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（收稿日期：2013-02-03）
·讲座与综述·
表面增强激光解吸电离—飞行时间—质谱技术在肿瘤早期诊断中的
应用进展
刘锦基（综述），韩丽英（审校）
作者单位：646000 四川省泸州市，泸州医学院附属医院血液内科
【关键词】 蛋白质芯片；表面增强激光解吸电离—飞行时间—质谱；肿瘤标志物；蛋白质组学【中图分类号】 R 730.4 【文献标识码】 A 【文章编号】 1674-3296（2013）04B -0174-03
基因革命创造了一个关于明确细胞内部运作的基本遗传
密码的信息财富。蛋白质是基因表达的最终产物，故了解蛋白质的功能将有利于新型药物靶标的发现，以及崭新的特异性治疗方法。蛋白质组学（proteomics ）作为分析化学的一个新领域，主要目标是通过肽类或蛋白类的高表达或低表达，评估那些可以区分健康样本和病患样本，并且可以作为早期诊断的疾病相关肿瘤标志物，同样其可以作为疾病进展的测定指标。蛋白质指纹图谱技术———表面增强激光解吸电离—飞行时间—质谱（surfaced?enhanced laser desorption?ionization?time of flight mass spectrometry ，SELDI?TOF?MS ）是随着蛋白质组学的研究而
兴起的一种新技术，是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台，可快速、准确、大量地筛查组织和细胞内的蛋白质，找出特异性肿瘤标志物，对于肿瘤的早期诊断具有重大意义。本文将就蛋白质芯片SELDI?TOF?MS 技术的原理、优势及在肿瘤早期诊断中的研究现状做一综述。1 SELDI?TOF?MS 系统的技术原理
SELDI?TOF?MS 技术于2002年由诺贝尔化学奖得主田中
耕一［1］
发明，其工作原理是：芯片表面经化学（阳离子、阴离
子、疏水、亲水和重离子鳌合等）或生物化学（抗体、受体、核酸等）处理，特异性地与被测标本中蛋白结合，再通过选择性清洗，获得高分辨率的保留蛋白谱。当加入能量吸收分子后，芯片上保留的蛋白形成晶体。在特异性激光照射下，晶体发生解离作用，带电分子在通过电场时加速，检测仪记录飞行时间的长短。质量越轻，相对所带电荷越多，质荷比（M /Z ）越小，飞行时间越短，就会被最先地检测到。信号由高速的模拟数字转化
器转换并记录下来，被测定蛋白质以一系列峰值的形式呈现。这些特异性波峰即构成了该疾病特有的指纹图谱。SELDI 蛋白指纹图谱中横轴表示蛋白类型，而纵轴表示蛋白质的强度和丰度，单个蛋白在图谱上的位置取决于飞行时间。SELDI 软件
能快速处理、分析大量的质谱信息，发现其中的差异蛋白［2、3］
。
2 SELDI?TOF?MS 技术在肿瘤早期诊断中的应用
肿瘤严重危及人类的健康，已成为人类死亡的重要原因之一，治疗肿瘤的关键在于肿瘤的早期诊断。利用SELDI?TOF?
MS 技术可以快速、准确地筛查、寻找特异性肿瘤标志物，从而能有效地进行肿瘤的早期诊断。目前，该技术已经广泛应用于多种肿瘤的早期诊断研究中。
2.1 鼻咽癌 鼻咽癌是临床常见的恶性肿瘤之一，由于临床症状无特异性，且发病部位深在，其早期诊断始终是一个大挑战。陈慧菁等［4］应用SELDI 技术分析102例鼻咽癌患者及
118例健康对照的血清标本，发现鼻咽癌组与健康对照组之间
有25个血清蛋白质谱峰差异，13个蛋白质峰表达下调，12个
蛋白峰表达上调，敏感度为97.56%，特异性为88.89%，准确率为92.63%，阳性预测值为86.96%，阴性预测值为97.96%。
该研究对鼻咽癌的早期诊断及临床分型具有一定的指导意义。
Cao 等［5］应用SELDI?TOF?MS 技术分析了134例鼻咽癌患者及
73例健康人的血清标本，发现鼻咽癌组与健康对照组之间有8
个显著的蛋白质峰，并应用这些蛋白质峰进行验证，发现敏感性和特异性分别为90.9%和92.0%，均高于传统的肿瘤标志物EBV 。SELDI 技术能够直接检测出鼻咽癌患者血清中特异
性肿瘤标志物，对于鼻咽癌的早期诊断具有较高的敏感性和特异性。
2.2 肺癌 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌发病率及病死率逐年上升，但目前仍缺乏有效的早期诊断措施。SELDI?
