微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
乙酰二茂铁的制备及柱色谱分离 一．实验目的 1. 通过乙酰二茂铁的制备，理解Friedel-Crafts 酰基化反应原理。 2. 掌握机械搅拌等操作。 3. 掌握用柱色谱分离和提纯化合物的原理和技术。 二．实验原理 1.乙酰二茂铁的制备 二茂铁及其衍生物是一类很稳定的有机过渡金属络合物。二茂铁是橙色的固体，又名双环戊二烯基铁，是由两个环戊二烯负离子和一个二价铁离子键合而成，具有夹心型结构。二茂铁具有类似苯的一些芳香性，比苯更容易发生亲电取代反应。以乙酸酐为酰化剂，三氟化硼、氢氟酸或磷酸为催化剂，二茂铁可以发生Friedel-Crafts 酰基化反应，主要生成一元取代物及少量1,1′-二元取代物。二茂铁及其衍生物可作为火箭燃料的添加剂、汽油的抗爆剂、硅树脂和橡胶的防老剂及紫外线吸收剂等。 二茂铁的乙酰化可以形成乙酰二茂铁，根据反应条件，可以生成单乙酰二茂铁或者双乙酰二茂铁。由于二茂铁分子中存在亚铁离子，对氧化的敏感限制了它在合成中的应用，如不能够用混酸对其消化。制备乙酰二茂铁的反应式如下： 32 343+3H 3二茂铁 乙酰二茂铁 1,1′-二乙酰基二茂铁 在上述条件下，主要生成单乙酰二茂铁，双乙酰二茂铁很少，但同时有未反应的二茂铁。 2.柱色谱分离 本实验用柱色谱分离提纯产品。柱色谱分离提纯是根据二茂铁和乙酰二茂铁对硅胶吸附能力的差异而进行分离提纯。 柱层析是在层析柱中装入作为固定相的吸附剂，把试样流经固定相而被吸附，然后利用薄层层析中探索到的能分离组分的溶剂流经层析柱，试样中的各组在固定相和溶剂间重新分配，分配比大的组分先流出，分配比小的组分后流出，对于不易流出的组分可另选择合适的溶剂再进行洗脱，这样就可以达到各组分的分离提纯。 柱色谱（柱上层析）常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。? 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
真菌学实验报告 一.实验目的： 1.1了解真菌形态的基本特征。 1.2掌握丝状真菌制片方法。 1.3掌握内生真菌的分离方法 1.4掌握真菌的鉴定方法。 二.前言： 真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。 当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的
分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。 植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。 三.材料与方法： 3.1.1材料： 在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。 3.1.2.药品与试剂： 葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双
氨基酸的离子交换柱色谱分离 【原理】 本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 【操作】 1、树脂的处理 关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。 将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。 3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。 4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。 注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡，并且在调节时不要过猛，以免影响色谱行为。 5、收集：柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。 6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液，然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。 7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂，混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5～10分钟，加3m160％乙醇衡稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。 8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。 注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。 2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。 【器材】
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A 培养基的制备(已提前制备好) B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C 土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D 菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
实验十柱色谱 一．实验目的： 1. 学习柱色谱的原理及方法。 二．实验重点和难点： 1.学习柱色谱的原理及方法。 实验类型：基础性实验学时：4学时 三．实验装置和药品： 主要实验仪器：色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶 普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯 主要化学试剂：石油醚（600C—900C）丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g 菠菜色素95%乙醇 四．实验装置图： 五．实验原理： 柱色谱法是色谱方法之一。 图 1 柱色谱装置色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 (一)色谱法的基本原理： 是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同，或其它亲 和作用的性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从 而将各组分分开。 (二)色谱法的分类： 1.根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。 2.根据操作条件的不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相 色谱等类型。 (三)柱色谱原理： 柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配，属于固--液吸附层析。 图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入流经吸附柱时，即被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，形成若干色带。再用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。 1.吸附剂：常用的吸附剂有：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般 要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸 附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗，流速快分离效果不好。颗粒小，表面积大，吸附能力 就高，但流速慢，因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性 三种。 2.溶质的结构与吸附能力的关系：化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强，
