莲房原花青素通过线粒体介导的内源性Caspase途径
诱导HepG2细胞凋亡
段玉清，许慧，曲文娟，罗孝平，赵彬，李盼，张海辉
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）
摘要：研究莲房原花青素(LSPCs)诱导肝癌HepG2细胞凋亡的机制。利用MTT法检测LSPCs对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用，Hochest 33258染色观察凋亡细胞的核形态，Annexin V-FITC /PI双染流式细胞术检测细胞凋亡水平，彗星实验用来检测细胞DNA 损伤，JC-1染色用来检测线粒体膜电位，Western blotting法检测细胞凋亡蛋白水平的表达。LSPCs作用细胞后，显著抑制HepG2细胞的增殖；细胞凋亡征象明显，核染色体高度凝聚，细胞核碎裂，核固缩，染色质凝聚的细胞数从3.86%增至42.76%（p<0.01）；活细胞率急剧减少，而凋亡率从5.32%增至67.05%（p<0.01）；LSPCs诱发细胞产生DNA损伤，线粒体膜电位下降，导致Cytochromec、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达量增加，Bax蛋白的表达量上调，Bcl-2蛋白的表达量下调，Bax/Bcl-2的比值上升。而凋亡抑制剂Z-V AD能够削弱LSPCs对HepG2细胞增殖的抑制作用，显著下调细胞核聚缩，抑制线粒体损伤及Caspase相关蛋白的表达量，最终阻断LSPCs的致凋亡作用。由此得出结论，LSPCs可通过线粒体介导的内源性Caspase途径诱导人肝癌细胞凋亡。
关键词：原花青素；细胞凋亡；Caspase途径
文章篇号：1673-9078(2016)9-1-7 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.9.001 Procyanidins from Lotus Seedpod Induce Apoptosis in HepG2 Cells via
Caspase-dependent Pathway
DUAN Yu-qing, XU Hui, QU Wen-juan, LUO Xiao-ping, ZHAO Bin, LI Pan, ZHANG Hai-hui (School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China) Abstract: The possible mechanism of apoptosis induced by procyanidins from lotus seedpod (LSPCs) in human hepatoma HepG2 cells was investigated. The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was performed to study the inhibitory effect of LSPCs on HepG2 cell proliferation, morphological changes in apoptotic nuclei were observed via Hoechst 33258 staining, and the percentage of apoptotic cells was calculated by double-staining flow cytometry using Annexin V conjugated to fluorescein isothiocyanate and propidium iodide. DNA damage, mitochondrial membrane potential, and expression levels of apoptotic proteins were determined by comet assay, JC-1 staining, and western blot, respectively. The results indicate that after treatment with LSPCs, HepG2 cell proliferation was significantly inhibited; there were obvious signs of apoptosis, including high chromatin condensation level, nuclear fragmentation, and karyopyknosis; and the number of chromatin-condensed cells increased from 3.86% to 42.76% (p<0.01). The percentage of viable cells decreased significantly and the proportion of apoptotic cells increased from 5.32% to 67.05% (p<0.01). Treatment with LSPCs caused DNA damage, loss of mitochondrial membrane potential, an increase in the protein expression levels of cytochrome C, caspase-3, and caspase-9, in addition to upregulation of Bax protein expression and downregulation of Bcl-2 protein expression. However, the apoptosis inhibitor Z-VAD reduced the inhibitory effect of LSPCs on HepG2 cell proliferation, significantly reduced nuclear condensation, inhibited mitochondrial damage and caspase protein expression, and eventually inhibited LSPC-induced apoptosis. Thus, the results show that LSPCs trigger apoptosis in HepG2 cells via the mitochondria-mediated, endogenous caspase pathway.
Key words: procyanidins; cell apoptosis; caspase-dependent way
收稿日期：2015-09-24
基金项目：国家自然科学基金项目（31201456，31371734）；江苏省自然基金项目(BK2012287)；江苏省“六大人才高峰”（SWYY-022）；江苏省“青蓝工程”；江苏高校优势学科建设工程项目
作者简介：段玉清（1973-），女，教授，博士生导师，主要从事药食同源植物活性成分提取分离新技术及功能活性评价研究
通讯作者：张海晖（1975-），男，副教授，主要从事食品活性成分提取分离及功能评价研究
1
肝癌是全世界最常见及致命的癌症之一。每年有超过50万名新增病例肝癌。肝癌对放疗、化疗及免疫治疗不敏感，是一种致命的预后不良疾病。天然植物萃取类如饮食类黄酮和多酚物质等作为药物已成为预防和治疗癌症的新途径。原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，属于生物类黄酮。有研究表明，原花青素可通过凋亡途径抑制多种肿瘤细胞生长或诱导其死亡，且可拮抗化疗药物对正常细胞的毒性
作用[1]。
2
H
细胞凋亡是细胞在胞内外信号诱导下发生的主动
自杀死亡过程。外界刺激经过复杂的信号转导系统进入细胞核，活化凋亡相关基因的表达，启动凋亡程序，最终由内源性核酸酶沿核小体切断链，导致一系列凋亡表型改变和凋亡小体形成等。凋亡的启动途径分为内源性和外源性两种。内源性凋亡通路又称线粒体凋亡通路，主要是由于细胞或DNA损伤引起，诱导线粒体膜电位去极化，最终导致线粒体膜损伤，内容物的释放。Caspase依赖的凋亡的执行主要是通过Caspase 蛋白酶家族介导的级联水解活化过程完成的。关于Caspase凋亡信号通路在抗癌治疗中作用的研究已成为近年来的研究热点[2,3]，多种抗癌药物的作用机制都与Caspase信号通路的活化相关。有研究证实党参内酯Ⅲ是通过启动线粒体介导的内源性Caspase凋亡信号通路来诱导人肺癌A549细胞凋亡[4]。Barras D等人研究表明多数抗癌多肽化合物借助Bcl-2蛋白调控Caspase通路，促进癌细胞凋亡[5]。Zhang[6]等人研究发现板栗壳原花青素可通过线粒体ROS诱导epG2细胞凋亡，并且导致线粒体膜电位下降。另有研究报道葡萄籽原花青素抑制胰岛细胞增殖，诱导凋亡[7]。本课题从睡莲科植物莲的成熟花托中分离出组莲房原花青素(Procyanidins from lotus seedpod，LSPCs)，并明确了LSPCs是由儿茶素或表儿茶素以C4-C8或C4-C6键连接而成的2~4聚体所组成[8]。本课题组之前的研究证实LSPCs能够诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡[9]。本研究旨在探讨LSPCs是否以凋亡的方式诱导人肝癌HepG2细胞死亡以及与线粒体介导的Caspase内源性凋亡通路之间的关系。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