万方数据
TOF?MS技术具有快速、简便、敏感等特点，有望成为研究肺癌发病机制、早期诊断及治疗的重要手段。Monari等［6］应用SELDI技术来寻找非小细胞肺癌的肿瘤标志物，在研究中分析了44例非小细胞肺癌患者和19例健康人的血清样本，得出28个有意义的蛋白质峰（孕<0.05），并分别建立诊断决策树，通过检测发现该决策树区分非小细胞肺癌患者和健康人的准确性分别为90.91%和92.06%。Sreseli等［7］通过SELDI?TOF?MS技术检测139例肺癌患者和158例健康人的血清标本，得出17个有意义的蛋白质峰，并以这17个蛋白质峰建立肺癌诊断模型，验证后发现该模型敏感性和特异性分别为87.3%和81.9%，对早期肺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）诊断的敏感性和特异性分别为96.0%和66.7%。表明利用SELDI?TOF?MS技术寻找特异标志物能有效地区分肺癌患者与健康人，为肺癌诊断提供了一个可靠的平台。
2.3 肝癌 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，进展迅速，病死率高，寻找诊断效率高的肿瘤标志物对改善患者预后具有重要意义。Chen等［8］采用SELDI?TOF?MS技术对120例肝癌患者及120例肝硬化患者血清标本进行检测分析，共发现80个差异蛋白质峰，并选择其中5个具代表性的差异蛋白质（质荷比分别为3324、3994、4665、4795和5152Da）建立诊断模型，该模型方法鉴别肝癌、肝硬化敏感度和特异度分别为98%和95%，而且进行盲法检测后，发现其诊断肝癌精确度为83%，诊断肝硬化精确度为92%。该研究同时将SELDI?TOF?MS技术鉴别肝癌及肝硬化的敏感度和特异度与甲胎蛋白（AFP）进行比较，尤其对早期肝癌的诊断，其均高于AFP。上述研究表明，SELDI技术在肝癌的诊断，特别是在早期诊断上具有良好的应用价值。
2.4 甲状腺癌 甲状腺癌是常见的恶性肿瘤，由于大部分甲状腺癌患者早期无特异性临床表现，延误了治疗时机，寻找有效诊断甲状腺癌的肿瘤标志物成为目前亟待解决的问题。Fan 等［9］应用SELDI?TOF?MS技术检测108例原发性甲状腺癌患者和116例健康人血清标本寻找差异蛋白，筛选出3个最显著的差异蛋白质（M/Z位于9190、6631和8697Da）。并联合应用这3个差异蛋白质进行盲法检测，发现其敏感度和特异度分别为95.15%和9
3.97%。在Bioworks数据库查询，检索对应的可能蛋白得出，M/Z位于9190、6631和8697Da处蛋白标志物分别为结合珠蛋白α?Ⅰ链、载脂蛋白C?Ⅰ和载脂蛋白C?Ⅲ。上述研究表明，应用SELDI?TOF?MS技术可以有效地区分甲状腺癌患者与健康人群，对甲状腺癌的发病机制和诊断可能具有一定的临床价值。
2.5 结直肠癌 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，早期诊断可明显提高疗效。目前常用的筛查方法，如大便隐血试验、癌胚抗原（CEA）、癌抗原199（CA199）等血清标记物特异性低，而肠镜不易为患者接受，蛋白组学的发展，尤其是SEL?DI?TOF?MS技术的应用对结直肠癌的早期发现和诊断具有重要意义。Helgason等［10］通过SELDI?TOF?MS技术对42例大肠癌患者化疗前及化疗后的血清标本与42例健康对照者的血清标本进行比较，寻找出13个蛋白质峰，其中质荷比为14060Da 和28100Da的2个蛋白质峰对区分大肠癌患者和健康人最具有意义，且28100Da的蛋白峰被鉴定为载脂蛋白A?I。同时通过分析发现，6个蛋白质在区分对化疗是否有效中具有意义，其中质荷比为3330Da的蛋白质最有意义。由此可见，SELDI?TOF?MS技术在结直肠癌的诊断、分期、治疗监控和预后方面具有一定的应用价值。
2.6 淋巴瘤 淋巴瘤是一类来源于淋巴细胞的恶性肿瘤，早期多无典型临床表现和阳性体征，妨碍了早期诊断及治疗，并影响预后，故早期发现淋巴瘤血清学的特异性标志物对淋巴瘤的早期诊断、治疗及预后具有重大意义。Rolland等［11］通过SELDI?TOF?MS技术检测了18例套细胞淋巴瘤、20例小淋巴细胞淋巴瘤、20例边缘区淋巴瘤及7例正常外伤脾脏的活组织细胞降解产物，得出107个有特异性蛋白质峰，其中43个在淋巴结中高表达，64个在脾脏中高表达。并通过分析找到套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤分别有9、12、16个蛋白质峰。利用这些蛋白质峰建立一个诊断模型，发现上述95%的淋巴瘤病例可以诊断。Zhang等［12］应用SELDI技术检测了35例非霍奇金淋巴瘤患者、32例淋巴结炎患者和29名健康人的血清标本，健康人组和淋巴结炎组共检测出29个差异蛋白，健康人组和非霍奇金淋巴瘤组共检测出33个差异蛋白，在淋巴结炎组和非霍奇金淋巴瘤组检测出34个差异蛋白，选出其中最具有代表性的差异蛋白（M/Z为583
