WESTERN-BLOT 操作步骤
（一）蛋白样品制备
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉培养液，用吸管吸取培养基弃之，或将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
4、每瓶细胞加200 μl含PMSF的裂解液（根据细胞数量），于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解可将培养瓶在振荡器上震荡，当变成粘液状态时可以停止裂解。
5、裂解完后，用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
（提前开离心机预冷） , 将离心后的上清分装转移倒0.5min [ 于4℃下12000rpm离心5min。
的离心管中放于－20℃保存。（本实验室可以省略，因裂解液能将细胞充分裂解）]
6、将离心管于95度干锅或100度沸水中加热10-15分钟，使蛋白充分变性。
7、取出离心管放于冰上冷却，使热蒸汽冷却，离心机上离心使收集水分，以免影响蛋白浓度。
8、将蛋白放于-20°C保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm
离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以
除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS 重复洗涤一次。
3、用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹
一弹以使细胞充分裂解。
4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
（二）蛋白含量的测定
方法一：用蛋白浓度测量仪进行检测，用Q水做空白对照，分别检测各管蛋白的浓度，并做好记录。上样蛋白量除以蛋白浓度即为上样的蛋白量的体积。lodding buffer 按照1:4总体积比例混匀（5Xloding的量为总加样量除以5）。Q水的量为总加样量减去加样蛋白量减去loding的量。将三者混匀后煮沸5分钟使loding变性。（10孔道加样孔的最大限度可加40ul样品。）
方法二：1融化蛋白
2稀释1:4,11ul蛋白，44ul水，分别容在一EP管里，要换枪头。
3 每个蛋白两个孔，再加两个空白孔，每孔加200ul的BCA工作液，按照A液：B液50:1的比例配置，
4每个EP管加25ul的蛋白，每个蛋白加两管，空白孔加25ul的水，37度30分钟
5酶标仪检测蛋白浓度
时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加无水酒精液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5、用小量水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）槽内用原buffer液，槽外用回收液。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。Marker加2ul即可。
（3）电泳
电泳时间一般1.5-2 h，电压为70V较好。电泳至marker开始分离时将电压调至120V继续，待蓝带接近膜板的最低绿色边缘时即可终止电泳，进行转膜。
（四）转膜
（1）转一张膜需准备1张硝酸纤维素膜，4张滤纸及2张海绵。滤纸应大于胶的边缘约1cm，切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
（2）在加有转移液（回收传递buffer液）的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、4张滤纸。硝酸纤维膜用甲醇浸泡约1分钟。
（3）将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，两张滤纸，一张硝酸纤维膜，一张电泳过得胶（位置正确），两张滤纸，一个海绵垫。膜要比胶的面积大些，用绿板来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）固定
