第三章蛋白质化学
生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。
恩格斯《反杜林论》1878
学习要求：
1. 了解蛋白质生物功能、分类。
2. 了解氨基酸分类、结构，掌握其重要化学反
应和分离、分析方法，重点弄清楚它的两性
性质,pI和 Pk。
3. 掌握蛋白质的一级结构及其序列分析方法。
掌握蛋白质二、三和四级结构的基本概念。
4. 了解蛋白质的重要理化性质。
5. 了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。
一、蛋白质概述
1、概念
蛋白质（protein):
是由20种L-α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。
2、蛋白质的化学组成
⑴元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：
碳 50％-55%
氢 6.5-7.3％
氧 19-24％
氮 16%
硫 0-3％
其他微量
蛋白质的含氮量
大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：
样品中蛋白质含量=蛋白氮×6.25
6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）
⑵分子组成：
经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为α-氨基酸：
O O H C H H 2N R
3、蛋白质的大小与分子量
? 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。 ? 蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da ）或更大。
? 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚
蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV ：4x107）
1 D = 1.66033 10-27 Kg
? 对于只含有多肽链的简单蛋白质：
? 氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110
（氨基酸残基平均分子量 110）
4、蛋白质的分类
分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能
⑴ 按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白；
⑵ 按分子组成：简单蛋白和结合蛋白；
⑶ 按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇
溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。
⑷ 按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白
5、蛋白质的生物学功能
⑴ 催化作用：几乎所有的酶都是蛋白质。⑵ 生物体的结构成分。⑶ 运输和储存。
⑷ 运动作用： 动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动。⑸ 免疫保护作用。⑹ 激素作用：
胰岛素等。⑺ 接受和传递信息的受体：受体蛋白，⑻ 控制细胞生长、分化：生长因子、
阻遏蛋白。⑼ 毒蛋白：植物、微生物、昆虫所分泌。⑽ 许多蛋白在凝血作用、通透作用、
营养作用、记忆活动等方面起重要作用。
6、蛋白质的水解
蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能
够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.
完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。
所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。
大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。
二、蛋白质的基本结构单位—氨基酸
（amino acid ）
? ㈠ 氨基酸的结构
? ㈡ 氨基酸的种类及结构
? ㈢ 氨基酸的重要理化性质
?氨基酸（amino acid, 简写aa)：
蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。
?天然蛋白质由20种氨基酸组成。
1、氨基酸的结构
a、通式：
α-氨基酸中α碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸）
由通式可得出：
1）组成蛋白质的aa都是α-氨基酸（除脯氨酸α—亚氨基酸外）；（2）不同aa仅R 链不同；（3）除甘氨酸外，其余aa的α-碳原子均为不对称碳原子。
2、α-氨基酸的构型：
构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型。
立体构型：氨基在左为L-型；氨基在右为D-型。天然蛋白质中的aa均为L-型；两型aa 的生理功能不同。
3、α- 氨基酸具旋光性
左旋（-）：能使偏振光向左；右旋（+）：能使偏振光向右。旋光特性表示：比旋光度[α]D ，L-氨基酸比旋光度见P76表3-7
构型与比旋光度无直接对应关系
?氨基酸的旋光性和旋光角度与R基团的性质及测定时溶液的pH有关；
?当某氨基酸以等量L、D型混合时，旋光抵消，称外消旋；
?化学合成所得氨基酸为D、L各半的混合物，称DL型，无旋光性，可用化学或生
化方法将二型分开，此时才表现出旋光性。
（二）氨基酸的种类及结构
1、根据是否组成蛋白质来分
①非极性R基团氨基酸（8种）：
丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu）异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro）苯丙氨酸（Phe 色氨酸（Trp）甲硫氨酸（Met）
特点：不易溶于水
R基疏水性大小:Ala＜Met ＜Pro ＜Val ＜Leu＝Ile ＜Phe ＜Trp
这类氨基酸R基的疏水性，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
Pro是唯一的一种α-亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的拐角处.
②极性不带电荷R基团氨基酸（7种）：
甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）
特点：侧链含极性基团，在生理条件下不解离，易溶于水，R侧链能与水形成氢键。
Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。
Cys中R含巯基（-SH），两个Cys的巯基氧化生成二硫键，二硫键在蛋白质的结构中具有
重要意义 Cys —s —s —Cys
③ R 基团带负电荷氨基酸：
天冬氨酸（Asp ）谷氨酸（Glu ）在生理条件下,侧链羧基完全解离，带负电荷。为酸性氨基
酸
④ R 基团带正电荷氨基酸：
赖氨酸（Lys ）精氨酸（Arg ）氨酸（His ）为碱性氨基酸，在生理条件下，侧链解离，带正
电荷。
4、按人体是否可合成来分：
必需氨基酸：Lys Val Ile Leu phe Met Trp Thr
半必需氨基酸：Arg His
非必需氨基酸：其余氨基酸 5、蛋白质中几种重要的稀有氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常
本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-
羟基脯氨酸、 5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。 6、非蛋白氨基酸
广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结
合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部
也是蛋白质氨基酸的衍生物。结 构 特 点：（1）
大多是L-型α–氨基酸的衍生物，L-瓜氨酸
（Cit ） 、L-鸟
氨酸（Orn ）（2）β-、γ-、δ-氨基酸 β-Ala 、
γ-氨基丁酸。
（3）D-型氨基酸
D-Glu 、D-Ala （肽聚糖中）
D-Phe （短杆菌肽S
非蛋白氨基酸存在的意义：
1.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala
2.作为一些重要代谢物的前体或中间体: -丙氨酸（VB3）、鸟氨酸（Orn ）、胍氨酸（Cit ）(尿
素)
3.作为神经传导的化学物质：γ-氨基丁酸
4.有些氨基酸只作为一种N 素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）
5.杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能
抑制细菌的生长。
（三）氨基酸的理化性质
1. 氨基酸的一般物理性质
⑴ 氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性α-碳原子，因此都具有旋光性。
比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。
旋光性：旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的，称右旋光物
质，记为“+”，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为“-”。氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。除甘氨酸外，其它氨基酸的α-C原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称C原子。手性中心（chiral center）：当一个C原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。
⑵氨基酸的光吸收
构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力,因其含有苯环共轭双键的R侧链。酪氨酸的 max＝275nm，苯丙氨酸的 max＝257nm，色氨酸的max ＝280nm。
所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。此法快速简便。
⑶高熔点
⑷一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。
⑸氨基酸一般有味
2、两性解离与等电点（两性性质）：
（1）氨基酸为两性电解质：氨基酸在水溶液中或在晶
体状态时主要时以两性离子的形式存
在。
氨基酸在水中的两性离子既能像
酸一样放出质子，
也能像碱一样接受质子，氨基酸具有
酸碱性质，是一
类两性电解质。
（2）氨基酸解离方式取决于所处环境的pH：
在电场中，阳离子向负极移动；阴离子向阳极移动；调整pH，使氨基酸净电荷为零时，氨基酸既不向阳极也不向阴极移动。
（3）等电点（isoelectric point, 缩写为pI）：特点：净电荷数等于零，在电场中不移动；此时氨基酸的溶解度最小。
等电点相当于该氨基酸（aa）两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。
A、对侧链R基不解离的中性氨基酸：
pI=1/2（p K1+ p K2）
即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。
氨基酸的解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。当1mol的甘氨酸溶于1L水时，溶液的pH约为6，此时甘氨酸为兼性离子状态R+。若用标准NaOH滴定，以加入的NaOH 摩尔数对pH作图，得滴定曲线B,在pH9.60处有一拐点（滴定中点)。
R+作为酸，由NH3+提供质子，逐渐变为R-,滴定中
点时有一半R+变为R-,即[R+]=[R-]，
则 K2 = [H+]pK2=pH(拐点处）pK2就是R+的
NH3+50%解离时溶液的pH值，K2就是此时溶液
的[H+]
若用HCl滴定，在pH2.34 处有一拐点，拐点处pH即为pK1。R基不解离的氨基酸都有类似甘氨酸的滴定曲线。
氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是当加入酸或碱时具有抗pH改变的溶液，缓冲剂起作用的pH范围称为缓冲范围，通常定义为pK+1至pK-1。
20种基本氨基酸中只有组氨酸的咪唑基的pK最接近生理pH值（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。（血红蛋白）
中性AA的等电点计算：
酸性AA的等电点计算：
碱性AA的等电点计算：
氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。
1.当外液pH为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。
2.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。
3.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向阴极移动。
4.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。
3、氨基酸的重要化学性质
亚硝酸盐反应
烃基化反应
酰化反应
脱氨基反应
西佛碱反应
侧链反应（-SH-OH等）
α-氨基参加的反应
1.与丹磺酰氯反应(与酰化试剂反应）
DNS + AA /多肽/蛋白DNS-AA /多肽/蛋白DNS-AA +游离AA （乙醚抽提，有荧光，纸电游，薄层层析鉴定）用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.