3.29、8877.14、9069.60、5339.59、8543.23、8765.39）建立诊断模型，得出健康人组与淋巴结炎组、健康人组与非霍奇金淋巴瘤组、淋巴结炎组与非霍奇金淋巴瘤组的诊断敏感性与特异性分别为78%和90%、69%和90%、74%和84%。表明SELDI?TOF?MS技术对淋巴瘤的诊断具有较高的敏感性和特异性，在淋巴瘤的诊断、监测疗效、评估预后等方面有巨大应用前景。2.7 卵巢癌 卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，80%的患者初诊时已属晚期，故寻找有效的早期诊断卵巢癌的肿瘤标志物将大大改善其预后，SELDI?TOF?MS技术的应用加快了肿瘤标志物的筛选和研究。Wu等［13］应用SELDI?TOF?MS技术联合磁珠法分析比较40例卵巢癌患者及60例健康人的血清标本，发现3个特异性标志物（5486、6440和13720Da），其敏感度为90%，特异度为86.7%。并对该诊断模型进行盲法分析预测发现，其敏感度和特异度分别为88%和83.3%。Wegdam 等［14］应用SELDI?TOF?MS技术检测了53例卵巢癌患者、18例低度恶性肿瘤患者和57例卵巢良性肿块患者的血清，以及84例卵巢癌患者的组织切片，寻找其中的差异蛋白，并利用特异性蛋白质峰进行交叉验证，发现卵巢癌与卵巢良性肿块患者有效区分的准确性达95%耀100%。上述研究表明，SELDI?TOF?MS技术作为一种高效筛查特异蛋白标志物的技术，可以成为卵巢癌早期诊断的有效工具。
2.8 乳腺癌 目前，诊断乳腺癌缺乏理想的肿瘤标志物，常用的肿瘤标志物，如癌抗原153（CA153）检测乳腺癌，敏感度和特异性都较低，给乳腺癌的早期诊断、术后疗效评价及随访检测等造成了不便。Fan等［15］通过SELDI?TOF?MS技术测定分析了124例乳腺癌患者和158例健康人的血清标本的蛋白质谱，应用3个蛋白质峰（质荷比分别为6630、8139、8942Da）建立乳腺癌诊断模型，并进行盲法验证，得出该模型诊断的敏感性和特异性分别为96.45%和95.87%。通过认证发现，6630蛋白质峰为载脂蛋白C?I，而8139蛋白质峰和8943蛋白质峰分别为C3a的短C端和补体C3a。Sauter等［16］应用SELDI?TOF?MS技术联合IMAC30、CM10及Q10蛋白芯片分析125名妇女的乳头抽吸液，得出16个蛋白质群与乳腺癌相关，其中最具代表的是质荷比为3592、4362、6570/6580和15870Da的蛋白峰。利用上述蛋白质峰建模发现，质荷比为4362的蛋白峰敏感度>87%，而质荷比为3592的蛋白质峰特异度>94%。
万方数据
并通过测序发现3592蛋白质峰为一种β?酪蛋白样肽。表明通过SELDI技术寻找特异性蛋白并结合临床资料，可以较好地筛查乳腺癌。
2.9 胃癌 胃癌占消化道恶性肿瘤的首位，病死率高，但目前仍缺乏有效的早期筛查方法，寻找敏感性、特异性高的胃癌标志物是胃癌早期发现的研究方向。Qiu等［17］应用SELDI技术检测分析了43例胃癌患者和41例胃炎患者的血清蛋白质指纹图谱差异，共检测到50个差异蛋白质峰，选出其中5个（质荷比分别为4484、4542、6443、4988、6684Da）进行建模，其敏感性和特异性分别为84.2%和85%，均高于CEA。Lu等［18］应用SELDI?TOF?MS技术对65例胃癌患者和60例健康人的血清进行检测，并选出其中5个蛋白质峰（质荷比分别为2046、3179、1817、1725和1929Da）组成胃癌诊断模型，用该诊断模型进行盲法检测发现其敏感度为80%，特异度为7
3.5%，与传统胃癌肿瘤标志物CEA和CA199相比更具有临床诊断价值。该研究者同时选用质荷比为4665的蛋白质峰来区分Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期胃癌，得出其特异度为91.7%、灵敏度为86.3%。该研究证明，SELDI技术可以用来检测胃癌，尤其对早期胃癌的检测具有重要作用。
2.10 其他 SELDI?TOF?MS技术还被应用于前列腺癌［19］、膀胱癌［20］、胰腺癌［21］、白血病［22］等恶性肿瘤的研究中，均提示该技术对肿瘤的早期诊断有良好的应用前景。
3 展 望
自20世纪至今，SELDI?TOF?MS技术得到了飞速发展，由于此技术具有样品需用量少、检测速度快、样品无需特殊处理、特异性强、选择性强和高通量等特点，已被广泛应用于生物标志物的发现、肿瘤标志物筛查、药物研究、疾病诊断及预后监控等多个领域。然而，该技术也存在一些亟待解决的问题，如SELDI技术仅能检测蛋白质分子量，而不能直接鉴定；重复性较差；芯片的制作成本较高，不利于临床上推广等。但相信，随着SELDI技术的不断完善，该技术将会更快速、高敏感性和高特异性地进行蛋白质图谱分析，成为各种恶性肿瘤的发病机制研究、筛选肿瘤标志物、寻找特异性靶标、疾病疗效及预后监测等方面的有效手段，具有广泛的应用前景。