人肝癌细胞(HepG2)，购自于北京中科院生物化学和细胞生物学研究所。DMEM培养基，胎牛血清，胰酶均购于Gibco公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购买于Sigma公司。Hoechst 33342、JC-1和Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒购自于碧云天生物工程公司。Z-VAD 和β-actin抗体购买于AMRESCO公司。Caspase-3、Caspase-9及Cytochrome C购买于Abcam公司。
1.2方法
1.2.1 细胞培养
HepG2细胞培养于含10%灭活新生牛血清DMEM培养液中，置于37 ℃，5% CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2~3 d传代1次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT法检测细胞活性
取对数生长期细胞，消化、计数，以2×104个/mL 的密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL。培养24 h 后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。培养结束后，去上清液，PBS 洗两次，每孔加入100 μL MTT (1 mg/mL)，继续培养
4 h，去上清液，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡
10 min，用酶标仪在490 nm 处测定吸光度值，计算
抑制率，公式如1所示：
1.2.3 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞
凋亡
将1×106个/mL的密度接种于6孔培养板中，培养24 h后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h，或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。培育结束后，收集1×106个细胞，用预冷PBS洗2遍后，加入400 μL结合缓冲液，轻轻混匀细胞后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。流式细胞检测双染图中：位于左下角(LL)的细胞群为正常细胞；右下角(LR)的为早期凋亡细胞；右上角(UR)的为晚期凋亡细胞；左上角(UL)的为坏死细胞。
1.2.4 Hoechst 33342染色检测细胞核形态
取对数生长期的HepG2细胞，消化、计数，以1×105个/mL的密度接种于6孔培养板中，培养24 h 后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h，或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。吸去培养基，用PBS洗2遍，加入10 μg/mL Hoechst 33258染液避光染色10 min，%
100
)
/
-1(
(%)×
=对照组吸光度值
给药组吸光度值
抑制率（1）
吸去染色液，用PBS洗两遍后，荧光显微镜观察核变化。每个样本选取十个视野拍摄图片，并用Image J 软件进行细胞计数。
1.2.5 单细胞电泳检测DNA 损伤
将1×106个/mL的密度接种于6孔培养板中，培养24 h后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h，或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。吸除培养液，用胰酶消化细胞，1000 g左右离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS重悬制成约3×106个/mL细胞悬液。琼脂糖凝胶制片，将载玻片浸入胞裂解液中，裂解1.5 h。细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽中，碱解旋20 min，而后在25 V和300 mA条件下电泳20 min。电泳完毕后，将载玻片取出，用Tris-HCl（pH 7.5）中和15 min，然后在每片载玻片上滴加50 μL 10 μg/mL的EB溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20 min，即可在倒置相差荧光显微镜下观察并用CASP彗星图像分析软件自动分析。
1.2.6 JC-1染色检测线粒体膜电位
取对数生长期的HepG2细胞，消化和计数，以每孔2×104个细胞接种于96孔培养板中培育24 h后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h，或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。培养结束后，吸去培养基，加入10 μg/mL JC-1染料，37 ℃下避光孵育30 min，PBS洗两次。荧光酶标仪在激发光波长488 nm，发射光波长525/590 nm检测荧光强度，并用荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 Western Blot免疫印记法
将1×105个/mL的密度接种于6孔培养板中，培养24 h后，以终浓度为100 μg/mL LSPCs处理细胞24 h，或提前1 h用20 μmol/L Z-VAD预先处理，再加入100 μg/mL LSPCs孵育24 h。裂解液裂解，13000 r/min 离心20 min，取上清用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度；煮沸；得到的总蛋白样进行SDS-PAGE电泳，然后转膜至PVDF膜上，4 ℃封闭过夜后分别孵育Caspase-3、Caspase-9、Cytochromec及Bax、Bcl-2的单克隆一抗，洗膜后，孵育辣根过氧化物酶标记的二抗；最后用ECL显色化学曝光机曝光。
1.2.8 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(?x±s)的形式表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，p<0.05时认为差异具有统计学意义。
2 结果与讨论 2.1 莲房原花青素对人肝癌HepG2细胞的生
长抑制作用
图1 经Z-VAD预处理减弱LSPCs对HepG2细胞生长的抑制作用 Fig.1 Reduction of the inhibitory effect of LSPCs on HepG2 cell
growth by Z-V AD pretreatment
注：*与正常对照组相比有显著性差异(p<0.05)；#与Z-V AD+LSPCs组相比有显著性差异(p<0.05)，下同。
课题组之前工作已经证实LSPCs对HepG2细胞的增殖具有显著的抑制作用，且其抑制作用存在时间和浓度依赖关系。本文旨在探明凋亡抑制剂Z-V AD 对LSPCs抑制细胞增殖的影响。如图1所示，单独Z-VAD组的抑制率为(3.53±0.16%)。当100 μg/mL LSPCs处理HepG2细胞24 h后，细胞抑制率最高达到(53.24±1.43%)，经Z-VAD预处理后，抑制率为(28.79±1.38%)，比单独LSPCs组降低了24.45%，结果表明Z-VAD能够削弱LSPCs对HepG2细胞增殖的抑制作用。
2.2 Hoechst 33258染色观察LSPCs对HepG2细胞核形态的影响