2、氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应，烃基化反应）
+弱碱
DNP-AA(黄色)（二
硝基苯基氨基酸）+ HF DNFB 氨基酸
sanger反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸。
DNFB+多肽/蛋白/AA DNP-多肽/蛋白/AA+ HF DNP-AA
弱碱酸解
（有机相）+ 游离AA（水相）
3、氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应（Edman反应）
+弱碱
苯氨基硫甲酰氨
基酸（PTC）PITC
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA、无
色)（phenylisothiohydantion-AA
）
Edman反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸。
PITC+ 多肽/蛋白PTC—多肽/蛋白PTH-AA + 少一个
弱碱无水甲酸或HF
AA的多肽或蛋白
应用：多肽顺序自动分析仪
羧基参加的反应
叠氮反应:
酰化氨基酸甲酯 酰化氨基酸酰肼
酰化氨基酸叠氮
用途：活化羧基，用于肽的人工合成。
α-氨基和α-羧基共同参加的反应:
1. 与茚三酮的反应：
α-氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa 氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨
和还原型茚三酮）生成兰紫色化合物（Pro 和Hyp 呈黄色,440 nm ），色深与溶液中氨基浓度
成正比。
应用：可定性或定量测定各种氨基酸。
a 、根据颜色深浅，在570（440）nm 处 测OD 值，可知样品中氨基酸含量。
b 、定量释放的CO2可用测压法测量，计算出参加反应的aa 量。
c 、蛋白质和多肽亦可反应，但灵敏度差。
2. 成肽反应：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以合成肽，形成的键称肽键。
侧链基团的化学性质
对羟汞苯甲酸，作用：与金属离子的螯合性质
可用于体内解毒
(1) 巯基（-SH ）的性质
OOC CHCH 2SH NH 3+-OOC CHCH 2
SH NH 3+
OOC CH NH 3+CH 2
S S CH 2NH 3+CH -OOC 胱氨酸，作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或打开。 （2）羟基的性质 （3）咪唑基的性质 组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生理条件下具有缓冲作用。组氨酸中的咪唑
基能够发生多种化学反应。可以与A TP 发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。
组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失。
作用：判断酶的活性中心。
4、氨基酸分离和分析
分配层析法和离子交换层析
a.分配层析法：一种溶质在两种互不相溶或几乎不相溶的溶剂中分配时,在一定温度和压
力下平衡后,溶质在两相溶剂中的浓度比值,此比值称分配系数(Kd=CA/CB,各种aa 都有
特定的分配系数，分配系数差异越大，愈容易分离）
. OOC CHCH 2S NH 3+Hg +COO -
固定相：借助一定支持物（如：纤维素、淀粉、硅胶等亲水性不溶物质），以结合水为固定相。
流动相：以与水不溶的有机溶剂（如：酚、正丁醇）为流动相。
方法：流动相流过支持物，将分配系数不同的氨基酸分开，以茚三酮显色，形成色谱，扫描定量，或洗脱后比色定量。
纸层析：将氨基酸混合物点在滤纸的一角，然后在一个密闭的容器中用一个溶剂系统沿滤纸的方向进行展层，烘干滤纸后，旋转90 。，再在另一个溶剂系统中进行第二向展层。由于氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的分配系数，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。利用茚三酮显色，就得到了滤纸层析谱。
b.离子交换层析，原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H强酸型），羧基-COOH（弱酸型）。阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH- 。
高效液相色谱法，HPLC的特点: 固相支持物颗粒小，比表面积大；溶剂系统采用高压，流速快；适于各种类型的支持物的柱层析；HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol 水平。
电泳分离：带电颗粒在电场中移动。氨基酸是两性离子化合物，在不同的pH条件下，携带不同的电荷。当把氨基酸混合液点在用一定缓冲液浸湿的滤纸条上的时候，混合液中的各组分能根据它们所带电荷的种类和静电荷的多寡，在电场中以不同的速度向不同方向泳动，从而把它们分开。
氨基酸的制备和应用状况：
（二）氨基酸的用途
蛋白质的基本组成；对生物体具有其他特殊的生理作用，参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病；用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂;用于饲料添加剂；调节皮肤pH值和保护皮肤的功能。
三、肽（peptide）
1、肽与肽键
一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。
肽键（peptide bond）：肽平面，构成肽键的四个原子（C、O、N、H）和与之相连的两个α碳原子都处在同一个平面内，此刚性结构的平面称肽平面或酰氨平面。
肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。
肽键中的C-N键具有部分双键性质，
不能自由旋转。在大多数情况下，C=O与
N-H或两个α-碳原子以反式结构存在。
2、肽链中AA的排列顺序和命名
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。通常在多肽链的一端含有一个游离的α-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的α-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。
从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,
简写：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA 残基放在右边。共价主链：肽链的骨干是由--N --Cα--C --序列重复排列而成，称为共价主链。
3、肽的重要理化性质
（1）.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高,以偶极离子形式形成离子晶格。
（2）.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端α-NH2和游离末端α-COOH以及侧链上可解离的基团。
（3）.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。
4. 肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。
双缩脲反应:双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子
NH3而得到的产物。含有两个以上肽键的多肽，具有
与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。
肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应。
Cu2+ (碱性溶液)
5、天然存在的重要多肽
红紫色络合物在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。
但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。
短杆菌肽S(环十肽)：由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为Orn）。能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症。
谷胱甘肽：存在与动、植物及微生物中。1.参与体内氧化还原反应。2.作为辅酶参与氧化还原反应保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性,防止氧化物积累。
四、蛋白质的分子结构
蛋白质的结构：
蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。
1. 蛋白质的一级结构
1) 定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸
顺序，它是蛋白质生物功能的基础。
牛胰核糖核酸酶（RNase）：一条多肽链，124AA残基组成，四个链内二硫键，分子量12600.它是测出一级结构的第一个酶分子。
胰岛素（insulin ）的一级结构：胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。含A、B两条链，（A链：21肽，B链：30肽）。A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。
2) 蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给出更多的信息。为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是分子病理学的一个重要部分。蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。核苷酸序列分析的不足
(1) 测定蛋白质一级结构的要求
a、样品必需纯（>97%以上）；
b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA数目，工作量大小。
c、知道蛋白质由几个亚基组成；
(2). 测定步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式：a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在水中的溶解度。
C.二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇【SH-CH2-CH2-OH】(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。
D.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。
N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。
C-端氨基酸分析：
1、肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼
在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与
C-端氨基酸分离。H2N C HC
R O
H N C HC
R O O
R n
C
C H
H N O H
n-1
N-端氨基酸 C-端氨基
O
R n
C
C H
H2N O H
H2N C HC
R O
N H N H2+
H+
22
氨基酸酰肼C-端氨基酸
2、羧肽酶(carboxypeptidase)法：
羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。
E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽链断裂法：酶解法和化学法。
酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等
胰蛋白酶：
Trypsin ：R1=Lys和Arg
时（专一性较强，水解速度
快）。R2=Pro 水解受抑。
糜蛋白酶：
或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His 水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。
胃蛋白酶：
Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。
嗜热菌蛋白酶：
thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。
F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。
G.确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
H.确定原多肽链中二硫键的位置。采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定。
一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。
测定步骤：
1.测定蛋白质分子中多肽链的数目
2.拆分蛋白质分子中的多肽链
3.断裂多肽链内的二硫键
4.测定多肽链的氨基酸组成
5.分析多肽链的N末端和C末端
6.多肽链部分裂解成肽段
7.测定各个肽段的氨基酸顺序
8.确定肽段在多肽链中的顺序
9.确定多肽链中二硫键的位置
蛋白质的分类(回顾)：
分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能
⑴按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白；
⑵按分子组成：简单蛋白和结合蛋白；
⑶按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等;
⑷按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白。纤维状蛋白分子：角蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白、肌纤维蛋白。功能:在生物体内保护、支持、结缔功能。
球蛋白分子：血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗体等
2. 蛋白质的二级结构与纤维状蛋白
1) 构型与构象
(1)构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。
(2)构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。
2）蛋白质的构象
概念：蛋白质的构象即蛋白质空间结构（高级结构），指蛋白质分子中所有原子和基团在三维空间的排列及肽链的走向。一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。这一事实说明了天然蛋白质共价主链上的单键不能自由旋转。
蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现：
1.肽键具有部分双键性质：C-N单键键长0.149nm，C=N双键键长0.127nm肽键键长
0.132nm
2.肽键不能自由旋转
3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个α-碳原子（Cα）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane).