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（收稿日期：2013-02-20）
万方数据
国家计量技术规范规程制修订 《飞行时间质谱仪校准规范》 （报批稿） 编写说明 中国计量科学研究院 广东省计量科学研究院 南京市计量监督检测院 2013年5月
《飞行时间质谱仪校准规范》（报批稿） 编写说明 一、任务来源 根据国家质量监督检验检疫总局2009年国家计量技术法规计划（国质检量函〔2009〕393号）立项，由中国计量科学研究院、广东省计量科学研究院和南京市计量监督检测院共同承担《飞行时间质谱仪校准规范》的制定工作。 二、规范制定的必要性 飞行时间质谱仪是一种高分辨质谱仪，这类仪器的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比的大小进行分离。与高端的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪、离子阱静电场轨道阱质谱仪相比，飞行时间质谱仪具有可检测的分子量范围大，扫描速度快，仪器结构简单，价格便宜等优势。近年来随着蛋白质组学和代谢组学的发展，各实验室飞行时间质谱仪的数量迅速增加，这些仪器除了被用于基础科研外，还被广泛地用于样品检测。据不完全统计，各个检测和校准实验室每年使用飞行时间质谱仪出具的报告数量达到1000份以上。根据《ISO/IEC 17025:2005 检测和校准实验室能力的通用要求》，检测校准实验中使用的分析设备都应当经过检定或校准，以保证仪器的准确性和测定结果的可溯源性，从而保证各个检测和校准实验室在不同时间、不同地点测定结果的准确、可比。飞行时间质谱仪由于没有检定规程或者校准规范，无法对仪器进行检定校准，已经成为当前实验室认可工作中的瓶颈之一。通过制定飞行时间质谱仪校准规范，实现仪器的校准，可以保证我国飞行时间质谱仪出具检测报告的准确有效，保护人民大众的健康，保证国际贸易的公平。 三、《飞行时间质谱仪校准规范》的制定过程 1、2008年4月28日，起草小组向主要飞行时间质谱仪生产厂家安捷伦、沃特斯、布鲁克、AB和岛津公司发函，要求其提供各自生产的各种型号的飞行时间质谱仪的质量数范围、质量准确度、信噪比、分辨力、质量数漂移、校准品等信息，作为规范制定时的参考。随后，各个厂家相继返回相应信息。
生物质谱技术在蛋白质组学中的应用（北京大学药学院 杨春晖 学号：10389071） 一、 前言[1，2] 基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。 目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS 联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。 二、 生物质谱技术[3，4] 1．电喷雾质谱技术（ESI）[5] 电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）[5-7] 基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞
液相色谱-四极杆/飞行时间质谱联用（HPLC-QTOF） 一、开机 1.打开计算机，LAN Switch电源。 2.打开液相各个模块电源，打开质谱前面的电源开关，等待大约两分钟，当听到第二声溶剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，仪器可以联机。 3.在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标，进入MassHunter工作站。 4.如果MassHunter工作站在之前曾经打开和关闭过，请确认在再次打开工作站之前，关闭MassHunter所有的进程；双击桌面上的图标，在弹出的窗口点击Shut Down，等待所有的Status都变为Terminated后，点击Close。然后再打开MassHunter工作站。注意：在MassHunter采集软件关闭后，再次打开之前，必须执行上面的操作，否则无法进入采集软件。 5. 点击Standby按钮，检查前级真空（典型值应≤2.5Torr）和高真空，等到高真空≤2×10-6Torr后，关闭工作站。 6. 进入仪器诊断软件界面，在菜单上选择Connection > Connect，输入IP地址 192.168.254.12，点击OK。 根据不同的情况，选择不同的Condition HV的模式。0.6 Hour Cycle (Quick Vent) 适用于Q-TOF短暂关机后的Condition，比如更换泵油，短时间停电等。