凋亡的细胞会出现细胞核固缩，染色质凝聚成凋亡小体。Hoechst 33258是可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，用于观察核的变化情况，检测细胞凋亡。由图2a、b和d可知，在荧光显微镜下，正常对照组及单独Z-V AD组细胞核完整，核固缩，染色质凝聚的细胞数分别为(3.86±0.26%)和(3.45±0.52%)。当100 μg/mL LSPCs作用于HepG2细胞24 h后，凋亡征象非常明显，大量细胞胞体缩小，胞质浓缩，核染色体高度凝聚、边缘化，细胞核碎裂呈碎片状(图2d)，核固缩，染色质凝聚的细胞数达到最高(42.76±1.96%)。当使用Z-V AD预处理HepG2细胞后，经Hochest33258染色的核聚缩细胞数减少，与单独LSPCs相比，核固缩，染色质凝聚的细胞数减少到(20.12±1.15%) (图2c)。结
3
果表明凋亡抑制剂Z-VAD 能显著下调LSPCs 引起的HepG2细胞核聚缩作用。
4
图2 LSPCs 作用24 h Hoechst 33342荧光染色结果 Fig.2 Detection of LSPC-induced (24 h) apoptosis in HepG2
cells by Hoechst 33342 staining
注：a ，空白对照组；b ，Z-V AD 组；c ，Z-V AD+LSPCs 组；d ，LSPCs 组，下同。
2.3 Annexin V-FITC/PI 双染色检测HepG2细胞凋亡和坏死
表1 Annexin V-FITC/PI 双染色流式细胞仪检测HepG2细胞凋
亡结果
Table 1 LSPC-induced apoptosis in HepG2 cells detected by
Annexin V-FITC/PI double-stain flow cytometry HepG2 Control Z-VAD Z-VAD+LSPCs LSPCs LL/% 93.73±1.72 92.02±1.08 79.84±0.07* 32.12±0.09**UL/% 0.95±0.19 3.54±1.19* 4.01±1.21* 0.84±0.21UR/% 1.30±0.06 0.97±0.06 4.87±0.10* 18.97±0.10**LR/% 4.02±0.13 3.47±0.05 11.28±0.01
48.08±0.18**
注：*与正常对照组相比有显著性差异(p <0.05)；**与正常对
照组相比有显著性差异(p <0.01)。
图3 Annexin V-FITC/PI 双染色流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡 Fig.3 LSPC-induced apoptosis in HepG2 cells detected by
Annexin V-FITC/PI double-stain flow cytometry
AnnexinV-FITC/PI 双标记法是用FITC 标记了的
Annexin V 作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生。而PI 是一种核酸染料，不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红，用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。将Annexin V 与PI 联合使
用时，可以将凋亡细胞、坏死细胞与正常细胞区分开。通过Annexin V-FITC/PI 双染可以充分鉴定LSPCs 诱导HepG2细胞的死亡方式。从图3a 和d 可看出，相比于空白组，当100 μg/mL LSPCs 作用于HepG2细胞24 h 后，活细胞率急剧下降，从93.73±1.72%（空白对照组）降至（32.12±0.09%，p <0.01），而细胞的凋亡比例则显著上升，从5.32±0.13%（空白对照组）增至（67.05±0.19%，p <0.01），坏死率则无明显差异。结果表明LSPCs 主要诱导HepG2细胞以凋亡为主，坏死为辅的方式死亡。如图3c ，当使用Z-VAD 预处理后，早期凋亡率和晚期凋亡率比单独LSPCs 组总共减少了50.90%，坏死率则从0.84±0.21(单独LSPCs 组)增加到（4.01±1.21，p <0.05）。结果表明凋亡抑制剂Z-VAD 能够明显削弱LSPCs 诱导HepG2细胞的凋亡作用，且Z-VAD 能够增强细胞以坏死方式死亡。
5
2.4 LSPCs 诱导HepG2细胞DNA 损伤
图4 LSPCs 对HepG2细胞DNA 损伤作用(×400) Fig.4 HepG2 cell DNA damage in LSPC-treated HepG2 cells
(×400)
表2 LSPCs 对HepG2细胞DNA 损伤作用
Table 2 HepG2 cell DNA damage in LSPC-treated HepG2 cells Group Tail length/μm
Tail DNA/% Tail Moment/μm
control 39.2±3.63 3.90±1.52 3.12±1.70 Z-V AD 42.2±7.82 4.08±2.23 3.02±0.85
Z-V AD+LSPCs 70.4±7.57** 20.52±8.55** 38.85±5.34**
LSPCs 161.6±6.58** 56.34±6.91** 96.37±7.86** 彗星试验已被用于检测各种化合物对HepG2细
胞的基因毒性,能够快速量化的DNA 电泳迁移程度
[10]。彗星试验能够确定DNA 损伤端点,包括嵌入单个
细胞在显微镜幻灯片上琼脂糖和测量核DNA 电泳迁
移的程度。由图4a 可见，对照组在电泳图上仅出现荧
光团，没有拖尾现象。而图4d 中，LSPCs 作用细胞后，
在荧光团后面出现较长的拖尾现象。Tail DNA%、Tail Moment 均明显高于对照组，差异具有统计学意义（p <0.01），表明LSPCs 能够诱导HepG2细胞DNA 损伤。经Z-V AD 预处理后，LSPCs 引起的DNA 拖尾现象得到改善，DNA 损伤明显减少。结果表明Z-V AD 能够部分阻断LSPCs 造成的DNA 损伤。
2.5 LSPCs 诱导HepG2细胞线粒体膜电位下
降
图5 LSPCs诱导HepG2细胞线粒体膜电位降低 Fig.5 Decrease in mitochondrial membrane potential of
LSPC-treated HepG2 cells
线粒体的结构、功能与细胞凋亡密切相关。正常
线粒体膜电位的形成是保持线粒体功能所必需的。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡线粒体通路的早期特征
表现。如图5a 和d 所示，与对照组相比，100 μg/mL LSPCs 处理HepG2细胞24 h 后，绿色荧光强度增大，红色荧光强度减弱，线粒体膜电位下降的量是空白对照组的0.44倍(p <0.05)，结果表明，LSPCs 对HepG2细胞的线粒体膜造成了损伤。然而，当给予Z-V AD 阻断之后，与单独LSPCs 组相比，线粒体膜电位减少的趋势
被抑制，红/绿色荧光强度下降，线粒体膜荧光强度上升的量是单独LSPCs 组的1.74倍(p <0.05)。结果表明Z-V AD 能够抑制LSPCs 造成的线粒体损伤。
2.6 Western blot 法测Caspase-3、Caspase-9以及Cytochrome c
的表达量
6
图6 Western blot法检测LSPCs作用后Caspase-3、Caspase-9
和Cytochrome c蛋白的表达量
Fig.6 Expression levels of caspase-3, caspase-9, and cytochrome c in LSPC-treated HepG2 cells measured by western blot
Caspase 家族是一些存在于细胞质中具备相似结
构的蛋白酶，这些蛋白酶活性位点均包含半胱氨酸残基，能特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase 家族蛋白负责有选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。如图6b 所示，与对照组相比，100 μg/mL LSPCs 处理HepG2细胞24 h 后，Caspase-9、Caspase-3、Cytochrome c 蛋白表达量显著增强，分别是对照组的3.97倍(p <0.01)、3.01倍(p <0.01)和3.54倍(p <0.01)。而经Caspase 抑制剂Z-VAD 预处理后，Caspase-3、Caspase-9和Cytochrome c 蛋白表达的增加量均有所下降，分别是单独LSPCs 组的0.7倍、0.66倍和0.72倍。结果表明LSPCs 能够显著诱导HepG2细胞凋亡的发生，其可能机制是LSPCs 导致HepG2细胞线粒体膜电位下降，破坏了线粒体膜的完整性，促使Cytochrome c 从线粒体中释放，激活Caspase-9
和Caspase-3介导的线粒体凋亡通路，而Caspase 抑制剂Z-V AD 能够有效的抑制LSPCs 造成的细胞凋亡。