X-射线结晶学分析的三个阶段：分辨率0.6nm 多肽主链的折叠和走向；分辨率0.2nm 可以辨认分子的侧链基团；分辨率0.14nm 识别所有的氨基酸。
3) 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。
主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角、自由回转(无规则卷曲、无规则区域)。
(1) α-螺旋（α-helix）及结构特点
a. 肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;
b. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。
c. 蛋白质中的α -螺旋几乎都是右手螺旋。
关于α-螺旋的几点说明：
α-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。α-螺旋中每个残基（Cα）的二面角φ和ψ各自取同一数值，即φ=-57?、ψ=-48?。α-螺旋有左手和右手螺旋，蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋。α-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。α-螺旋的形成及其
稳定性与其氨基酸组成和顺序有关（Pro、polyLys、PolyHe）。α-螺旋折叠过程中存在协同性。α-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋。
(2) β-折叠（β-pleated sheet）
β-折叠或β-折叠片也称β-结构或β-构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。
β-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。
β-折叠的特点：
β-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。
β-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边(如,β- 角蛋白)。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反(如,丝心蛋白)。
（3）β- 转角(β- turn)
链内形成氢键，多肽链出现180°的回折。此回折角称β- 转角结构。此结构广泛存在球状蛋白中。
在β-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的–N-H 之间形成氢键，形成一个比较稳定的环状结构。它是一个非重复性结构。（4）自由回转(random coil)
（亦称无规则卷曲、自由绕曲,但决非变性蛋白的无规卷曲）有时在球状蛋白分子表面有时在其分子内部指无规律的松散肽链结构。通常酶蛋白包含此构象，蛋白功能的可塑性较大，灵活易变。
4）超二级结构
1.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（α-螺旋或β-折叠或β-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
2.超二级结构的基本类型：αα、βαβ、βββ
（1）αα—由两股或三股右手螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。
（2）βαβ—由两段平行的β折叠股和一段连接链（或是α螺旋、或是无规则卷曲)组成。（3）βββ—由若干段反平行的β折叠股组合而成，两个β折叠股间由一个短环连接起来。
纤维状蛋白：纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴／短轴)大于10(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。
5) 结构域（domain）
结构域：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。
结构域这一折叠层次的出现不是偶然的：具有结构上的意义;具有功能上的意义.
3. 蛋白质的三级结构
1) 蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维分子结构。
2) 维持三级结构的作用力
氢键（主链内部、侧链之间、侧链与主链、侧链与介质水、主链与介质水）；范德华力
；疏水相互作用-疏水效应（疏水键）——在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用；离子键（盐键）；二硫键；疏水相互作用，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。
4. 蛋白质的四级结构
亚基：几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，这种肽链称该蛋白质的亚基(subunit)。四级结构：亚基间通过非共价键聚合而成的特定结构。寡聚蛋白质：有两个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质。
维持蛋白质四级结构的主要作用力：氢键、离子键、范德华力、疏水相互作用和二硫键。即亚基之间主要通过次级键彼此缔合在一起；疏水相互作用是最主要的作用力。
五、蛋白质分子结构与功能的关系
(一) 蛋白质一级结构与功能的关系
1.同功蛋白质一级结构的种属差异性
细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物、微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明：
（1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。
不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目
黑猩猩 0 鸡、火鸡 13
牛猪羊 10 海龟 15
狗驴 11 小麦 35
粗糙链孢霉43 酵母菌 44
（2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。
cytC三维结构的保守性：与血红素定位有关的6个AA不变： 2Cys His Met TyrTrp裂隙处AA保守拐弯处AA保守共计28AA严格保守。
2.蛋白质一级结构的变异与分子病
分子病—指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病。
镰刀状细胞贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。
病因：血红蛋白AA顺序的细微变化，常人HbA—βN6Glu，人 HbS—βN6Val。
正常人的HbA的β链第六位是Glu，而病人（HbS)则被Val取代（遗传密码由CTT→CAT)。
每种蛋白质分子都具有特定的结构来行使特定的功能，即使是一级结构个别AA的变化也能引起功能的改变或丧失。
β-链 1 2 3 4 5 6 7 8
Hb-A N- Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…
Hb-S N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…
由此引起三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血。
3.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活
胰凝乳蛋白酶原（proenzyme）的激活:酶的无活性前体叫酶原；由酶原变成有活性酶的过程叫酶原激活。
胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶原 A 链 + B 链
（245AA残基）（1-15）（16-245）
Ser14-Arg15
π-胰凝乳蛋白酶
Thr147-Asn148
注意：
单一肽键断裂的意义
C 链 +
D 链 +
E 链
（1-13）（ 16-146 ）（ 149-245）
胰凝乳蛋白酶
（二）蛋白质高级(构象)与功能的关系
1. 肌红蛋白的结构与功能
（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。
（2）肌红蛋白的结构特点：1963<年，>Kendrew
a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。
b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段较直的α -螺旋体（ 75%， A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。
c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。
2.血红蛋白的结构与功能
（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH值.
（2）血红蛋白的结构特点：
a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000
b.成人的血红蛋白为α2β2（HbA-96%）、α2δ2（ HbA2-2%）胎儿的血红蛋白为α2γ2（HbF）
c. α链由141AA残基组成，βδγ链由146AA残基组成。四种肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。
(3)氧合引起血红蛋白的构象变化
A. 几个概念
别构蛋白:蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。别构蛋白都有别构效应。
别构效应:蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。
别构蛋白的结构特点:都是寡聚蛋白质，有四级结构.分子中每个亚基上都有活性部位，或者还有别构部位；某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基。不同亚基各部位之间存在相互作用，部位之间的影响是通过构象变化传递的.
b. 与氧结合时血红蛋白的变构过程
血红素中铁原子的变化
高自旋状态低自旋
（非氧合，原子半径较大）（氧合，原子半径较小）
C. H+、CO2和DPG 对血红蛋白结合氧的影响
H+、CO2的影响:1914年，C.Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2。——血红蛋白对O2、 H+和CO2结合的这种相互关系叫波耳效应。
波耳效应的生理意义
肌肉pH7.2 H+
HbO2 +H+ +CO2 Hb + O2
肺泡pH7.6 CO2
DPG的影响：DPG和O2对血红蛋白的结合是排斥的。
DPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义： DPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的DPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 DPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中DPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液（用肌苷代替酸性柠檬酸葡萄糖）。
d.血红蛋白S形氧合曲线的生理意义：S形氧合曲线反映了血红蛋白对于O2的结合与解离存在协同作用。使血红蛋白更有效地担负输送氧的任务。
煤气中毒的机制：一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红素的结合能力是O2的200倍(单独时是25000倍)，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。
3. 蛋白质构象改变，活性丧失。
用化学方法修改蛋白质或多肽化合物的结构，可提高活性；了解蛋白质结构中的活性必需片段，可人工合成蛋白质。
六、蛋白质的重要性质
1. 蛋白质的两性解离和电泳现象
蛋白质与多肽一样，能够发生两性解离，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。
在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—(Electrophoresis)带电粒子在电场中移动的现象。
蛋白质分子中可解离的基团主要来自aa残基的侧链R基如：β-羧基、γ-羧基、ε-氨基、咪唑基、胍基;此外还有蛋白质分子末端α-氨基和α-羧基。在生理条件下，这些基团解离使蛋白质即可作为酸又可作为碱，所以蛋白质也是两性电解质。
2.蛋白质的胶体性质
由于蛋白质的分子量很大（1-100nm），它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。
由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。
透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法
半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。
3.蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。
改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质
在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。
定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。
可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象.
盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。
有机溶剂沉淀法（脱去水化层、降低介电常数）。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性）。
盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，因而溶解度增加。
分段盐析：不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：
(NH4)2SO4
血清球蛋白（析出）清蛋白（析出）
50%饱和度饱和
不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。（4）蛋白质的变性：天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。
a.蛋白质的变性
蛋白质变性后的表现：生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。
b、导致蛋白质变性的因素
物理因素如加热、高压、紫外线照射、 X-射线、超声波、剧烈震荡、搅拌等。
化学因素如强酸、强碱、脲、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。
c.蛋白质的复性
定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。
蛋白质变性的预防和利用：医疗方面；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等。
（5）蛋白质的紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。
（6）蛋白质的颜色反应
反应试剂颜色反应基团
双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽链
Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸红色酚基
黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄苯环
乙醛酸反应乙醛酸H2SO4 紫红吲哚
坂口反应次氯酸钠,萘酚,NaOH 红色胍基
Folin酚试剂反应 CuSO4磷钨酸-钼酸蓝色酚基
茚三酮反应茚三酮蓝紫色游离氨,羧基
七、蛋白质的分类
1. 依据蛋白质的外形分类
按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。
球状蛋白质：globular protein 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶。纤维状蛋白质：fibrous protein 分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。
2. 依据蛋白质的组成分类
按照蛋白质的组成，可以分为：简单蛋白(simple protein) ，结合蛋白(conjugated protein)。
简单蛋白：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只由氨基酸组成的肽链，不含其它成分。
1.清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。
2.谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。
3.精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在于细胞核中。
4.硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。
结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。
色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。
糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。
脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清,脂蛋白等。
核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。
黄素蛋白：由简单蛋白与黄素核苷酸结合而成。如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶
金属蛋白：由简单蛋白与金属结合而成。如铁蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶（硒）、乙醇氧化酶（锌）
八、蛋白质的分离纯化
①研究其结构与功能②工农业生产的需要③医疗业的需要④研究需要。
1、分离纯化的一般原则
提取前处理：大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。
①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌）。使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。
2、分离纯化的一般方法
根据蛋白质溶解度不同的分离方法：
1)、蛋白质的盐析；2)、等电点沉淀法；3)、低温有机溶剂沉淀法。
根据蛋白质分子大小的差别的分离方法：
1)、透析与超滤；2)、凝胶过滤法；3)、离心
凝胶过滤柱层析（分子筛层析）：凝胶作为支持剂，凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。
被分离的混合物流过层析柱时:大分子先下来，小分子后下来。
根据蛋白质带电性质进行分离:1、电泳法2、离子交换层析法。
2、离子交换层析法
离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。
根据离子交换纤维素所含离子交换基团的不同分为阳离子交换纤维素和交换纤维素两大类。常用的阳离子交换纤维素为羧甲基纤维素(CM纤维素),阴离子交换纤维素为二乙氨乙基纤
维素(DEAE-纤维素).
根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质：
?大小：电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析
?形状：电泳、凝胶过滤
?电荷：电泳、离子交换层析
?等电点：等电聚焦电泳、等电点沉淀
?疏水性（疏水补丁）：疏水相互作用层析、反相色谱
?溶解度：盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂
?密度：（多数蛋白密度为1.3-1.4g/cm3）密度梯度离心
?配体结合能力：亲和层析
?金属结合能力：金属螯合层析（酶的纯化）
3、蛋白质分子量的测定
1) 凝胶过滤法2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法3) 离心沉降法4) 质谱5) 毛细管电泳
1)葡聚糖凝胶过滤法
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关： LogM Ve
Ve洗脱体积，自样品开始洗脱到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。
2)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。目前测定亚基分子量的最好办法。
第三章蛋白质化学 一、单项选择题 1．蛋白质分子的元素组成特点是 A．含大量的碳B．含大量的糖C．含少量的硫D．含少量的铜E．含氮量约16% 2．一血清标本的含氮量为5g/L，则该标本的蛋白质浓度是 A．15g/L B．20g/L C．31/L D．45g/L E．55g/L 3．下列哪种氨基酸是碱性氨基酸？ A．亮氨酸B．赖氨酸C．甘氨酸D．谷氨酸E．脯氨酸 4．下列哪种氨基酸是酸性氨基酸？ A．天冬氨酸B．丙氨酸C．脯氨酸D．精氨酸E．甘氨酸 5．含有两个羧基的氨基酸是 A．丝氨酸B．苏氨酸C．酪氨酸D．谷氨酸E．赖氨酸 7．在pH7.0时，哪种氨基酸带正电荷？ A．精氨酸B．亮氨酸C．谷氨酸D．赖氨酸E．苏氨酸 8．蛋氨酸是 A．支链氨基酸B．酸性氨基酸C．碱性氨基酸D．芳香族氨酸