微生物实验报告模板 淀粉与微生物篇一：实验十分离产淀粉酶的微生物 第十次实验分离产淀粉酶微生物 学院：生命科学学院 专业：生物科学类 年级：20XX级 姓名： 学号：1007040085 20XX年XX月XX日 实验十分离产淀粉酶的微生物 一、实验目的 1、熟悉常用微生物培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的配制方法。 2、学习各种无菌操作技术，并用此技术进行为微生物稀释分离、划线分离接种。 3、用平板划线法和稀释涂布平板发分离微生物。 4、认识为微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。 5、掌握分离产淀粉酶微生物的试验方法和步骤，了解产淀粉酶的微生物种类及形态。 二、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般
在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离产淀粉酶的微生物，应该取那些富含产淀粉酶的微生物的土样。从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一类型微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有 1、简单单细胞挑取法 2、平板分离法和稀释涂布平板法 此次实验采取的是平板分离法和稀释涂布平板法结合，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括： 1)稀释后的细胞悬液图不在平板上可以分离得单个菌株 2)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 3)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二：关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm ×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
实验一、微生物得简单染色思考题 1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么? 答:油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。油镜使用过程中要注意两点：(１）、使用后镜头得清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”(观察完毕,上悬镜筒,先用擦镜纸擦去镜头上得油,然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液)擦去残留得油,最后用擦镜纸擦去残留得二甲苯，后将镜体全部复原）。 (2)、、观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时,特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器,以免压碎玻片或损伤镜面. 2、使用油镜时,为什么必须用镜头油？ 答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间得空气时，由于空气与玻片得密度不同,使光线受到曲折,发生散射，降低了视野得照明度。若中间得介质就是一层油（其折射率与玻片得相近）,则几乎不发生折射,增加了视野得进光量，从而使物象更加清晰。3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不就是直接用高倍镜或油镜观察？ 答：低倍镜视野比较大，能瞧到得范围大，容易找到观察得目标,然后在用放大倍数高得高倍镜或油镜有目得得观察。 实验二、革兰氏染色 (１）为什么必须用培养2４ｈ以内得菌体进行革兰氏染色？ 答：24h以内得菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄得革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性 （2）要得到正确得革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步就是关键步骤?为什么? 答：应注意如下几点： 其一,选用活跃生长期菌种染色,老龄得革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性； 其二，涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性; 其三,脱色就是革兰氏染色就是否成功得关键，脱色不够造成假阳性,脱色过度造成假阴性（3）当您对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 答：当要确证未知菌得革兰氏反应时,可用已知菌进行混合涂片,使二者染色条件保持一致,如果已知菌得结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。 实验三、微生物得显微镜直接计数法 1、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点? 答:1）优点:直观、快速、操作简单。 2）缺点: 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌得计数; 需要相对高得细菌浓度； 个体小得细菌在显微镜下难以观察； 实验四、微生物大小得测定 1、在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时,其测定结果就是否相同?为什么？ 答:相同；目镜测微尺就是一块圆形玻片,其中央刻有精确等分得刻度，有把５毫米刻成为50等分或把10毫米长度刻成100等分.测量时,将其放在接目镜中得隔板上来测量经显微镜放大后得细胞物象。由于在不改变目镜与目镜测微尺，而改用不同放大倍数得物镜来测定同一细菌得大小时，物象得放大倍数与每小格目镜测微尺所代表得长度在变化比例上就是同步得，
实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。 4．保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 素而设计的。 一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保
放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现
临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。 常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比
菌种保藏的方法 菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。 一、菌种保藏基本原理 通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。 二、菌种保藏的方法 试管斜面菌种系列保存方法 1低温定期移植保藏法 将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。 2液体石蜡保藏法
取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。 3白胶塞封口保存法 选择与试管口径相符的白胶塞，用%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。 4蒸馏水保藏法 将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。 非斜面固体菌种系列保存法 1麦麸保藏法 将麦麸和水按∶1充分拌匀后，装入试管高压灭菌，经无菌检查合格后接种，适温下培养至菌丝体发育好后，将试管放入真空干燥器内，用真空泵将麦麸培养基内水分抽干，然后移入盛有硅胶的干燥器内，用凡士林密封在常温下保存，可保藏3～5年。