2 Hour Cycle (Optics Service) 适用于对Q-TOF关机，进行简单维护后的Condition，比如清洗毖绅管等。8 Hour Cycle (TOF Service) 适用于对Q-TOF关机，进行比较长时间的维修后的Condtion，比如仪器出现故障后Agilent工程师上门维修后再次开机。13 Hour Cycle (Installation) 适用于Q-TOF安装时第一次开机后的Condtion；当者是比如长假关机后再次开机。 7. 标签栏显示Instrument ON/OFF界面，点击Condition HV。 8. 当Condition HV结束后，在File菜单上选择Connection > Disconnect，关闭TOF Diagnostics软件。 9. 重新进入MassHunter工作站。 二、调谐和校正
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
飞行时间质谱系统 本产品由主机和计算机（含分析软件）组成，其中主机主要由激光器、质量检测器、靶板、真空泵组和开关电源组成。 飞行时间质谱系统Clin-ToF-Ⅱ通过检测生物大分子的分子量，使用蛋白指纹图谱技术，用于对口腔分离的乳酸杆菌、变异链球菌以及白色念珠菌的鉴定。 1.1 产品名称 本仪器全称为飞行时间质谱系统（Clin-ToF-Ⅱ） 1.2 产品型号 1.3 产品结构组成 由主机和计算机（含分析软件）组成，其中主机主要由激光器、质量检测器、靶板、真空泵组和开关电源组成。 2.1外观 外壳应表面整洁，色泽均匀，无伤斑，裂纹等缺陷； 文字和标志应清晰可见；各指示或显示装置应准确清晰； 塑料件应无起泡、开裂、变形以及灌注物溢出现象； 控制和调节机构应灵活可靠，紧固部位应无松动。 2.2技术参数(性能要求) 2.2.1质量测量范围 质谱仪检测离子的质荷比范围为1540Da ～16950Da 。 2.2.2准确度 2.2.2.1内标法 以参考品B完成校对后，参考品A、C的质量漂移应在800ppm内；以参考品D完成校对后，参考品E的质量漂移应在1500ppm内；以参考品F完成校对后，参考品G的质量漂移应在800ppm内。 2.2.2.2外标法 参考品A、B、C、D、E、F、G分别点在靶板上邻近的两点，以其中一点的参考品进行校对，另一点内的参考品质量漂移应在1500ppm内。 2.2.3灵敏度 表示质谱仪在一定信噪比下能够出峰的所需样品量。浓度为10 fmol/μl 的参考品A、浓度为20 fmol/μl的参考品B、浓度为2pmol/μl的参考 品C、浓度为5pmol/μl的参考品D、浓度为10pmol/μl的参考品E条件下，检测参考品A、B、C、D、E，应有信噪比 (S/N) ＞3的出峰。 2.2.4分辨率 50 < 分辨率 < 3500。 2.2.5重复性 检测参考品A、B、C、D、E物质，重复15次实验，CV＜1%。 2.3系统功能
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
飞行时间质谱技术及发展 前言：质谱分析是现代物理与化学领域使用的极为重要的工具。目前日益广泛的应用于原子能，石油以及化工，电子，医药等工业生产部门，农业科学研究部门及物理电子与粒子物理，地质学，有机，生物，无机，临床化学，考古，环境监测，空间探索等领域[1]。飞行时间质谱飞行时间质谱仪较其他质谱仪具有灵敏度好、分辨率高、分析速度快、质量检测上限只受离子检测器限制等优点，再配合电喷雾离子源基体辅助激光解析离子源[2]大气压化学电离源等离子源，使之成为当今最有发展前景的质谱仪。飞行时间质谱已用于研究许多国际最前沿的热点问题，是基因及基因组学、蛋白质及蛋白质组学、生物化学、医药学以及病毒学等领域中不可替代的有力工具，例如肽和蛋白分析、细菌分析、药物的裂解研究以及病毒检测。特别是在大通量、分析速度要求快的生物大分子分析中，飞行时间质谱成为唯一可以实现的分析手段，例如与激光离子源联用或作为二维气相色谱的检测器等。本文将介绍飞行时间质谱的基本原理、技术及仪器的发展历程。力求对该仪器技术有一个较清楚的认识，并对今后相关的研究工作提供建设性帮助。 1.飞行时间质谱的工作原理：TOF-MS分析方法的原理非常简单。这种质谱仪的 质量分析器是一个离子漂移管。样品在离子源中离子化后即被电场加速，由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，假设离子在电场方向上初始位移和初速度都为零，所带电荷数为q，质量数为m, 加速电场的电势差为V, 则加速后其动能应为： m v2 / 2= qe V 其中，v 为离子在电场方向上的速度。 离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOFMS 进行质量分析的判据。