar系雌性大鼠常被选用。 裸鼠因先天性缺乏胸腺，T细胞免疫功能接近于零，所以人体肿瘤异种移植时无排斥反应，移植后的人体肿瘤保持其原有的组织形态，免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感
性，且对培养条件等要求比SCID鼠低，无毛，易于动态观察肿瘤的生长状态，同时浸润与转移是人类恶性肿瘤的两个重要特征，在裸鼠上可以通过接种方式、部位的选择，达到较满意的转移效果，因此，目前多选择其进行人乳腺癌细胞异位移植。 2 造模方法 2.1 自发性乳腺癌动物模型 实验动物各群中自然发生或通过遗传育种而保留下来的一类肿 瘤称为自发性肿瘤。C3 H小鼠最常用于自发产生乳腺癌的动物，一般生后6个月可100%产生乳腺癌。自发性肿瘤模型有一定的优点，首先从肿瘤发生来看，与人类肿瘤相比更相似，实验结果更易于外推于人;其次，对影响肿瘤发生、发展的原因更有可能被发现。但其肿瘤发生、发展的时间参差不齐，使实验时间延长，实验所需动物数量多，耗费大。 2.2 诱发性乳腺癌动物模型 使用化学物质、物理、生物因素等可在实验动物中诱发乳腺癌的发生 ［2］，目前较多用的是化学诱导方式。用致癌物质二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳腺癌。以灌胃［3］、局部涂抹［4］或皮下注射来作用于Wistar雌性大鼠。胃管灌注低剂量DMBA，持续3个月，可建立乳腺癌癌前病变动物模型［5］。化学诱导乳腺癌发生的动物模型常用于乳腺癌的病因学研究及预防性研究［6］。实验性肿瘤诱
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
乳腺癌靶向治疗研究获突破 发表时间：2017-02-06T13:49:02.650Z 来源：《医药前沿》2017年1月第02期作者： [导读] 目前，乳腺癌的临床治疗效果虽然大大改善，但耐药和复发转移现象日益严重。 大连医科大学附属第二医院徐岭植博士及其团队在乳腺癌干细胞特性及靶向治疗领域取得新成果，首次阐述了p62/SQSTM1-let-7a/b-MYC信号通路对乳腺癌肿瘤干细胞特性的关键调控效应，提示信号枢纽蛋白p62/SQSTM1可以作为干预的有效靶点，为攻克乳腺癌的复发转移和耐药提供了新思路。相关研究论文近日在线发表于《癌基因》上。 目前，乳腺癌的临床治疗效果虽然大大改善，但耐药和复发转移现象日益严重。越来越多的证据表明，肿瘤干细胞与肿瘤治疗过程中的药物抵抗、疾病复发和转移高度相关。但由于肿瘤干细胞的动态演进及高度异质性，针对肿瘤干细胞的治疗仍然缺乏有效的靶点和干预机制。 p62/SQSTM1蛋白作为细胞内的“信号枢纽”，通过自身一系列功能结构域，与多种信号分子相互结合，参与调节多种信号通路。在该项研究中，研究人员以乳腺癌为例，通过体外细胞系实验及裸鼠体内动物实验，首次揭示信号蛋白p62/SQSTM1在肿瘤干细胞富集群体中高表达，并且对肿瘤干细胞的“干性”特征起正向调节作用，干预该基因的表达可显著降低肿瘤干细胞的“干性”能力。研究团队还发现，信号蛋白p62/SQSTM1可通过下调一种微小RNA—let-7a/b的表达，促进致癌基因MYC转录后的mRNA稳定性，从而介导维持肿瘤干细胞的“干性”表型。后续的临床样本分析进一步验证了信号蛋白p62/SQSTM1的高表达与乳腺癌患者的PFS和OS呈负相关。 大连医科大学肿瘤中心主任刘强教授及大连医科大学附属第二医院院长、乳腺肿瘤研究团队赵作伟教授为该研究的共同通讯作者。
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