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短
路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
（5）将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放足量冰来降温。一般用250mA恒定电流转移1-2 h（根据抗体的分子量决定转移时间）。
（五）封闭
将膜转入含5%脱脂奶粉（2g奶粉+40mlTBST液）的盒中，室温下摇床上摇动（调至80次左右）1小时，用TBST将其清洗1-2分钟摇床
（六）免疫反应
（1）将一抗用TBST或3%脱脂奶粉稀释至适当浓度（大离心管中）；从封闭液中取出膜，将其平放在离心管中(正面朝内)，使抗体与其充分接触。 4度摇床过夜或37度2小时。分别标清楚抗体的记号，以便识别。
（2）次日清晨，取出一抗孵育的转膜，放于盒中，用TBST 在室温下摇床上洗三次，每次10min
（3）准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min 。配置TBS显影ECL发光剂（按1:1配置）备用。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将膜放于暗盒中，x-光片不能曝光。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
（七）凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
过程检验作业指导书 1.目的 为了加强产品生产现场品质的管控，有效的控制和降低潜在的质量风险，确保生产过程中产品品质处于受控状态。 2.适用范围 适用本公司所有产品的从领料生产到包装完成各工序的检验。 3.检验依据 产品图纸、检验指导书、样品、装配工艺等产品资料文件。 4.检验程序 4.1.物料入场检验 1.1人员及职责 装配线设置物料专员，负责从仓库领取当天装配水炮所用物料，分配不同物料给不同工位装配人员。 1.2具体工作内容 1.2.1从仓库领取装配所需的物料。 1.2.2清点物料数量，分配物料给各个工位。 1.2.3检查物料的质量，包括规格型号、外观、一致性、性能等，检验无误后，开始组装。 2.部件组装检验 2.1自检 装配人员每装配完成第一个部件后，进行自检合格后在装配剩余部分，整批装配完成后逐个进行自我检验，全部无误后，才能流到下一工序。 如果组装的部件有一部分部件组成，则装配人员需要对上一工序的部
件进行检验，合格后方能使用。 2.2互检 装配人员在一批部件自检完成后，要求相邻工序装配人员或下一工序装配人员给做互检，互检完成后，检验人签字确认。 2.3巡检 4巡检是生产过程中，检验员对生产出的产品进行巡回检验，质检员对产品进行抽样家宴，目的是为了防止成批不合格品的发生或工艺发生异常。 检验员对个生产工序产品品质状况进行巡回检查，在巡检过程中需特别注意物料加工的工位、常换人、有新人上岗的工位以及关键工位，如有发现异常及时通知生产管理负责人进行改善。 巡检过程中同时注意操作人员是否按照《作业指导书》进行操作，如发现操纵人未按照作业指导书进行操作，应立即要求作业人员改善。检验员有权对不符合规定的操作，现场易引发质量问题和生产效率的操作，要求进行整改。 5.不合格的处理方法 5.1由自检、互检发现的由装配人员引起的不合格品，由装配人员自行返工维修，返工后的产品需要重新检验。返工返修仍然不能解决的，可以做报废处理。 5.2巡检发现不合格品，必须标识隔离单独存放，进行集中统一处理。并调查原因，改进装配流程、方法。 6.出现以下情况，检验员可以拒检 6.1 使用未按周期检定或校准的仪器、设备生产出来的产品
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