在传统的线性TOFMS，离子沿直线飞行到达检测器；而在反射型TOFMS 中，离子经过多电极组成的反射器后反向飞行到达检测器，后者在分辨率方面优于前者。 2.飞行时间质谱的发展： 由于存在初始能量分散的问题，提高飞行时间质谱分辨率一直是研究者和仪器制造上努力的目标。仪器技术的进展也主要围绕这一目标进行。 2.1离子化技术的发展：最初TOFMS采用电子轰击的方法进行离子化。由电子枪产生的电子电离样品分子使其离解为离子，经加速形成离子束进入飞行区。这种方法可用于气、固、液体样品的分析。其缺点是：1)离子化时间较长，和一般离子的飞行时间数量级相近，容易引起大的误差；2)电子的电离及其进样方式，难以进行大分子样品的分析。目前这种离子化方式多用于小分子的分析。而新的电子发生方式如激光电子枪开始出现。后来脉冲离子发生器应用逐步广泛。用于固体或液体样品的重离子轰击、等离子体解吸(PDMS)及二次离子质谱(SIMS)属于此列。目前脉冲激光技术应用最广，包括激光解吸(LD)、共振激光离子化(RI)、共振加强单多光子离子化（RES/MPI）以及生化分析中常用的基质辅助激光解吸[4] (MALDI))等，适用于不同样品的分析。例如共振激光离子化可用于痕量金属元素的分析[3]。REMPI 则擅长复杂有机物的选择性离子化；MALDI的优点在于：1）可获得高的灵敏度，甚至能检测到离子化区的几个原子；2）对于热不稳定的生物大分子可实现无碎片离子化；3）对固体、液体表面分析，可以很好地控制离子化的位置或深度样品，分析时间大大缩短；4）可以与不同的离子化方式相结合。为解决多肽、蛋白、寡糖、DNA测序等生命科学领域中的前沿分析课题，需要发展特殊电离技术以及超高分辨、高灵敏度、大质量范围、多级串联的高档
This analyser is commonly called the TOF. The TOF is used in single MS systems, with an LC introduction, with a GC introduction, or with MALDI ionisation. In MS/MS configuration, the TOF is associated to a quadrupole (QTof), or to another TOF (TOF-TOF) or to an Ion Trap (QIT/TOF). Principle of the time of flight analyser:In a Time–Of–Flight (TOF) mass spectrometer, ions formed in an ion source are extracted and accelerated to a high velocity by an electric field into an analyser consisting of a long straight ‘drift tube’. The ions pass along the tube until they reach a detector. After the initial acceleration phase, the velocity reached by an ion is inversely proportional to its mass (strictly, inversely proportional to the square root of its m/z value). Since the distance from the ion origin to the detector is fixed, the time taken for an ion to traverse the analyser in a straight line is inversely proportional to its velocity and hence proportional to its mass (strictly, proportional to the square root of its m/z value). Thus, each m/z value has its characteristic time–of–flight from the source to the detector. Time of Flight equations:The first step is acceleration through an electric field (E volts). With the usual nomenclature (m = mass, z = number of charges on an ion, e = the charge on an electron, v = the final velocity reached on acceleration), the kinetic energy (mv /2) of the ion is given by equation (1). mv /2 = z.e.E(1) Equation (2) follows by simple rearrangement. v = (2z.e.E/m)1/2(2) If the distance from the ion source to the detector is d, then the time (t) taken for an ion to traverse the drift tube is given by equation (3). t = d/v = d/(2z.e.E/m)1/2 = d.