乳腺癌靶向治疗进展 云南省第一人民医院缪堃 关键词：乳腺癌靶向治疗 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万妇女罹患乳腺癌，占所有女性肿瘤的18％。在我国发达地区，乳腺癌的发病率已上升至女性恶性肿瘤的第一位，并每年以较快速率递增。分子靶向治疗是当今肿瘤治疗领域的热点，代表了肿瘤药物治疗的最新发展方向。本文就乳腺癌分子靶向治疗的新进展作一综述。 一、HER受体家族为靶点的药物 1、曲妥珠单抗（Trastuzumab or Herceptin 赫赛汀） HER-2蛋白在20～30％的乳腺癌患者中有过表达现象，此现象往往提示肿瘤的恶性程度高，进展迅速，化疗缓解期缩短，无病生存期和总生存期缩短，对三苯氧胺和细胞毒性化疗药耐药，但对大剂量蒽环类／紫杉类药物疗效好。由于HER-2／neu蛋白位于细胞表面，易被抗体接近，故HER-2蛋白可作为抗肿瘤治疗的一个靶点。Herceptin的活性成分为Trastuzumab，它是一种针对HER-2／neu蛋白设计的人源化人鼠嵌合型单抗，其与HER-2受体结合，干扰后者的自身磷酸化及阻碍同源二聚体形成，阻止信号传导系统激活，从而抑制肿瘤细胞增殖。2001年，Slamon等[1]报道，469例晚期乳腺癌分别接受Trastuzumab联合AC（ADM60 mg/m2或E-ADM75mg/m2，CTX600mg/m2；没有接受过蒽环类治疗的患者）或T（PTX175 mg/m2，静滴3小时；曾经接受过蒽环类辅助化疗的患者）方案与单纯化疗相比，联合Trastuzumab组与单纯化疗组的有效率（RR）、中位肿瘤进展时间(mTTP)和1年死亡率分别为50％：32％(P< 0.001）、7.4个月：4.6个月(P<0.001）和22％：33％（P=0.008），提示与单用化疗相比，化疗加Trastuzumab一线治疗Her-2过表达的转移性乳腺癌能明显提高疗效。后续又有多个临床试验均显示，Trastuzumab联合多西紫杉醇、卡培他宾、长春瑞宾、吉西他滨等化疗药物都有显著的疗效[2]，因此HER-2过表达的晚期乳腺癌患者的最佳治疗是 Trastuzumab联合化疗。 由于50％的HER-2过表达乳腺癌同时表达雌激素受体（ER），KAUFMAN等[3]研究发现，Trastuzumab联合阿那曲唑较阿那曲唑单药能更显著地延长HER-2阳性激素依赖转移性乳腺癌的无进展生存期（PFS），但未见总生存的延长。 对于Trastuzumab联合化疗过程中出现肿瘤进展的治疗选择，2008年GBG-26 TBP研究[6]报告了156例二线治疗HER2过表达、Trastuzumab耐药的复发转移性乳腺癌患者，随机分为单药卡培他滨（2500mg/m2，d1-14；q3w）和卡培他滨+Trastuzumab（6mg/kg, q3w）组，中位随访11.8个月后，两组无进展生存期5.6个月和8.2个月（HR0.69;P= 0.0338）、有效率27％：48.1%（P= 0.0115）、总生存有延长趋势20.4个月:25.5个月（HR0.76;P= 0.257），结果显示Trastuzumab进展后继续用Trastuzumab联合卡培他滨，较单药卡培他滨有更高的疗效，而毒副反应相似。 根据NSABPB-31、NCCTG N983l、HERA和BCIRG 006的研究结果[4]，在原发灶>1cm，不管有无淋巴结转移患者，Trastuzumab可使早期乳腺癌患者复发风险降低36％～52％，死亡风险降低33％，不同亚型的HER-2阳性患者均能获益，提示对HER -2阳性的患者，在术后辅助治疗上，也应考虑选择含Trastuzumab的联合方案。但对肿瘤<1cm而无腋窝淋巴结受累的HER-2阳性患者，其危险增加的证据有限，尚无给予抗HER-2治疗的明确证据[5]。 2、拉帕替尼（Lapatinib） Lapatinib为口服、靶向Her-1和Her-2受体的双靶点TKI，2008年报告的Lapatinib治