产品质量检验标准及流程 （初稿）◆目的：规格质量检验流程，保证产品出货质量；◆适用范围：与本公司合作的供应商；◆质量检验标准：1、MIL-STD-105E 一次正常抽样二级水平2、ANSI/ASQC-Z1.4 ◆允收水准：MIL-STD-105E.II.(如下图，详细的参考AQL表) 缺点AQL AC RE CRI 0 MAJ 0.65 MIN 2.5 ◆检验方式：抽检、全检；抽检：抽检箱数以货物箱数的开平方取整数；抽检数量以货物数对AQL表定；◆检验流程：1、数量：数量分为货物总箱数和单个箱的产品数（如有内箱的需检查内箱数）；清点数量的时候，须先清点货物的总箱数，与单上的数量箱数是否一致。再抽点箱子里的产品数量跟单子指定的每箱数量是否一样。如发现有误须马上指出并将检查结果记录下来；2、包装：检查货物的包装是否稳实，包装带打的是否牢固。原则上以在运输过程中不会造成对产品的损坏为考虑的首要因素。如检查发现有问题，须马上指出并将结果记录下来；3、唛头：仔细核对订单上的唛头与外箱的唛头是否一致。如发现有误须马上指出并将检查结果记录下来；4、产品质量检查，以严谨认真的态度，对产品的外观和功能以及是否会对人畜造成伤害等各方面进行检验。并将检验情况记录下来。具体的检验方法，参看下面产品检验方法；5、根据检验情况，填写检验报表。依据AQL 标准，作出合格与否的决定。◆产品检验方法■、参照客户确认的样板进行检验；A、外观■五金类外观方面需要注意以下几点：1、产品表面有否生锈、伤痕或刮花现象；2、接口吻合部份连接是否紧密；3、套接或旋转是否灵活，无阻碍；4、电镀产品，有否色差、汽泡或掉镀现象，镀层和镀色是否均匀；5、客户需印的LOGO是否清楚。有否漏字、错字、图案不全或错误现象。6、检查里面的电池是否干净，有否绝缘片。有否发莓或锈斑现象；■塑胶类外观方面需要注意以下几点：1、产品表面有否伤痕或刮花现象；2、接口吻合部份连接是否紧密；3、套接或旋转是否灵活，无阻碍；4、喷油、烤漆或电镀产品，有否汽泡或掉油、掉漆、掉镀现象，镀层和镀色是否均匀，有否色差现象；5、客户需印的LOGO是否清楚。有否色差、漏字、错字、图案不全或错误现象。6、检查里面的电池是否干净，有否绝缘片。有否发莓或锈斑现象；7、透明产品，查看透明度是否良好。有否杂质、黑点；8、产品有否披锋。披锋情况是否严重；■带子类外观方面需要注意以下几点：1、长度是否够；2、带子边缘是否整齐，无漏线、脱线或掉线现象；3、带子颜色是否有色差；4、带子的材料与样板材料是否一样；■水晶类外观方面需要注意以下几点：1、产品表现是否光滑、有否伤痕、刮伤、缺口现象；2、倒角是否均匀，倒角宽度是否在允可的范围内；3、产品的透明度是否好。产品里面是否有杂质、黑点或汽泡现象；4、内雕产品，雕刻图案是否完整清楚；■磁力扣外观方面需要注意以下几点：1、封胶是否均匀无杂质、黑点；2、印刷颜色是否有色差；3、产品线路板边缘磨合是否良好、整齐；■彩卡需要注意以下几点：1、卡纸的规格是否和样品的一样；2、彩卡的印刷颜色是否一样，有否色差；3、印刷图案和文字是否和样品一样。有否错字、漏字和印错图案，图案不全现象；■吸塑外观方面需要注意以下几点：1、吸塑规格是否和样品一样；2、吸塑表面是否干净、无杂质、无黑点；注意事项：1、印刷LOGO：抽10PCS用专业胶纸（3M600）测试印刷的LOGO，有否掉色现象。如有，3个以下为通过。3个以上要整批货返工重新印刷；2、五金件边缘是否整齐光滑，有否披锋。有否对人会造成致命伤害的可能存在，如有，AQL表里列入CRI。无论货物的数量多少，整批货需要返工；3、外观严重视为重缺陷，AQL表里列入：MAJ；B、功能■发光棒1、检验按键开关是否灵敏，按动是否灵活。2、灯光颜色是否有色差、灯光有否偏暗；3、有否缺灯或灯不亮现象；4、灯光闪动是否按订单要求的闪法；5、电池电压是否足、有否短路现象以及电池周围是否用绝缘片封套6、磁力扣产品要注意看灯光位置是否居中（如五角星）。7、线路板焊接是否牢固，使用过程中有否会掉落或松开的可能；8、对于棒类产品。要查看一端旋进的过程中会否顶到灯头以致影响功能的可能；C、生产过程中之货物检验如检验的时候，产品还没完成，正在制作过
【最新整理，下载后即可编辑】 过程检验规程 1.目的: 规定过程检验的方式、标准，确保生产过程中产品质量能够及时控 制，防止不合格产品转入下道工序。 2.范围: 适用于本公司过程加工的产品 3.职责: 工序操作工: 加工过程中自检. 过程检验员: 按本指示要求对加工过程进行首检、巡检和产品完工后的成品检. 4. 定义: 首件检验：是在生产开始时上班或换班或工序因素调整后,换人换料换活换工装调整设备等对制造的第1 件或前几件产品进行的检 验.包括操作工自检，操作工互检和检验员首件确认。 巡回检验：是指检验员在生产现场按一定的时间间隔对有关工序的产品和生产条件进行监督检验. 半成品检：是指对全部加工活动结束的半成品零件进行的检验,半成品检验的工作包括验证前面各工序的检验是否已完成,检验结 果是否符合要求即对前面所有的检验数据进行复核。 5. 运行程序： 5.1操作工首检: 5.1.1首次加工按图纸要求自检合格。 5.1.2向过程检验员报首检结果,提交样件最少2件。