2.7 Western blot 法测Bax/Bcl-2的比值
图7 Western blot 法检测LSPCs 作用后Bax/Bcl-2蛋白表达量 Fig. 7 Bax and Bcl-2 protein expression and Bax/Bcl-2 ratio
after LSPC treatment measured by western blot
Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要的调节因子，促进凋亡的蛋白Bax 与抑制凋亡的蛋白Bcl-2是与线粒体途径相关的蛋白，两者的比值(Bax/Bcl-2)被称为“凋亡开关”，对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。结果如图7a ，与空白对照组相比，100 μg/mL LSPCs 处理HepG2细胞24 h 后，Bax 蛋白上调，Bcl 蛋白下调，Bax/Bcl-2的比值比空白组的3.6倍(p <0.01)。结果表明LSPCs 诱导细胞凋亡，相应的凋亡蛋白随着发生变化。与单独LSPCs 组相比，Z-VAD 预处理组的Bax 蛋白下调，Bcl 蛋白上调，Bax/Bcl-2的比值的增加受到了抑制，是单独LSPCs 组的0.7倍(p <0.01)。此结果表明Z-V AD 能阻断LSPCs 引发的细胞凋亡。这表明LSPCs 是通过调节凋亡相关蛋白的表达量，诱导肝癌细胞凋亡。
3 结论
3.1 本实验发现LSPCs 对人肝癌HepG2细胞增殖有显著抑制作用，并且通过激活线粒体介导的内源性Caspase 途径诱导细胞凋亡，具体表现为染色质固缩、凋亡小体形成等。LSPCs 诱导细胞的死亡方式以凋亡为主，坏死为辅。而凋亡抑制剂Z-VAD 在明显削弱LSPCs 诱导HepG2细胞的凋亡作用的同时，增强了细
胞以坏死的方式死亡。LSPCs诱导HepG2细胞DNA 链断裂，单细胞凝胶电泳试验结果表现为细胞Tail DNA%和彗星状拖尾尾长显著增加，表明LSPCs对HepG2细胞DNA有损伤作用。Z-V AD预处理后，细胞彗星状拖尾显著缩短，尾部DNA百分率明显降低，结果表明Z-V AD能够预防LSPCs导致的DNA损伤。LSPCs处理细胞后，Bax蛋白上调，Bcl蛋白下调，Bax/Bcl-2的比值上升，当加入Z-VAD之后，Bax/Bcl-2表达量上升的趋势被抑制。实验结果表明通过调节线粒体蛋白的表达发挥诱导肝癌细胞凋亡的作用。
3.2 天然活性成分在诱导肿瘤细胞凋亡时常常伴随着氧化应激，DNA损伤，线粒体膜电位下降等现象。线粒体凋亡通路主要由Bcl-2蛋白家族调控，线粒体的功能算上主要包括线粒体膜电位的下降，膜通透性的改变。Bax是Bcl-2家族的核心成员，主要负责调控细胞存货与凋亡之间的平衡，有研究证明在外界刺激下，Bax蛋白在线立体周围可形成挂聚糖，增加线粒体外膜的通透性，在整个凋亡途径中起到关键作用[11]。Caspase的激活可使细胞发生不可逆的凋亡。Caspase 家族成员以无活性的酶原形式存在于细胞内，Caspase 活化途径有线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路。Caspase-9是线粒体通路的关键蛋白，它的活化对整个内源性凋亡通路的激活尤为重要。细胞色素C从线粒体释放后，正常情况下，细胞的线粒体膜电位保持在平衡状态，只有当线粒体膜受到损伤时，造成线粒体呼吸链受损，抑制A TP合成，细胞色素C从线粒体释放后，会与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)结合，在脱氧三磷酸腺苷存在的情况下，激活Apaf-1。活化的Apaf-1结合在Caspase-9酶原而将之切割和活化，活化的Caspase-9切割Caspase-3酶原并产生活化的Caspase-3四聚体，最终引起细胞凋亡[12]。
3.3 本实验研究发现LSPCs可导致HepG2细胞DNA 损伤明显，诱导Bcl-2蛋白家族中促调往蛋白Bax的表达，同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，最终激活的Bax和Bad蛋白积聚于线粒体的外膜，通过开放电压通道或直接建立孔道等方式增加线粒体膜电位通透性，膜电位下降，使线粒体内外膜之间的细胞色素C等凋亡因子大量释放，从而引起Caspase的级联反映。但LSPCs导致细胞DNA损伤及线粒体膜电位下降的机制仍需进一步研究。
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神经干细胞的研究及其应用新进展 [关键词] 神经干细胞研究 健康讯: 崔桂萍天津市脑系科中心医院 300060 1992 年， Reynolds 首次成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（ neural stem cell, NSC ），于是“神经干细胞”这一概念被正式引入神经科学研究领域。可以总结为具有分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。不少文献中还提到神经祖细胞和神经前体细胞，目前认为，神经祖细胞是指比 NSC 更有明确发展方向的细胞，而神经前体细胞是指处于发育早期的增殖细胞，可指代 NSC 和神经祖细胞：与 NSC 相比，二者的分裂增殖能力较弱而分化能力较强，是有限增殖细胞，但三者均属 NSC 范畴。 1. NSC 的起源、存在部位及生物学特征中枢神经系统的发育起源于神经沟、神经嵴、神经管；研究发现， NSC 在神经管壁增殖，新生细胞呈放射状纤维迁移至脑的特定位置；主要存在于室管膜区，在成脑生发区以外的区域也广泛分布，即具有高度可塑性的神经前体细胞。现发现 NSC 的生物学特征为：（ 1 ）具有自我更新能力；（ 2 ）具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞；（ 3 ）处于高度未分化状态；（ 4 ）终生具有增殖分化能力，在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中（ 1 ）和（ 2 ）是 NSC 的两个基本特征。 2. NSC 的基础研究进展 NSC 的增殖和分化调控是目前 NSC 研究的核心问题，最近的研究资料显示， NSC 的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。神经递质神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递，还参与 NSC 的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨酸（ G1u ）、 5- 羟色胺（ 5-HT ）、 GABA 、甘氨酸（ G1y ）、乙酰胆碱（ Ach ）一氧化氮（ NO ）、肾上腺素与性激素等。 G1u ：在脑的发育过程中有高含量的 G1u 表达， Haydar 等发现， G1u 可以通过大鼠胚胎皮质 AMPA/KAR 的激活调节室周区前体细胞的增殖，但 GLU 对室管膜区（ SZ ）和室管膜下区（ SVZ ）体内细胞的影响是不同的，它可增加 SZ 细胞的增殖，减少 SVZ 细胞的增殖； GLU 还可促进神经元生长和分化。 5-HT ：许多研究表明， 5-HT 在皮质发育、突触形成中起重要作用，抑制 5-HT 合成或选择性损伤 5-HT 神经元则引起齿状回及脑室下区神经元增殖活性下降， 5-HT 可促进胶质细胞分化和髓鞘形成。 GABA ： GABA 是成体脑发育过程中主要
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