E．含硫氨基酸 9．构成蛋白质的标准氨基酸有多少种？ A．8种B．15种 C．20种D．25种 E．30种 10．构成天然蛋白质的氨基酸 A．除甘氨酸外，氨基酸的α碳原子均非手性碳原子 B．除甘氨酸外，均为L-构型C．只含α羧基和α氨基D．均为极性侧链E．有些没有遗传密码11．天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A．瓜氨酸B．蛋氨酸 C．丝氨酸D．半胱氨酸 E．丙氨酸 12．在中性条件下大部分氨基酸以什么形式存在？ A．疏水分子B．非极性分子 C．负离子D．正离子 E．兼性离子 13．所有氨基酸共有的显色反应是 A．双缩脲反应B．茚三酮反应 C．酚试剂反应D．米伦反应 E．考马斯亮蓝反应 14．蛋白质分子中的肽键 A．氨基酸的各种氨基和各种羧基均可形成肽键 B．某一氨基酸的γ-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 C．一个氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 D．肽键无双键性质 E．以上均不是 15．维持蛋白质分子一级结构的化学键是 A．盐键B．二硫键 C．疏水键D．肽键
第一章蛋白质化学 一、填空题 1.根据R基团对水分子的亲和性，氨基酸可分成和；根据对动物的营养价值，氨基 酸又可分成和。疏水性氨基酸亲水性氨基酸必需氨基酸非必需氨基酸 2.测定一级结构需要的蛋白质的样品纯度不低于。如果一种蛋白质分子含有二硫键，可使 用电泳法对二硫键进行准确定位。97% 对角线 3.目前已发现的蛋白质氨基酸有种，其中2种罕见的氨基酸是和，它们 分别由和密码子编码。22 硒半胱氨酸吡咯赖氨酸UGA UAG 4.蛋白质紫外吸收是由三种氨基酸造成的，最大吸收峰在nm。蛋白质的pI可使用的 方法测定，pI处蛋白质的溶解度。芳香族280 等电聚焦最小 5.蛋白质的功能主要由其特定的结构决定。蛋白质的一级结构决定其高级结构和功能。α- 角蛋白的主要二级结构是，β-角蛋白的二级结构主要是。三维α-螺旋β-折叠6.蛋白质变性是指蛋白质受到某些理化因素的作用，其结构被破坏、随之丧失的现象。 高级生物功能 7.氨基酸与的反应可用于Van Slyke定氮，试剂或可用来测定N端氨基酸。 在蛋白质氨基酸中，只有与茚三酮反应产生黄色物质，其余氨基酸生成物质。亚硝酸Sanger 丹磺酰氯脯氨酸蓝紫色 8.蛋白质的结构一般包括个层次的结构，但肌红蛋白的结构层次只有个。一种蛋白 质的全部三维结构一般称为它的构象。二级结构是指，它是由氨基酸残基的氢键决定的。最常见的二级结构由、、和，其中能改变肽链走向的二级结构是。4 3多肽链的主链骨架本身在空间上有规律的折叠和盘绕非侧链基团α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲β-转角 二、是非题 1.氨基酸可分为亲水氨基酸和疏水氨基酸，其中亲水氨基酸溶于水，疏水氨基酸一般不溶于水。错 2.到目前为止，已在蛋白质分子中发现22种L型氨基酸。错 3.可使用双缩脲反应区分二肽和氨基酸。错 4.一种特定的氨基酸序列通常能决定几种不同的稳定的特定三维结构。错 5.许多明显不相关的氨基酸序列能产生相同的三维蛋白质折叠。正确 6.吡咯赖氨酸和羟赖氨酸都属于蛋白质翻译好后的赖氨酸残基的修饰产物。错 7.二硫键能稳定蛋白质的三级结构，但它又属于一级结构的内容。正确 8.胞外蛋白质通常具有二硫键，而胞内酶通常没有。正确 9.肽链上Pro-X之间的肽键可能是顺式，也可能是反式。错 10.存在与疏水环境中，α-螺旋比在亲水环境中的α-螺旋要稳定。正确 11.靠近α-螺旋N端的Arg残基的侧链的存在可稳定螺旋。错误。 12.大多数单核苷酸突变导致蛋白质的三维结构变得不稳定。错 三、选择题 1.六肽K-Q-C-D-E-I在pH7时的静电荷是（）。B A．-2 B.-1 C.0 D.+1 E.+2 2.七肽A-S-V-D-E-L-G形成α-螺旋，与A的羰基形成氢键的氨基酸残基是（）。D A.S B.V C.D D.E E.L 3.如果一种蛋白质含有一个完全由α-螺旋组成的跨膜结构域，那么最有可能出现在跨膜结构域的氨基酸残基是（）。D A.P B.E C.K D.L E.R 4.以下五种氨基酸H、A、D、P、Y和R按照等电点递增的排列顺序是（）。D A.DAPYHR B.DPAYHR C.DPYAHR D.DYAPHR E.DPYAHR
第三章蛋白质化学样题 一、选择题 1.蛋白质分子的一级结构概念主要是指（） A、组成蛋白质多肽链的氨基酸数目。 B、氨基酸种类及相互比值。 C、氨基酸的排列顺序。 D、二硫键的数目和位置。 2.下列何种结构不属蛋白质分子构象（） A、右手双螺旋 B、α-螺旋 C、β-折叠 D、β-转角 3. 在蛋白质三级结构中可存在如下化学键，但不包括（） A、氢键 B、二硫键 C、离子键 D、磷酸二酯键 4. 下列关于蛋白质四级结构的有关概念，何者是错误的（） A、由两个或两个以上亚基组成。 B、参与形成四级结构的次级键多为非共价键。 C、所有蛋白质分子只有具有四级结构，才表现出生物学活性。 D、组成四级结构的亚基可以是相同的，也可以是不同的。 5. 蛋白质变性是由于（） A、蛋白质一级结构的改变 B、组成蛋白质的共价键发生变化 C、蛋白质空间构象的破坏 D、辅基的脱落 6. 维系蛋白质一级结构的化学键（） A、盐键 B、肽键 C、氢键 D、分子间作用力 7. 对具有四级结构的蛋白质进行一级结构分析时（）
A、只有一个自由的α-氨基和一个自由的α-羧基。 B、只有自由的α-氨基，没有自由的α-羧基。 C、有一个以上的自由α-氨基和α-羧基。 D、既无自由的α-氨基，也无自由的α-羧基。 8. 蛋白质分子中的α-螺旋和β片层都属于（） A、一级结构 B、二级结构 C、三级结构 D、四级结构 9. 维系蛋白质分子中α-螺旋的化学键是（） A、肽键 B、离子键 C、二硫键 D、氢键 10. α-螺旋每上升一圈相当于几个氨基酸（） A、2.5 B.2.7 C.3.0 D、3.6 11. 谷氨酸的等电点是3.22，下列描述正确的是（） A、谷氨酸是碱性氨基酸 B、谷氨酸是酸性氨基酸 C、谷氨酸在pH=7的溶液中带正电荷 D、谷氨酸分子中含有一个氨基和一个羧基 12. 肽键是（） A、属于维系蛋白质二级结构的重要化学键 B、属于次级键 C、可以自由旋转 D、由肽键形成的肽平面包含了6个原子 13. 关于蛋白质二级结构的描述正确的是（） A、属于蛋白质的空间构象
第三章蛋白质化学 一、填空题 1.氨基酸的等电点(pI)是指________________。 2.氨基酸在等电点时，主要以________________离子形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以________________离子形式存在，在pH 第三章蛋白质化学 1蛋白质：是一类生物大分子，由一条或多条肽链构成，每条肽链都有一定数量的氨基酸按一定序列以肽键连接形成。蛋白质是生命的物质基础，是一切细胞和组织的重要组成成分。2标准氨基酸：是可以用于合成蛋白质的20种氨基酸。 3、茚三酮反应：是指氨基酸、肽和蛋白质等与水合茚三酮发生反应，生成蓝紫色化合物，该化合物在570mm波长处存在吸收峰。 4、两性电解质：在溶液中既可以给出H+而表现出酸性，又可以结合H+而表现碱性的电解质。 5、兼性离子：即带正电和、又带负电荷的离子。 6、氨基酸的等电点：氨基酸在溶液中的解离程度受PH值影响，在某一PH值条件下，氨基酸解离成阳离子和阴离子的程度相等，溶液中的氨基酸以兼性离子形式存在，且净电荷为零，此时溶液的PH值成为氨基酸的等电点。 7、单纯蛋白质：完全由氨基酸构成的蛋白质。 8、缀合蛋白质：含有氨基酸成分的蛋白质。 9、蛋白质的辅基：缀合蛋白质所含有的非氨基酸成分。 10、肽键：存在于蛋白质和肽分子中，是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩合时形成的化学键。 11、肽平面：在肽单元中，羧基的π键电子对与氮原子的孤电子对存在部分共享，C-N键具有一定程度的双键性质，不能自由旋转。因此，肽单元的六个原子处在同一个平面上，称为肽平面。 12、肽：是指由两个或者多个氨基酸通过肽键连接而成的分子。 13、氨基酸的残基：肽和蛋白质分子中的氨基酸是不完整的，氨基失去了氢，羧基失去了羟基，因而称为氨基酸的残基。 14、多肽：由10个以上氨基酸通过肽键连接而成的肽。 15、多肽链：多肽的化学结构呈链状，所以又称多肽链。 16、生物活性肽：是指具有特殊生理功能的肽类物质。它们多为蛋白质多肽链的一个片段，当被降解释放之后就会表现出活性，例如参与代调节、神经传导。食物蛋白质的消化产物中也有生物活性肽，他们可以被直接吸收。 17、谷胱甘肽：由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键连接构成的酸性三肽，是一种生物活性肽，是机体重要的抗氧化剂。 