[(m/z)/(2e.E)] 1/2(3) In equation (3), d is fixed, E is held constant in the instrument and e is a universal constant. Thus, the flight time of an ion t is directly proportional to the square root of m/z (equation 4). t = (m/z) 1/2 x a constant(4) Equation (4) shows that an ion of m/z 100 will take twice as long to reach the detector as an ion of m/z 25: going through the reflectron, the dispersion of ions of the same m/z value is minimized, leading to a great improvement of resolution
iTOFMS-1G/2G宣传稿 全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪GCxGC –TOFMS（iTOFMS-2G） 快速气相色谱-飞行时间质谱联用仪 Fast GC-TOFMS（iTOFMS-1G） 厦门质谱仪器仪表有限公司 2014年5月1日
一、介绍 厦门质谱仪器仪表有限公司（简称厦门质谱公司）传承了厦门大学三十余年质谱技术的研究经验与成果，曾研发成功国内首台高分辨率电喷雾离子源飞行时间质谱仪，是国内一家专注于飞行时间质谱器技术研发与生产的新兴企业。 iTOFMS-G系列是中国首款具有完全自主产权的商品化小型台式气相色谱-飞行时间质谱联用仪。它具有高分辨、高灵敏度和高采集速度的优异功能，实现了与全二维气相色谱/快速气相色谱的完美对接。iTOFMS-G的诞生代表了国产质谱进军通用型高端质谱仪器迈出了重要一步。 ●全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术（Comprehensive Two-dimensional Gas Chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry, GCxGC TOFMS）是近十年以来，国际上发展最迅猛的色质联用技术之一，是色谱-质谱联用技术发展的一个最新趋势。相比于常规气质联用具有高通量、高分离度和高灵敏度等显著优势，是解决复杂体系中全组分和痕量组分分析的最佳方案，逐渐成为石油化工、香精香料、烟草酒业、食品安全、环境监测和中药鉴定等领域的必备分析仪器。 图1 GCxGC-TOFMS（iTOFMS-2G）的实物外观图 ●快速气相色谱-飞行时间质谱联用技术（Fast Gas Chromatography-Time of Flight
蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干重质量的50%以上。随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃，最富生命力的前沿研究领域之一。 1 质谱分析的特点与方法 1.1 质谱分析具有很高的灵敏度，能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 1.2 质谱分析的方法质谱分析的软电离技术主要有下列几种：（1）电喷雾电离质谱；（2）基质辅助激光解吸电离质谱；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。以前三种近年来研究最多，应用也最广泛。 2 蛋白质的质谱分析 2.1 蛋白质的质谱分析原理原理是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白质离子分开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 2.2 蛋白质和肽的序列分析现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白质容易很多。