神经干细胞的应用前景及研究进展 生科1301班李桐 1330170031 神经干细胞( neuralstem cells, NSCs)是重要的干细胞类型之一，是神经系统发育过程中保留下来的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经细胞。具有很多的特性，如自我更新、多潜能分化、迁移和播散、低免疫原性、良好的组织相容性、可长期存活等。目前神经干细胞的分离与体外培养已取得可喜的进展，有关神经干细胞的研究已经成为国内外神经科学领域的热点。 一、神经干细胞的生物学特性 19世纪80年代提出了神经干细胞的概念，它是指一类多潜能的干细胞，能够长期自我更新与复制，并具有分化形成神经元、星形胶质细胞的能力。神经干细胞的主要特征：未分化、缺乏分化标记、能自我更新并具有多种分化潜能。它并不是指特定的单一类型的细胞，而是具有相类似性质的细胞群。Gage将神经干细胞的特性进一步描绘为以下三点，可生成神经组织或来源于神经系统，具有自我更新能力，可通过不对称法、分裂产生新细胞。神经干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞只有有限的自我更新能力，并自主分化产生神经元细胞和成胶质细胞。神经干细胞是具有自我更新和具有多种潜能的母系神经细胞，它能分化成各种神经组织细胞表型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.并能自我更新产生新的神经干细胞，在神经发育和神经损伤中发挥作用。神经干细胞移植、迁移及分化与局部环境密切相关，这种特性为移植及移植后的结构重建和功能恢复提供了依据，为移植治疗不同疾病提供了局可能。 二、神经干细胞的应用前景 1.细胞移植以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。神经干细胞的存在、分离和培养成功，尤其是神经干细胞系的建立可以无限地提供神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论，为损伤后进行替代治疗提供了充足的材料。研究表明，干细胞不仅有很强的增殖能力，而且尚有潜在的迁移能力，这一点为治疗脑内因代谢障碍而引起的广泛细胞受损提供了理论依据，借助于它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的附加损伤。另外，神经干细胞移植也为研究神经系统发育及可塑性的实验研究提供了观察手段，前文提及细胞因子参与调控神经元增殖和分化，通过移植的手段对这些因素的具体作用形式和机制进行探索，为进一步临床应用提供了理论基础。 2.基因治疗目前诱导干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的干细胞是这一领域的又一重大进展；另外已经发现许多细胞因子可以调节发育期甚至成熟神经系统的可塑性和结构的完整性，将编码这些递质或因子的基因导入干细胞，移植后可以在局部表达，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。 3.自体干细胞分化诱导移植免疫至今为止仍是器官或组织移植的首要问题。前文提到已经证明成年动物或人脑内、脊髓内存在着具有多向分化潜能的干细胞，那么使人们很容易想到通过自体干细胞诱导来完成损伤的修复。中枢神经系统损伤后，首先反应的是胶质细胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成胶质瘢。其实在这个过程中也有干细胞的参与，可不幸的是大多数干细胞增殖后分化为胶
综 述 内源性神经干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 胡 博 综述 尹宗生 审校 2010-11-10接收 作者单位:安徽医科大学第一附属医院骨科,合肥 230022作者简介:胡 博,男,硕士研究生; 尹宗生,男,教授,博士生导师,责任作者,E ma i :l yi nzong sheng @si na .co https://www.doczj.com/doc/6115939444.html, 摘要 成体脊髓本身存在一定数量的神经干细胞,称为内源性神经干细胞(EN SCs)。ENSC s 对脊髓损伤(SC I)的作用越来越受到关注并可能成为SC I 最有潜力的治疗方式。现对神经干细胞(NSC s)生物学特性、SC I 后N SCs 的反应及抑制其分化因素的分析,阐述了EN SCs 治疗SCI 的优势及意义,对近几年来促进EN SCs 修复SC I 的研究现状进行了综述。主题词 脊髓损伤/治疗自由词 内源性神经干细胞中图分类号 R 681 54;R 322 8 文献标识码A 文章编号1000-1492(2011)01-0083-04 脊髓损伤(sp i n al cor d i n j u ry ,SC I)是一类临床常见的严重致残性疾病,SC I 的治疗至今仍是医学界的难题之一。目前的治疗方式有很多,但是效果一直不令人满意。自从1992年R eynolds 和W e iss 首先从小鼠纹状体中分离而获得的神经干细胞(neura l ste m cells ,NSC s)以来,对于它的特性研究已经成为当今细胞基础实验研究的焦点 [1] 。人们注 意到成体脊髓本身存在一定数量的NSC s ,称为内源性神经干细胞(endogenous neural ste m cells ,EN SCs),这些ENSCs 在SC I 后可以大量增殖 [2] 。目 前,E NSCs 的作用逐渐突显,特别在ENSCs 治疗脑疾病方面的研究已取得了一定进展[3] 。同时,EN SCs 对SC I 的作用也受到关注并可能成为SC I 最有潜力的治疗方式。现对E NSCs 的特征、在SC I 治疗中的意义及相关研究与进展进行综述。1 N SCs 的分布及生物学特性 成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous syste m,C NS)存在有未分化的NSC s ,当其受到损伤刺激时静息态的NSCs 被激活,在诱导因子的作用下向损伤部位迁移并重新进入细胞增殖周期进一步分化为特定功能的神经细胞。神经系统受到损伤时,这些细胞可以复苏并分裂增殖来取代坏死的神 经元,促进神经系统功能恢复。目前已有实验证明,成年哺乳动物脑内有两个区域可产生大量的神经元,它们是海马结构的颗粒下区(subg ranu l a rzone , SGZ)和侧脑室下区(subventricu lar one ,SVZ),然而对于脊髓中ENSCs 存在的位置尚不十分明确,但在室管膜区和脊髓实质均能培养出ENSCs [4] 。成年NSC s 增殖和迁移成为神经祖细胞(neura l progenitor ce lls,NPC s)有两种方式。第一种方式认为:位于中央管的室管膜层的干细胞缓慢增殖,这些细胞的自我更新和分化在一定的条件下不对称性分裂,并迁移到脊髓的外层,分化为可增殖的胶质祖细胞或者成熟的脊髓胶质细胞 [5] 。第二种方式认为:无论是 干细胞或是神经胶质祖细胞都可能存在于脊髓实质或独立增殖的室管膜,在成人的脊髓白质细胞中的 大部分祖细胞产生一定的变异,可表达1个或多个标志物如硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)NG2或转录因子O li g 2和Nkx212[4] 。这些细胞部分为多能干细胞,另一部分为胶质祖细胞并能转向少突胶质细胞。ENSCs 能自我更新,并分化成神经元细胞、星形胶质细胞(ast rocy tes ,AS)、少突胶质细胞。如果能将ENSCs 更多的向神经元分化,则能促进成体脊髓神 经元生发,修复SC I [6] 。 2 SCI 后EN SC s 的反应及抑制其分化的因素 外伤性SCI 可引起周围神经元和神经胶质细胞的病变,导致神经元和神经系统功能障碍和通路的损坏。该损伤的病理演变主要分为两个阶段: 脊髓主要受损部位的细胞和组织损伤; 脊髓非主要 受损部位的继发性损伤。已经有实验证明[7] ,成人脊髓祖细胞能对损伤进行反应,NPCS 的分裂,迁移和炎症等能诱导祖细胞产生反应。虽然脊髓中的祖细胞能通过支持和参加髓鞘再生以及替代损伤的神经元的方式参与脊髓修复,但是其在成年脊髓中的损伤修复却有很多抑制因素。现对ENSCs 抑制因素的研究发现主要有以下几方面。2.1 瘢痕组织的形成对神经再生的影响 CNS 损伤会启动一系列与形成瘢痕组织相关的细胞及分子间的反应,以阻止损伤的进一步扩大,并可持续数天
神经干细胞研究介绍 陈晓萍 程君奇 (浙江大学生命科学学院浙江省细胞与基因工程重点实验室浙江杭州310029) 摘要 神经干细胞研究是近年脑科学研究的热点,本文综述了神经干细胞的分离培养方法、脑内迁移路线、发育分化的影响因素以及可能的应用前景。 关键词 神经干细胞 分离 迁移 发育 分化 脑的结构与机能一直是生命科学的研究难题,它以极其错综复杂而又高度易变为特征,至今仍保持着极大的神秘性。近年来科学家对神经干细胞的研究是脑科学领域的重要成果之一,它突破了以往一直认为的成年动物神经细胞不能分裂再生的观念,为神经细胞的发育分化过程,也为神经系统疾病的治疗开辟了一条全新的途径。 1 神经干细胞的分离培养 神经干细胞(N eural stem cells,N SCS)是指具有如下特征的细胞:1)能形成神经组织;2)具有自我繁殖和自我更新能力;3)细胞分裂后能发生分化[1]。 胚胎时期是神经系统快速增长发育的阶段,在这时期脑内的许多部位都存在神经干细胞,这包括大脑皮质、纹状体、小脑等区域。成年后,脑细胞一般不再分裂增殖。以往曾一度认为成年动物神经细胞完全失去了这种能力,但近年科学家在高等哺乳动物(包括人)的脑室管膜下层等区域发现了仍具有增殖分化能力的神经干细胞。另外,在啮齿类动物主管学习记忆的海马区,也发现了神经干细胞的存在[2]。 成年动物脑内的神经干细胞仅仅是保存了能进行分裂增殖的潜能,通常情况下得不到足够的正面刺激信号,因而并不分裂增殖,而是处于静止状态。 从脑组织分离培养神经干细胞需要特殊的条件,目前多采用生长因子刺激和细胞克隆技术。