18、蛋白质的一级结构：通常叙述为蛋白质多肽链中氨基酸的连接顺序，简称氨基酸序列。蛋白质的一级结构反映蛋白质分子的共价键结构。 19、蛋白质的二级结构：是指蛋白质多肽链局部片段的构象，该片段的氨基酸序列是连续的，主链构象通常是规则的。 20、蛋白质的超二级结构：又称模体、基序，是指几个二级结构单元进一步聚集和结合形成的特定构象单元，如αα、βαβ、ββ、螺旋-转角-螺旋、亮氨酸拉链等。 21、蛋白质的三级结构：是指蛋白质分子整条肽链的空间结构，描述其所有原子的空间排布。蛋白质的三级结构的形成是肽链在二级结构基础上进一步折叠的结果。 22、蛋白质的结构域：许多较大（由几百个氨基酸构成）蛋白质的三级结构中存在着一个或多个稳定的球形折叠区，有时与分子的其他部分之间界限分明，可以通过对多肽的适当酶切与其他部分分开，这种结构成为结构域。 23、蛋白质的亚基：许多蛋白质分子可以用物理方法分离成不止一个结构单位，每个结构单位可以由不止一条台联构成，但特定且相对独立的三级结构，且是一个由共价键连接的整体，该结构单位称为蛋白质的亚基。 第三章蛋白质化学 一、重点难点概述：学习要求：掌握蛋白质的概念和化学组成；掌握蛋白质的组成单位——氨基酸的结构和理化性质；掌握肽的概念和性质；掌握蛋白质的结构（包括初级结构和空间结构）及结构与功能的关系，掌握蛋白质和氨基酸的理化性质；了解蛋白质分析、分离和纯化的一般方法。 重点及难点：氨基酸的结构和性质；蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离纯化。 主要内容： 一、蛋白质的化学组成与分类 蛋白质：蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 （一）蛋白质的元素组成（二）蛋白质的基本单位——氨基酸（三）蛋白质的分类 二、蛋白质的大小与分子量 三、蛋白质的构象 四、蛋白质结构层次 五、蛋白质分子多样性 第二节蛋白质基本单位---氨基酸 一、蛋白质的水解 二、氨基酸的结构与分类 （一）基本氨基酸（20种）（二）修饰氨基酸（三）非蛋白质组分氨基酸 三、氨基酸的构型、旋光性和光吸收 (一) 氨基酸的构型（二）氨基酸的旋光性（三）氨基酸的光吸收性 四、氨基酸的酸碱性质 （一）氨基酸是两性电解质（二）氨基酸有特征滴定曲线（三）不同氨基酸的酸碱性质不同（四）氨基酸的甲醛滴定 五、氨基酸的化学反应 六、氨基酸的分离分析 （一）分配层析法分离氨基酸（二）分配柱层析（三）氨基酸的纸层析（四）氨基酸的薄层层析（五）氨基酸纸电泳（六）离子交换层析分离氨基酸 第三节蛋白质的共价结构 一、肽和键的结构 （一）肽键（二）肽键作为蛋白质主键的证据（三）肽键的特点（四）肽概念 二、肽的理化性质 （一）肽的物理性质：晶体的熔点很高（二）肽的解离（三）小肽的滴定及等电点确定 三、天然存在的活性肽 四、蛋白质一级结构举例 （一）胰岛素（二）核糖核酸酶的一级结构 五、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 （一）同源蛋白质的种属差异与生物进化（二）同源蛋白质具有共同的进化起源 第三章蛋白质化学 1蛋白质：就是一类生物大分子，由一条或多条肽链构成，每条肽链都有一定数量得氨基酸按一定序列以肽键连接形成。蛋白质就是生命得物质基础,就是一切细胞与组织得重要组成成分。 2标准氨基酸:就是可以用于合成蛋白质得２0种氨基酸. 3、茚三酮反应：就是指氨基酸、肽与蛋白质等与水合茚三酮发生反应，生成蓝紫色化合物，该化合物在570mm波长处存在吸收峰。 4、两性电解质：在溶液中既可以给出H+而表现出酸性，又可以结合Ｈ＋而表现碱性得电解质。 5、兼性离子:即带正电与、又带负电荷得离子。 6、氨基酸得等电点:氨基酸在溶液中得解离程度受ＰH值影响,在某一PＨ值条件下,氨基酸解离成阳离子与阴离子得程度相等，溶液中得氨基酸以兼性离子形式存在,且净电荷为零，此时溶液得ＰH值成为氨基酸得等电点。 7、单纯蛋白质:完全由氨基酸构成得蛋白质。 8、缀合蛋白质：含有氨基酸成分得蛋白质。 9、蛋白质得辅基:缀合蛋白质所含有得非氨基酸成分。 10、肽键：存在于蛋白质与肽分子中，就是由一个氨基酸得α—羧基与另一个氨基酸得α—氨基缩合时形成得化学键。 11、肽平面:在肽单元中，羧基得π键电子对与氮原子得孤电子对存在部分共享，C－N键具有一定程度得双键性质,不能自由旋转。因此,肽单元得六个原子处在同一个平面上，称为肽平面。 12、肽：就是指由两个或者多个氨基酸通过肽键连接而成得分子。 13、氨基酸得残基：肽与蛋白质分子中得氨基酸就是不完整得，氨基失去了氢，羧基失去了羟基，因而称为氨基酸得残基。 14、多肽:由１0个以上氨基酸通过肽键连接而成得肽. 15、多肽链：多肽得化学结构呈链状,所以又称多肽链。 16、生物活性肽:就是指具有特殊生理功能得肽类物质。它们多为蛋白质多肽链得一个片段,当被降解释放之后就会表现出活性，例如参与代谢调节、神经传导。食物蛋白质得消化产物中也有生物活性肽,她们可以被直接吸收。 17、谷胱甘肽:由谷氨酸、半胱氨酸与甘氨酸通过肽键连接构成得酸性三肽,就是一种生物活性肽，就是机体内重要得抗氧化剂。 18、蛋白质得一级结构：通常叙述为蛋白质多肽链中氨基酸得连接顺序,简称氨基酸序列。蛋白质得一级结构反映蛋白质分子得共价键结构。 19、蛋白质得二级结构:就是指蛋白质多肽链局部片段得构象,该片段得氨基酸序列就是连续得，主链构象通常就是规则得。 20、蛋白质得超二级结构：又称模体、基序，就是指几个二级结构单元进一步聚集与结合形成得特定构象单元,如αα、βαβ、ββ、螺旋—转角-螺旋、亮氨酸拉链等。 21、蛋白质得三级结构:就是指蛋白质分子整条肽链得空间结构，描述其所有原子得空间排布。蛋白质得三级结构得形成就是肽链在二级结构基础上进一步折叠得结果. 22、蛋白质得结构域：许多较大(由几百个氨基酸构成)蛋白质得三级结构中存在着一个或多个稳定得球形折叠区，有时与分子得其她部分之间界限分明，可以通过对多肽得适当酶切与其她部分分开,这种结构成为结构域。 23、蛋白质得亚基：许多蛋白质分子可以用物理方法分离成不止一个结构单位，每个结构单位可以由不止一条台联构成，但特定且相对独立得三级结构，且就是一个由共价键连接得整 第三章蛋白质化学 3.1、蛋白质的重要性和一般组成 蛋白质：蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 3.1.1 蛋白质的生物学重要性 1.生物体的组成成分（结构蛋白） 2.催化（酶蛋白） 3.运输 4.运动 5.抗体免疫(球蛋白) 6.干扰素 7.遗传信息的控制 8.细胞膜的通透性 9.高等动物的记忆、识别机构 3.1.2 蛋白质的化学组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳50％氢7％氧23％氮16% 硫0—3％其他微量 N的含量平均为16%——凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。 蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故：※蛋白质含量=氮的量×100/16=氮的量×6.25 3.2 氨基酸——组成蛋白质的基本单位 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。 氨基酸的结构特点： ?(1). 与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸 ?(2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都为不对称碳原子,所以： A.氨基酸都具有旋光性。 B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。 3.2.2 氨基酸的分类 蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：不参与蛋白质组成，在生物体内呈游离或结合态的氨基酸。p74 常见蛋白质氨基酸的分类 根据侧链基团的结构将20中常见氨基酸分为3大类 A、脂肪族氨基酸： 中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸)（5种） 含羟基氨基酸(2种) 含硫氨基酸（2种） （一氨基二羧基氨基酸）及其酰胺（4种） 碱性氨基酸（二氨基一羧基氨基酸）（2种） B、芳香族氨基酸: Phe，Tyr，Trp C、杂环族氨基酸: His，Pro 中性氨基酸：甘氨酸（Gly,G）、丙氨酸（Ala, A）、缬氨酸（Val, V）、亮氨酸（Leu, L）异亮氨酸（Ile, I）（异亮氨酸含有两个手性碳） 含羟基氨基酸：丝氨酸（Ser, S）、苏氨酸（Thr, T）（苏氨酸含有2个手性碳原子） 42胰岛素原转变为胰岛素的过程是在_________(细胞器)进行。