近年来随着电喷雾电离质谱（ESI）及基质辅助激光解吸质谱（MALDI）等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOP MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质．多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质研究所必不可缺的关键技术之一，目前在欧洲分子生物实验室（EMBL）及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOP MS蛋白质一级结构（序列）谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。 2.3 蛋白质谱分析方式 a.蛋白图谱，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获得待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。b.利用待测分于在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相序的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。C.与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸。 （1）蛋白消化：蛋白的基因越大，质谱检测的准确率越低。因此。在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶，它于蛋白的赖氨酸和精氨酸处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 （2）基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法（MALDI TOP MS）：简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行发挥，样品然后置
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
飞行时间质谱精确定标的方法利用飞行时间质谱(TOF)探测得到的数据文件截图如下面左图，导入Origin里如右图： 行号即为横坐标，代表飞行时间，每一行数值代表质谱图中相应点的信号强度，如下图： 我们用工具选取一个已知峰的信号，如水(H2O)，见下图，图中显示出该点行号为8642，信号强度为5855：
因为我们已知这个峰代表水(H2O)，那么就可以将飞行时间与质量对应起来。 首先我们要了解，质谱探测得到的信号所代表的是这个物种(H2O)的同位素峰([1]H2[16]O)，那么它的质量就不是平均分子量，而是由确定组成的核素相加得到的质量。 其次我们要了解，由于我们使用的是真空紫外光电离，那么形成的离子应该只带一个正电荷。 因此，质谱探测到的信号实际上是带一个正电荷的阳离子([1]H2[16]O+)。 我们使用下面这个软件来查询相应的m/z值，Measured mass表示质量数，Tolerence表示误差，单位为毫道尔顿，Charge on Molecule表示粒子所带电荷数，下图中的设置表示我们要查询质量数范围为[17.500, 18.500]，带1个正电荷的粒子的可能分子式及其精确质量：
结果给出[1]H2[16]O+的精确质量为18.010016。 将上表拷入Origin中，并做图拟合，步骤如下：
显示下图结果： 将结果粘贴于下表，A、B、C即为定标公式的参数，其含义为m/z=A+B*row+C*row^2： 可自行设计表格，将目标峰的横坐标转化为精确质量数m/z。
Q&A: 1行号究竟代表多少飞行时间？ 一行代表2ns，如行号5000，代表飞行时间10000ns。 这是通过P7888数据采集卡附带的采集软件MCDWin设置的，可以更改。 2怎么定更精确、更大范围的质量？ 本例只提供了定标方法，对于更精确、更大范围的质量定标，就要提供更多的数据点来拟合。可以通过如下两种途径： 2.1选取一个产物较多的质谱，利用已定好标的公式，计算相应产物或碎片峰的质量， 猜测其真实分子式，并将分子式与其实际质量添加入飞行时间-质量对应表中，重 新拟合得到更精确的定标公式。 2.2若大质量产物的分子式不容易猜测，那么通入少量大质量标准样品进行定标。大质 量标准样品推荐芳香烃化合物，比如萘、蒽、菲等，不推荐使用脂肪烃，进入腔 体后非常不易挥发。 3怎么做横坐标为质量数的质谱图？ 按下列步骤： 3.1在数据列左侧插入两列： 3.2将第一列填充为行号：