具体有3种方法[3]:1)用无血清培养液将脑细胞分离,再加入具有丝裂原作用的生长因子如表皮生长因子或碱性成纤维生长因子,待原代克隆形成后挑选单个克隆机械分离继续进行亚克隆培养,也可采用单细胞克隆分离;2)用反转录病毒向脑细胞内导入原癌基因,如V2m yc和SV40大T抗原等,部分细胞可因此获得持续分裂的能力;3)从脑组织以外的部位,如胚胎干细胞,经过适当化学因子的诱导,使其定向分化为神经干细胞。 外加化学因子对于维持神经干细胞的分裂增殖能力是必须的。培养液中如撤去外加的化学因子,改用普通培养,神经细胞会很快发生分化,失去分裂增殖能力。 2 神经细胞的发育及脑内迁移路径 神经系统的发育源于胚胎早期的神经管和神经嵴[4],其中的中央管经发育形成脑室系统和脊髓中央管,管腔内表面覆盖的上皮细胞具有活跃的增殖和分化能力,是神经细胞发生的来源。成年后这个区域称为室管膜 室管膜下区。 内径1～2mm的完全闭合的呼吸管。据B landfo rd报道,这种呼吸管中衬有外套膜组织。上述蜗牛的夏眠能从1月持续至6月。同时具有裂口、裂沟和缝合线管的结构有利于气体的循环。在足部和外套膜肌肉运动下,可促使气体交流和循环,贝类学家F ischer曾对冬眠期间的盖罩大蜗牛进行了研究,业已证明其足部和外套膜从未停止过运动。 8)喇叭状口和壳壁上的穿孔 A lycaeinae的种类,其成体的壳口呈喇叭状,其后逐渐缩小成一口颈。在口颈近缝合线的壳壁上有穿孔。A ly caeus属的种类,如A2 ly caeus m ajor壳壁上的孔由内向外通入一覆盖在缝合线上的管。管的截面略呈三角形。此管在缝合线上,略弯曲,呈带状,长约6～7mm,管的末端是盲端,但常破碎,即使不破碎,该管仍可进行气体交换。据分析这个带状结构比通常的贝壳更具通透性。因种类不同,喇叭口的长度有差异,缝合线管内开口到口缘距离也有所不同。喇叭状的壳口可能是为了蜗牛在夏眠期间有一个较大的气室,这与无厣贝类具有的盖膜腔情况相似。由此可以推断A ly caeus和Pup ininae的一些种类缝合线管在内部的开口可能与肺呼吸孔靠得很近。 其他的一些陆生螺类,如R um ina d ecollata和C lausilia的一些种类,在夏眠期间往往胚螺层失去,然而可能也有利于呼吸。破损的一端由内脏分泌的膜封住,这比休眠时螺壳倒下,靠外套膜边缘呼吸更利于气体交换。 (BF) — 8 1 —生 物 学 通 报 2003年第38卷第2期
神经干细胞及其应用研究新进展 摘要：长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。现在，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)不仅存在于所有哺乳动物胚胎发育期的脑内，而且在其成年之后也有，这已为神经科学界所普遍接受。神经干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能，使神经系统损伤后的细胞替代治疗成为可能本文综述了神经干细胞的分布、生物学特性、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用，并对神经干细胞临床应用前景做出了展望。 关键词：神经干细胞细胞疗法多向分化潜能转分化性 1、神经干细胞的分布 大量研究表明成年哺乳动物的脑室下区、海马、纹状体、大脑皮质等区域均有NSCs存在，其中侧脑室壁的脑室下层(sub ventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(sub granular zone，SGZ)是神经干细胞的两个主要脑区。另外，研究者们还在成年哺乳动物脑内的其他部位发现了神经干细胞的存在，例如在黑质内发现了新生的多巴胺能神经元。 2、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用 2.1细胞替代治疗中外源性NSCs的使用 NSCs可以用来代替因为损伤或神经系统退行性病变而缺失的组织。理想的是重建组织适宜的结构并整合人周围组织；重要的是在这种治疗方案中，几种细胞类型需替代。在移植入成年啮齿动物脑内前，首先需从人胚胎干细胞或胎儿脑内分离出NSCs，并在体外诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。值得注意的是NSCs整合入室管下区的微环境，促成嗅球的神经发生。在海马，移植的神经祖细胞分化为特定区域的神经细胞亚型，并功能性整合入周围的环路。NSCs移植入疾病或损伤的啮齿动物模型中取得了预期的效果。移植入的存活的NSCs首先迁移到病变部位并分化。成年鼠的NSCs移植入多发性硬化大鼠模型后可观察到少突胶质细胞祖细胞、宿主和移植来源的成熟细胞数量增加，病情明显好转。在大鼠脑梗死模型中，移植的NSCs迁移到损伤部位并大部分分化为神经元。在脑出血模型中，由静脉移植的NSCs在损伤部位分化成神经元和星形胶质细胞，并引起了功能的恢复。将富有多巴胺神经元的胚胎腹侧中脑移植入去神经的帕金森鼠中，结果移植物中的多巴胺神经元修复了损害引起的功能缺损。神经干细胞植入大鼠亨廷顿病模型脑内能保护维持运动习惯的能力，受损的运动习性也可重新恢复，表明植入的细胞在体内形成了功能性连接。Mcdona等给胸髓损伤大鼠分别注入单纯培养基、成年小鼠皮层神经元和胚胎干细胞，2周后发现植入干细胞者后肢恢复部分负重与协调能力，明显优于前二者。田增明等报道了人胚胎神经干细胞治疗21例小脑萎缩患者，发现移植后临床症状有改善。 2.2脑损伤激发内源性NSCs 近年研究表明多种神经系统损伤均可激发内源性神经细胞再生。追踪巢蛋白阳性的神经祖细胞定殖在成年脊髓损伤区，可以观察到这种祖细胞扩增并在损伤区分化为神经元；在脊髓挤压伤、局灶性脑缺血中，在有正常神经发生的大脑皮质和海马可观察到NSCs的增生，并可以被外源性神经营养因子所加强。但在病理状态下这种内源性干细胞的修复反应很显然是不够的，大量实验已证实哺乳动
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
神经干细胞研究进展 [摘要]神经干细胞研究是目前医学研究的热点之一，在目前已经取得了一定的研究成果。尽管大部分研究仍处在动物模型和实验阶段，相信在不久的将来会有越来越多的成果应用于临床。本文对有关神经干细胞的特性，来源，培养与纯化，临床应用等方面作一简单介绍。[关键词] 神经干细胞 随着分子生物学的迅猛发展，人们对神经系统多种疾病的相关基因及细胞研究有了更新的认识，使神经系统疾病的治疗有了更多可能的选择。神经干细胞作为近几年来比较热门的研究课题之一，已经引起了越来越多的医护人员的关注，已经取得了一定的研究成果。本综述对近几年来有关神经干细胞的研究作一简单介绍。 1、神经干细胞的特性 干细胞是一类具有自我复制能力、多潜能分化的非特异性细胞，这种分化、复制能力贯穿于生物组织器官生长的始终。在一定条件下，它可以分化成不同形态、不同功能的细胞。神经干细胞( neuralstem cells, NSCs)是重要的干细胞类型之一，是神经系统发育过程中保留下来的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经细胞。具有很多的特性，如自我更新、多潜能分化、迁移和播散、低免疫原性、良好的组织相容性、可长期存活等[1]。 2、神经干细胞的来源 在20 世纪90 年代初, Reyonlds 等[2] 和Richards 等[3]从鼠和恒河猴以及人脑中分离出神经干细胞,从而证实了啮齿类海马齿状面的颗粒层细胞在成年后仍具有分裂能力这一推测。最近,扎桑等[4] 报道在小鼠大脑室下带(subventricular zone,SVZ)有神经上皮的残余,是产生神经干细胞最活跃的部位,产生神经元迁移到嗅球体并分化成该处的中间神经元,其他的3个脑区分别为海马的齿状面,嗅回和纹状体。其中海马的神经干细胞产生的新的神经元成齿状回的颗粒神经元。1996 年Sohonen等[5]通过细胞培养证实这些部位的细胞能够自我复制并分化成神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞等。实验结果表明,从这些部位分离出来的细胞就是神经干细胞。通过近几年的研究发现，神经干细胞的来源主要有以下几种：2.1 脐带血，其来源的间质干细胞容易采集、制备和保存，免疫原性低[6]。 2.2 胚胎，从早期胚胎分离的胚胎干细胞具有分化为神经干细胞的能力，并能够在一定条件下长期增殖或冷冻保存。一般从10 周左右的胚胎分离神经干细胞，此时的神经干细胞较多，大约占细胞总数的7%，随着胚龄的增长，神经干细胞所占的比例逐渐减少，其分离培养难度更大[7]。 2.3 脑组织，包括成人脑组织和人胚新鲜脑组织[8]，其神经干细胞存在于海马齿状回、嗅球、纹状体和室管膜下区等结构以及胼胝体、中脑水管周围等[9]。 2.4 骨骼肌[10]。 2.5 骨髓间质干细胞，是目前研究最早和最为深入的一类多能干细胞[11]。 2.6 永生化神经干细胞，是癌基因导入的神经干细胞，可无限增殖[12]。 2.7 成熟的间质细胞或星形胶质细胞，有研究认为脑缺血损伤可能刺激脑内成熟的间质细胞或星形胶质细胞返回到神经干细胞，再重新分化成受损最严重的神经