乳腺癌小鼠模型的研究进展 摘要】乳腺癌动物模型是研究人类乳腺癌生物学行为以及寻求治疗方法的重要 工具。本文在总结近年来最新研究成果的基础上系统的阐述了乳腺癌研究中常见 的小鼠模型，有助于研究者全面的了解其最新的研究进展情况，为乳腺癌的发病、机制、治疗、预防研究提供帮助。 【关键词】乳腺癌；小鼠模型；基因工程型；中医乳腺癌模型 【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）24-0010-02 乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重危害女性健康。小鼠与其它实验 动物（如果蝇、线虫或大鼠）相比有较多的优势，尤其是其基因组中许多癌基因、肿瘤抑制基因已被发现并定位，使其成为生物医学研究中最常用的哺乳类实验动物。现将目前乳腺癌小鼠模型的研究进展进行综述。 1.自发性乳腺癌模型 自发性肿瘤动物模型是指未经任何有意的人工处理而自发产生肿瘤。目前已 报道的品系有C3H系、A系、CBA/J系、TA2系等，其中C3H小鼠自发性乳腺癌 发病率高，6～10个月龄雌鼠的肿瘤自然发生率可高达100%，是最常用的自发性乳腺癌模型[1]。该模型发病条件比较自然，有利于研究乳腺癌的发病机制。但由 于很难获得大量发病时间相同的荷瘤小鼠，不利于药效评价。 2.诱发型乳腺癌模型 目前对诱发型乳腺癌小鼠模型的研究并不多。Lanan等对BALB/C小鼠持续使 用醋酸甲基孕酮诱导一年后，成瘤率为79%[2]。张亚平[3]用二甲基苯蒽灌胃 C57BL/6小鼠诱导产生乳腺癌。该模型可模拟外界环境因素所致的人类肿瘤发病 的特点和过程，在预防医学的病因学研究及综合化疗后的效果评价中发挥一定的 作用。但由于小鼠个体差异及诱导剂等多因素导致肿瘤发生的部位与时间不同， 成瘤率不高，不利于药物筛选。 3.移植型乳腺癌模型 根据移植物来源不同分为同种移植和异种移植。同种移植所用小鼠为免疫功 能正常的小鼠，所用乳腺癌细胞或组织有严格的种系特异性，常用的细胞株有来 源于BALB/C小鼠的4T1和TM40以及C127[4]。异种移植模型是指将人类肿瘤细 胞系（如MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435、BT-474等）移植于免疫缺陷的小 鼠体内，目前常用的免疫缺陷小鼠有裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠。相比于同种移植，异种移植肿瘤能模拟人乳腺癌成瘤后过程。移植模型建立 所需时间短，成本低，成瘤率高，且所带肿瘤生长速度大致相同，是目前抗癌药 物筛选和药效学研究常用的方法。然而小鼠乳腺癌与人类乳腺癌仍存在一定的差异，其不是自然发病，不能用于病因学、癌前病变和癌变的研究。 4.基因工程型乳腺癌模型 运用分子生物学技术敲除某些肿瘤抑制因子和易感基因或插入某些癌基因建 立的乳腺癌小鼠模型。目前建立的基因工程小鼠有MMTV-PyMT[5]，MMTV- Neu[6]，MMTV-Wnt-1[7]，WAP-Ras[8]，MMTV-PyMT和CD44-[9]；MMTV- huHER2[10]；P53基因敲除鼠和Cdkn2a基因敲除鼠等[11]。其中研究较多的是MMTV-Wnt-1转基因小鼠[12]。基因工程小鼠为环境因素与遗传背景相互作用的 研究提供了很好的模型，其肿瘤生长和进展快速，可方便的获得肿瘤发展的整个 过程，但不适于早期肿瘤预防的研究。而且模型建立过程较长、费用较高，影响