分泌颗粒中的胰岛素是通过_________离子于_________氨酸侧链上的氮原子配位，形成_________聚体。 43.测定蛋白质浓度的方法主要有_________、_________、_________和_________。 44.肌球蛋白本身具有_________酶的活性，所以当A TP释放能量时，就引起肌肉收缩。 45.酶蛋白的荧光主要来自_________氨酸与_________氨酸。 46.凝集素能专一地识别细胞表面的_________并与之结合，从而使细胞于细胞相互凝集。 47.蛋白质的生理价值可用下式表示：_________×100。 48.R．Y alow的主要贡献是建立了_________。 49.抗体就是_________球蛋白。 50.用_________试剂可区分丙氨酸和色氨酸。 51.利用蛋白质不能通过半透膜的特性，使它和其他小分子物质分开的方法有_________和-_________等。 52.利用分配层析的原理进行氨基酸分析，常用的方法有_________、_________、_________ 和_________等。 53.实验室中常用的测定相对分子质量的方法有_________、_________和_________等。 54.羧肽酶B专一地从蛋白质的C端切下_________氨基酸。 55.糖蛋白的糖基大多结合在蛋白质的_________残基_________残基与_________残基上。 56. _________不是α-氨基酸，它经常改变肽链折叠的方式。 57.维持蛋白质构象的次级键主要有_________、_________、_________和_________。 58.羧肽酶A不能水解C端是_________残基、_________残基和_________残基的肽键。 59.常用的肽链N端分析的方法有_________法、_________法、_________法和_________法。C端分析的方法有_________法和_________法等。 60.多聚L-谷氨酸的比旋度随PH值改变是因为_________，而L-谷氨酸的比旋度随PH值改变则是由于_________。 61.胰岛素是胰岛β-细胞分泌的，它是由前胰岛素原经专一性蛋白水解，失去N端的-_________成为_________。再经类胰蛋白酶和类羧肽酶的作用失去_________肽，形成具有生物活性的胰岛素。 62.影响血红蛋白与氧结合的因素由_________、_________、_________和_________等。 63.蛋白质的超二级结构是指_________，其基本组合形式为_________、_________、-_________、_________ 、_________和_________等。 64.蛋白质的二级结构有_________、_________、_________、_________和_________等几种基本类型。 65.凝集素是一类能与_________相互作用的蛋白质。 66.许多钙结合蛋白都存在有_________图象，即他们的钙结合位点都由一个_________的结构单位构成。 67.确定蛋白质中二硫键的位置，一般先采用_________，然后用_________技术分离水解后的混合肽段。 二、问答题 1.1、某氨基酸溶于pH 7的水中，所得氨基酸溶液的pH值为6,问此氨基酸得pI是大于6、 第三章蛋白质化学 一、氨基酸： 1. 结构特点：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。 2. 分类：根据氨基酸的R基团的极性大小可将氨基酸分为四类：①非极性中性氨基酸(8种)；②极性中性氨基酸(7种)；③酸性氨基酸(Glu和Asp)；④碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。 二、肽键与肽链： 肽键(peptide bond)是指由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基经脱水而形成的共价键(-CO-NH-)。氨基酸分子在参与形成肽键之后，由于脱水而结构不完整，称为氨基酸残基。每条多肽链都有两端：即自由氨基端(N端)与自由羧基端(C端)，肽链的方向是N端→C端。 三、肽键平面(肽单位)： 肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转；组成肽键的四个原子及其相邻的两个α碳原子处在同一个平面上，为刚性平面结构，称为肽键平面。 四、蛋白质的分子结构： 蛋白质的分子结构可人为分为一级、二级、三级和四级结构等层次。一级结构为线状结构，二、三、四级结构为空间结构。 1．一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序，其维系键是肽键。蛋白质的一级结构决定其空间结构。 2．二级结构：指多肽链主链骨架盘绕折叠而形成的构象，借氢键维系。主要有以下几种类型：α-螺旋、β-折叠、β-转角、r转角、无规卷曲。 α-螺旋结构特征为：①主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；②螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm；③相邻螺旋圈之间形成许多氢键。 3. 超二级结构：指相互邻近的二级结构在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形 生物化学蛋白质化学练 习含答案 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-19882） 第三章蛋白质化学练习卷 一、填空题 (一)基础知识填空 1. 组成蛋白质的碱性氨基酸有、 和。酸性氨基酸有 和。 2. 在下列空格中填入合适的氨基酸名称。 (1) 是带芳香族侧链的极性氨基酸。 (2) 和是带芳香族侧链的非极性氨基酸。 (3) 和是含硫的氨基酸。 (4) 是最小的氨基酸，是亚氨基酸。 (5)在一些酶的活性中心起重要作用并含有羟基的分子量较小的氨基酸是，体内还有另两个含羟基的氨基酸分别是和。 3. 氨基酸在等电点时，主要以离子形式存在，在 pH>pI的溶液中，大部分以离子形式存在，在pH 第三章蛋白质化学 蛋白质功能的多样性 ●1. 催化功能-酶 ●2. 调控功能-激素、基因调控因子 ●3. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白 ●4. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白 ●5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 ●6. 结构成分-皮、毛、骨、细胞骨架 ●7. 支架作用-接头蛋白 ●8. 防御功能-免疫球蛋白 ●9. 其他功能 生老病死，万物轮回(蛋白质层次)●生（诞生、生长）：在酶催化下老细胞 计划性凋亡和新细胞的再生、活细胞的代谢 ----（新陈代谢） ●老？蛋白质功能普遍衰退 ●病？个别蛋白质的功能障碍 ●死？蛋白质功能的全部停止/分解 蛋白质——生物功能分子 ●单细胞生物 多细胞动物 细胞水平 ●为什么人体细胞有不同的形状？ 细胞内有支撑体 ●？ ●功能蛋白大多为球状 蛋白质的含氮量 蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分 大多数蛋白质含氮量接近于16% 蛋白质含量 = 每克样品中含氮的克数 6.25 凯氏定氮法 二、蛋白质的水解 ●常用盐酸或硫酸 ●优点：水解产物不消旋 ●缺点：Trp被沸酸完全破坏含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解 （二）碱水解 一般用6M Na(OH)2或4M Ba(OH)2 ● ●缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化 ●优点：Trp不受破坏 （三）酶水解 ●蛋白酶的作用 ●优点：条件温和、常温、常压 无旋光异构、氨基酸不被破坏 ●缺点：水解不完全、中间产物多 蛋白质水解 酸/碱能将蛋白完全水解 得到各种AA的混合物 酶水解一般是部分水解 得到多肽片段和AA的混合物 氨基酸是蛋白质的基本结构单元 什么是α-氨基酸 ●----C-C-C-C-COOH γβα ●----C-C-C-C(NH2)-COOH α-氨基酸●----C-C-C(NH2)-C-COOH β-氨基酸●----C-C(NH2)-C-C-COOH γ-氨基酸（一）构成蛋白质的氨基酸 ●按照酸碱性质分类 1、中性AA 按照侧链基团的不同又分为： ●脂肪族氨基酸 ●芳香族氨基酸 ●含-OH氨基酸 ●含S氨基酸 ●亚氨基酸 2、酸性AA ●甘氨酸没有手性 ●其余19种AA都具有旋光性 ●脯氨酸是α-亚氨基酸 ●其余都是α-氨基酸 第三章蛋白质化学 一.