神经干细胞综述 长期以来 ,人们一直认为 ,成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力 ,一旦受损乃至死亡 ,不能再生 ,这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤的治疗受到了很大的限制。虽然传统的药物及手术取得了一定的进展 ,但是仍不能达到满意的效果。近年来 ,生物医学技术迅猛发展 ,神经生物学的重要进展之一是发现神经干细胞的存在 ,特别是成体脑内神经干细胞的分离和鉴定具有划时代意义。本文对神经干细胞的特点、分布、分化机制及应用等研究进展做一综述。 1 神经干细胞的特点 神经干细胞的特点如下:①神经干细胞可以分化。②通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在 , 同时 ,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞。干细胞可连续分裂几代 ,也可在较长时间内处于静止状态。③神经干细胞通过两种方式生长 ,一种是对称分裂 ,形成两个相同的神经干细胞 ;另一种是非对称分裂 , 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配 ,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化 细胞 ,另一个子细胞则保持亲代的特征 ,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 2 神经干细胞与其它类型干细胞的关系 按分化潜能的大小 ,干细胞基本上可分为 3种类型 :第一类是全能干细胞 ,它具有形成完整个体的分化潜能 ,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 ,可以无限增殖并分化成全身 2 0 0多种细胞组织的潜能 ,进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体 ;第二类是多能干细胞 ,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能 ,但却失去了发育成完整个体的能力 ,发育潜能受到一定的限制 ;第三类是单能干细胞 ,如神经 干细胞等 ,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。然而横向分化的发现 ,使这个观点受到了挑战 ,神经干细胞可以分化成造血细胞。总之 ,生命体通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程及组织工程等各种生物技术的快速发展 ,按照一定的目的 ,在体外人工分离、培养干细胞 ,利用干细胞构建各种细胞、组织及器官作为移植来源 ,将成为干细胞应用的主要方向。 3 神经干细胞的分布 神经管形成以前 ,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白 (nestin),是细胞的骨架蛋白。构成小鼠神经板的细胞 ,具有高效形成神经球的能力。但目前尚不能肯定神经板与神经干细胞是否具有相同的诱导机制。神经管形成后 ,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。关于成脑神经干细胞的分布 ,研究显示成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 ,这些研究表明 ,神经干细胞广泛存在于神经系统。在中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经球并产生神经元。脊髓损伤时 ,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制 ,而神经胶质细胞明显增多 ,其机制可能与生成神经元的微环境有关。
神经干细胞研究进展 一、引言 神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群[1]。狭义的神经干细胞是指成体神经干细胞，指的是分布于胚胎及成人中枢及周围神经系统的干细胞。简单的说，就是在成年哺乳动物的大脑中分离出来的具有分化潜能和自我更新能力的母细胞，它可以分化各类神经细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。我们所讲的神经干细胞指的就是成体中存在于脑中的中枢神经干细胞，其实在外周也有一些“神经干细胞”称为“神经嵴干细胞”，可以分化成外周神经细胞、神经内分泌细胞和施旺细胞，还可横向分化成色素细胞和平滑肌细胞[2]。 神经干细胞具有以下特征：（1）有增殖能力；（2）由于自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个自细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可以分化为多种神经细胞；（3）具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化为不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征[3]。 需要注意的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。神经干细胞的治疗机理是：（1）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（2）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（3）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路[4]。 二、研究现状
第31卷第4期2011年08月 国际病理科学与临床杂志http ：//w w w ．gjbl．net International Journal of Pathology and Clinical M edicine Vol．31N o．4Aug．2011 收稿日期：2011－06－29修回日期：2011－07－28 作者简介：段建辉，博士研究生，主要从事神经细胞衰老的研究。通信作者：李学军， E-mail ：xjli@bjmu．edu．cn 基金项目：国家自然科学基金（81020108031）。This w ork w as supported by N ational N atural Science Foundation of Chian （81020108031）． ·综述· 神经干细胞衰老基础与临床研究进展 段建辉，祝晓玲，李学军 综述 （北京大学医学部基础医学院药理学系，北京100191） ［摘要］ 神经干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力，广泛分布于哺乳动物胚胎脑内，在成年脑内室管膜 下区、 颗粒细胞下层及胼胝体下区等区域也有神经干细胞的聚集分布。神经干细胞在一定条件的刺激下可生成神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞，从而修复受损神经组织，对神经系统起到保护作用。神经干细胞所处微环境改变或调节增殖与分化功能的基因突变，都会引起神经干细胞衰老死亡，这将使神经干细胞无法发挥正常的神经保护与修复作用。延缓抑制神经干细胞衰老将对治疗神经退行性疾病和神经损伤起到重要作用。 ［关键词］ 神经干细胞； 衰老； 保护 doi ：10．3969/j．issn．1673-2588．2011．04．004 Advance in basic and clinical study on senescence of neural stem cells DUAN Jianhui ，ZHU Xiaoling ，LI Xuejun （Department of Pharmac olog y ，Sc hool of Basic Medic al Sc ienc e ，Peking University Health Sc ienc e Center ，Beijing 100191，China ） ［Abstract ］N eural stem cells are endow ed w ith the capacity of multipotentiality and self-rene-w ing ，and distribute ubiquitously in mammalian fetal brains．In the brains of adult mammals ，neural stem cells aggregate in particular zones ，i．e．subventricular zone ，subgranular zone ，subcallosal zone ，and etc．Under specific stimulus ，neural stem cells could differentiate into neurons ，astrocytes ，and oligodentro-cytes．In this w ay ，they can repair the damaged neural tissues．Any change in the microenvironment or mutation in gene controlled proliferation and differentiation could lead to senescence and even death of neural stem cells ，w hich in turn stop them playing normal neural protection and repair function．Thus ，slow ing dow n the senescence process of neural stem cells could be of great significance in targeting neural degenerative diseases and neural impairments． ［Key words ］neural stem cells ； senescence ； protection 近二十年，人们对哺乳动物脑再生能力的认识 有了根本转变。传统思想认为成年脑是终末分化的不可修复的组织，然而近些年研究表明，哺乳动物脑 内含有在一定条件诱导下可分化为神经元、 星形胶
细胞培养基本条件
细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基
两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临 床观察 作者：高凤兰冀雅杰李英芝 【关键词】神经干细胞移植；中枢神经系统疾病；临床观察 我科于200610～200812为13例不同原因造成的脑损害患者做了神经干细胞脑内移植术，取得初步成效，现将研究及观察结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料本组共１3例，年龄4～57岁。病种：脑瘫1例，脑出血后遗症8例，脑梗死1例，颅脑损伤后遗症3例。病程：小儿脑瘫患者4年，脑出血及颅脑外伤后遗症4～13个月。 1.2 临床表现见表1。 表1 13例患者临床表现（略） 1.3 治疗方法全部病例均采用手术方法将神经干细胞移植到侧脑室内或直接移植到病灶周围，让神经干细胞不须长途迁移，直
接在神经受损的部位进行神经的修复与重建，移植方法简便,移植物利用效率高。
1.4 移植后观察随访记录见表2。 表2 13例患者移植后观察随访记录（略） 1.5 疗效评定指标语言、肌力、智力。评定时间:1周、半个月、1个月、2个月…… 1.6 影响因素移植成功与否取决于病人的年龄、病程的长短、内环境与个体差异、移植的方法。 2 结果 语言功能改善8例，瘫痪肢体肌力不同程度提高10例，智力改善2例，病情无明显变化者２例。实践证明神经干细胞脑内移植治疗神经系统疾病有效，尤其以语言的改善最为明显，多数患者肌力、智力均有不同程度改善，病人年龄越小治疗效果越明显。 3 讨论 神经干细胞是一种具有自我更新能力，能够分化出神经元、髓鞘细胞等多种类型神经细胞的特殊细胞，被医学界誉为
“源泉细胞”,能够对中枢神经系统的损伤进行营养和修复。中枢神经系统主要是由以下两种细胞组成，即神经元和胶质细胞。神经干细胞是这两种细胞的祖先。理论上，在一定条件下，一个干细胞能够大量增殖并分化成整个大脑和脊髓的全部细胞。干细胞被国际上公认为治疗中枢神经系统损伤的非常理想的种子。 正常情况下,当神经损伤后病灶局部可产生大量的趋化因子,它能使这些神经干细胞做远程迁移,进入到神经损伤区对损伤的神经组织起替代和修复作用,而随着时间的推移这些趋化因子会逐渐减少,因此过晚做神经干细胞移植会降低治疗效果。但过早移植可能会因为神经损伤后早期会出现局部组织的变性坏死水肿不利于移植物的定植生存。因此建议脑出血、脑外伤、在伤后或术后2个月、病情基本稳定后再接受神经干细胞移植。 移植后神经干细胞的功能：（1）补充受损的神经细胞。(2)延缓或抑制进行中的神经系统损伤。（3）通过细胞替代作用更换已死亡或受损的神经细胞，修复受损的神经网络。(4)中枢神经系统损伤后，损伤周边大量的神经细胞，虽然健存，但受到损伤的影响，转入休眠状态，其功能受到抑制，移植的干细胞可分泌大量的神经营养因子，激活这些细胞，从而改善机体的神经功能。
作者：张华晏勇孟涛代政伟 【关键词】内源性神经干细胞;阿尔海茨默病 阿尔茨海默病(alzheimer′s disease，ad)的病因较多、发病机制复杂，目前尚无特效治疗方法。ad的传统治疗药物包括胆碱酯酶抑制剂、n 甲基 d 天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂、抗β 淀粉样蛋白(aβ)药物、神经生长因子、非甾体类抗炎药物等。这些药物能相对减轻ad的症状，但都不能阻止病情的进展，因而疗效有限。近年来兴起的干细胞移植治疗ad研究已显示出可喜的前景，但目前还存在关键技术突破、伦理及免疫等诸多问题〔1〕。随着神经发育学尤其是神经发生(neurogenesis)研究的深入，已揭示在成年个体中枢神经系统中存在神经干细胞(neural stem cells，nscs)等前体细胞，在个体出现疾病时这些内源性nscs 可以少量增殖、迁移、分化成相应组织细胞(如神经细胞、胶质细胞等)以修复病变组织及改善机体功能。此重要发现改变了上世纪初确立并持续了近一个世纪的“神经细胞不能再生”的理论，为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的途径〔2〕。然而这种具修复功能的nscs活化随着年龄老化而减少，因此，寻求激活内源性nscs进而促进神经发生的方法或药物，以治疗神经变性疾病特别是ad已成为研究的热点〔3〕。 1 内源性nscs的存在部位及来源 凡生物个体自身存在而非从外界导入的nscs即称为内源性nscs。成人的nscs主要存在于侧脑室下区(svz)、海马齿状回颗粒下层(sgz)、大脑皮质、第四脑室和脊髓中央管等部位〔4〕。这些部位的nscs在多种病变或某些因素刺激下被激活，在损伤原位或异位增生后，由某些趋化因子引导向损伤部位迁移和分化。此外在神经系统的某些病理状态下，成熟神经细胞逆向分化、发生细胞骨架的胚胎回复，出现胚胎神经上皮细胞特性的再表达。这类细胞可能为星型胶质细胞或少突胶质细胞的前体细胞。成体神经发生包括内源性nscs/神经祖细胞(npcs)增生、迁移、分化为成熟神经元并将其功能整合入成活的神经网络中〔5〕，神经发生仅见于svz/嗅球系统和海马齿状回两个区域〔6〕。 2 ad病理情况下的内源性nscs 在ad病理情况下，脑部可有内源性nscs增殖。jin等〔7〕研究了ad病变与nscs增殖活化之间的关系，发现在ad患者的海马组织中，与nscs增殖分化相关的蛋白标志物双皮质素、多唾液酸一神经元黏附分子和微管相关蛋白等均呈现高表达，新的神经元在ca1区增加。随后他们又发现在转基因小鼠ad模型中nscs集中的两个区域(即svz和sgz)均有nscs活化与增殖〔8〕。同时，ziabreva等〔9〕的病例对照研究发现在ad患者svz区nestin(为nscs 特异性标记物)免疫反应性细胞明显增多。另外，gan等〔10〕发现在ad转基因小鼠中aβ斑块形成早期阶段海马区npcs数轻微增加，而在aβ斑块出现及进展阶段npcs数明显增加。金国华等〔11〕以切断穹隆 海马伞制作ad模型，结果表明在术后第7天时微管相关蛋白阳性神经元较多，第14天时细胞进一步迁移及成熟;正常组第7天时仅见少量微管相关蛋白阳性神经元，第14天时细胞稍增多;对照组第7天时未见微管相关蛋白阳性神经元，第14天时仅有少量微管相关蛋白阳性神经元。而且，穹隆 海马伞切割侧的海马提取液可以明显促进nscs分化为神经元和胆碱能神经元。但rodríguez等〔12〕在ad转基因小鼠模型中发现雄性小鼠在9月龄时新的神经元生成减少73%，12月龄时没有新神经元生成。而雌性小鼠较早出现神经发生减少，在4月龄时即减少63%，在12月龄时几乎没有神经发生出现。这些研究结果提示ad本身能够一定程度诱导内源性nscs的活化，以实现机体功能的代偿恢复，同时也说明随着病程的延长及年龄的逐渐增长，内源性nscs活化逐渐减少。因此，通过外源性手段刺激内源性nscs活化成为治疗ad所必须。 3 利用内源性nscs治疗ad的优势及意义 由于内源性nscs可针对环境的变化调整增殖与分化的速度，而且这种潜力不局限于正在进行神经组织生成的区域.因此可以用各种干预因素对其加以调整和改善，以期通过综合利用