填空题（每题2分） 1.已知蛋白质的二级结构的基本组成方式有（）、（）和 （）和（）。 2.因为（）、（）和（）三种氨基酸残基侧链 基团在紫外区有光吸收能力，所以在（）nm波长的紫外光吸收常被用来定性或定量检测蛋白质。 3.带电氨基酸有（）氨基酸和（）氨基酸两类，其中前者包 括（）、（）。 4.当氨基酸溶液的pH＝pI时，氨基酸以（）离子形式存在，所带净电荷为 （）；当pH＞pI时，氨基酸以（）离子形式存在；当氨基酸溶液的pH＜pI时，氨基酸以（）离子形式存在。 5.氨基酸具有两性解离特性，因此它既可以被（）滴定，由可以被 （）滴定。丙氨酸的pK(α-COOH)=2.34，pK(α-NH3+)=9.69，其pI=（），在pH=7时，在电场中向（）极方向移动。 6.蛋白质中存在（）种氨基酸，除了（）氨基酸外，其余氨 基酸的α-碳原子上都有一个自由的（）基和一个自由的（）基。 7.α-螺旋中相邻螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与（）平行。氢键 是由每个氨基酸的（）与前面隔三个氨基酸的（）形成的，它允许所有的（）都能参与氢键的形成。 8.稳定蛋白质胶体状态的因素是蛋白质分子上的（）及（）。 蛋白质胶体性质的应用，分离蛋白质的方法有（）、（）等。 9.加入低浓度的中性盐可使蛋白质的溶解度（），这种现象称 （）；而加入高浓度的中性盐，当达到一定的盐饱和度时，可使蛋白质的溶解度（），这种现象称（）。 10.维持蛋白质一级结构的化学键有（）和（）。维持二级结 构主要靠（），维持三级结构的作用力除了以上几种外还需要（）、疏水作用力和范德华力等。 11.蛋白质主链构象的结构单元包括（）、（）、 （）和（）。 12.由于体内的含氮物质以（）为主，大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均 为（）%，这是（）法的理论基础。如测得1g样品含氮量为10mg，则蛋白质的含量是（）%。 13.精氨酸的pK(α-COOH)=2.17，pK(α-NH3+)=9.04，pK(R基)=12.48，其pI值为 （），将其溶于pH=7的缓冲液中，此时精氨酸pI（）环境pH，则精氨酸带上（）电荷，如置于电场中，应向电场的（）极移动。 14.在20种氨基酸中，碱性氨基酸有精氨酸、（）和（），具 有羟基的氨基酸是（）和（）。 15.氨基酸与茚三酮发生氧化脱羧反应生成（）色化合物，而（） 与茚三酮反应不释放（）而生成（）化合物。 16.用电泳方法分离蛋白质的原理，是在一定的pH值条件下，不同蛋白质的（）、 （）和（）不同，而在电场中移动的（）和速率不同，从而使蛋白质得到分离。 17.现有甲、乙、丙、丁四种蛋白质，它们的等电点分别为8.0，4.5，6.8以及10.0，当在 pH=8.0缓冲液中，它们在电场中电泳的方向为：甲（），乙（），丙（），丁（）。 18.谷氨酸的pK1(α-COOH)=2.19，pK2(α-NH3+)=9.67，pKR(R基)=4.25，其pI值为 （），将其溶于pH=7的缓冲液中，此时谷氨酸pI（）环境pH，则谷氨酸带上（）电荷，如置于电场中，应向电场的（） ．下列氨基酸中哪一种是非必需氨基酸？ ．亮氨酸．酪氨酸．赖氨酸．蛋氨酸．苏氨酸 ．蛋白质地组成成分中，在处有最大吸收值地最主要成分是： ．酪氨酸地酚环．半胱氨酸地硫原子．肽键．苯丙氨酸文档收集自网络，仅用于个人学习 ．下列种氨基酸中哪个有碱性侧链？ ．脯氨酸．苯丙氨酸．异亮氨酸．赖氨酸 ．下列哪种氨基酸属于亚氨基酸？ ．丝氨酸．脯氨酸．亮氨酸．组氨酸 ．下列哪一项不是蛋白质α螺旋结构地特点？ ．天然蛋白质多为右手螺旋．肽链平面充分伸展 ．每隔个氨基酸螺旋上升一圈. ．每个氨基酸残基上升高度为. 文档收集自网络，仅用于个人学习 ．下列氨基酸中哪一种不具有旋光性？ ．．．．．文档收集自网络，仅用于个人学习 ．下列哪种酶作用于由碱性氨基酸地羧基形成地肽键？ ．糜蛋白酶．羧肽酶．氨肽酶．胰蛋白酶文档收集自网络，仅用于个人学习 ．下列关于蛋白质结构地叙述，哪一项是错误地？ ．氨基酸地疏水侧链很少埋在分子地中心部位 ．电荷地氨基酸侧链常在分子地外侧，面向水相 ．白质地一级结构在决定高级结构方面是重要因素之一 ．白质地空间结构主要靠次级键维持文档收集自网络，仅用于个人学习 ．列哪些因素妨碍蛋白质形成α螺旋结构？ ．脯氨酸地存在．氨基酸残基地大地支链 ．性氨基酸地相邻存在．性氨基酸地相邻存在．以上各项都是 文档收集自网络，仅用于个人学习 ．对于β折叠片地叙述，下列哪项是错误地？ ．β折叠片地肽链处于曲折地伸展状态 ．β折叠片地结构是借助于链内氢键稳定地 ．有地β折叠片结构都是通过几段肽链平行排列而形成地 ．氨基酸残基之间地轴距为文档收集自网络，仅用于个人学习 ．维持蛋白质二级结构稳定地主要作用力是： ．盐键．疏水键．氢键．二硫键 ．维持蛋白质三级结构稳定地因素是： 第三章蛋白质化学参考答案 一、单项选择题 1.E 2.C 3.B 4.A 5.D 7.D 8.E 9.C 10.B 11.A 12.E 13.B 14.C 15.D 16.B 17.C 18.D 19.E 20.A 21.B 22.B 23.E 24.E 25.C 26.A 27.D 30.A 31.C 32.D 39.B 二、填空题 1. C H O N 2. N 80 3.兼性离子等电点 4. 氨基酸组成排列顺序 5. 羧基氨基肽键 6. 同种电荷(表面电荷）水化膜 8. 氢键盐键疏水键 9. 20 精氨酸组氨酸赖氨酸谷氨酸天冬氨酸 10. 谷氨酸精氨酸丙氨酸 15. 基本空间 16. 丝氨酸苏氨酸酪氨酸 17. 苯丙氨酸酪氨酸色氨酸 18. 球状蛋白纤维状蛋白单纯蛋白结合蛋白辅基 三、名词解释 1．具有相应的遗传密码、用于合成蛋白质的20种氨基酸。 2．当氨基酸或蛋白质在溶液中所带正负电荷相等时，此时溶液的pH值即氨基酸或蛋白质的等电点。 3．一个氨基酸的α羧基与另一氨基酸的α氨基脱水缩合形成的酰胺键。 4．氨基酸通过肽键连接而成的化合物 5．由于肽键具有部分双键的性质，使得与肽键相连的6个原子（CCONHC）构成一个刚性的平面。 6．多个氨基酸分子缩合而成的肽 7．多肽链中每个氨基酸单位 8．多肽链中氨基酸的组成和排列顺序 9．蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转构成的局部空间构象 10．在二级结构的基础上，多肽链中相距较远的侧链通过相互作用进一步盘绕而成的特定空间构象，包括主链和侧链所有原子的空间排布。 11．两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链，通过非共价键连接形成的空间构象。12．肽键平面围绕α碳原子的旋转而形成的右手螺旋。 13．2个或3个二级结构肽段在空间上进一步聚集和组合形成的空间结构，又称模体。14．超二级结构的进一步组合、折叠，形成紧密、稳定而且在蛋白质分子构象上明显可区分的、相对独立的区域性结构。 15．在蛋白质分子的四级结构中，具有独立三级结构的多肽链为一个亚基。 四、问答题 1．组成蛋白质的元素有碳、氢、氧、氮和硫等，其中氮是蛋白质的特征性元素，平均含量为16%。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，组成蛋白质的20种氨基酸，都属于L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。 2．蛋白质是两性电解质。在蛋白质分子可解离的基团中，除每条肽链上的氨基末端和羧基末端外，还有侧链上可解离基团。蛋白质分子在溶液中的解离程度，取决于其分子上酸性基团和碱性基团的相对比例，以及溶液pH的影响。在酸性较强的溶液中，蛋白质分子解离成正粒子；在碱性较强的溶液中，蛋白质分子解离成负离子。这种现象称蛋白质的两性解离。3．一级结构是指多肽链中氨基酸的组成和排列顺序；二级结构是指肽键平面的相对旋转所形成的空间结构；三级结构是指在二级结构基础上进一步盘绕折叠所形成的空间构象；四级结构是指亚基间的相互作用形成的空间结构。维持蛋白质一级结构的作用力是肽键；维持二级结构的作用力使氢键；维持三级结构的作用力是氢键、盐键、疏水键、范德华力、二硫键；维持四级结构的作用力是氢键、盐键、疏水键、范德华力。 4．右手螺旋；螺旋一圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，R基分布在螺旋的外侧，每个肽键的C=O与第四个肽键的H-N形成氢键，R侧链的大小、形状、带电状态等均可影响α螺旋的形成。生物化学第三章蛋白质化学名词解释
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