5.1.3首件未经检验合格不得继续加工或作业。 5.3检验员首检： 5.3.1过程检验员对首次加工样件,按《工序检验标准》要求作首件检验。 5.3.2首件判定后,过程检验员应对首件合格件打上确认标识,以便作业参照，并保留到该批产品完工. 5.3.3首检记录：首检过程如实记录于【生产过程首检、巡检质量记录表】中. 5.4操作工自检: 5.1.6首检合格,过程加工可正式量产作业,操作工应在量产中保持一定频次 的自检 (每0.5小时一次自检),以保证质量的稳定。 5.5个别装配难度大的零件或测量难度大的零件,首检按操作工→车间管理人员→检验员,三方确认原则执行 5.6巡检： 5.6.1过程检验员应对量产过程进行巡检作业,检验频次：2小时至少巡检1 趟,每个机位产品最少抽样3-5件,检验标准参见《工序检验标 准》，根据实际情况对关键特性、重要特性、工艺上有特殊要 求对下道工序的加工装配有重大影响的和内外部质量信息反馈 中出现质量问题多的薄弱环节加强巡检频次。 5.6.2巡检中若发现不合格品应在发现当时通知工序操作工停机,复检确认 无误后开具【不合格评审单】按【不合格品控制程序】处理. 如在巡检过程中不良的改善效果不佳时,应适当调整增加巡查 的频次. 5.6.３巡检记录：检验员每2个小时在【生产过程首检、巡检质量记录 表】中如实填写记录，每日上班首检时必须把前一天已填满的 【生产过程首检、巡检质量记录表】收回。巡检员必须认真收 集、整理并装订成册，妥善保管。
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
生产过程检验规程文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
生产过程 检验规程 文件编号： 编制： 审核： 批准： xxxxxxxxxxxxxx发布 2013年10月10日发布2013年10月10日实施 1、目的 规范检验程序，阻止不良产品进入下一道工序 2、适用范围 公司生产各工序的过程检验。 3、职责 3.1质量部负责公司生产过程中的抽检、定点检验和工艺纪录执行检查，确保每道工序产品符合质量要求； 3.2生技部各车间负责按检验要求报检及质量整改。 4、检验规定、流程及要求 4.1实施生产全过程检验，检验控制的内容：外观、性能、尺寸、厚度等。 4.2生产过程中生技部要严格服从检验、并做好质量整改。 4.3质检员要严格按产品标准、规程和相关管理制度实施过程检验；
4.4产品转入下一道工序必须严格采取点交方式、且必须有质检员在点交单（生产流程卡）上签字确认，没有质检员签字不得转交下一道工序、同时下一道工序不得接收； 4.5质检员在检验完成后，要对合格品与不合格品分别做出相应的标识，放入相应的合格区和不合格区； 4.6所有检验过程质检员必须有相关记录，以利追溯。 5、抽样检查 5.1每道工序的产品加工完毕后，质检员按随机原则对本道工序完工产品进行抽样检查。 5.2经验合格后方可转入下一道工序，并做好标识工作，各工序加工完毕后，经质检员检验合格后填好检验记录及“生产流程卡”转入下一道工序。 5.3对不合格品，质检员开具不合格品处置单，进行隔离标识并通知生技部、质量部等相关部门落实处置情况。 5.4不得将未完成过程抽样检验的产品转入下一道工序，如生产急需来不及检验而转入下一道工序，需经质量部领导签字批准后，进行标识，做好记录，并留下部分产品继续检验，方可放行。 6、不合格品的处理 6.1操作员在生产过程中所生产出的不合格品要放在不合格品区的产品箱内。 6.2根据不合格品程度，对不合格品做出返工、报废、从检等处理，参照不合格品控制程序。具体执行不合格品管理控制程序的要求。 7、纠正措施 7.1产品生产过程中质量部负责对质量问题报告，生产技术部负责组织相关人员对质量问题整改，参照纠正和预防措施管理程序。
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
本程序由品质部提出并归口管理
1、目的： 规定过程检验的方式，标准，尽早发现过程中影响产品质量的系统因素，防止产品成批报废或将不合格产品转入下道工序。 2、范围： 适用于过程加工的产品。 3、职责 3.1 工序操作工：加工过程中自检。 3.2 过程检验员（IPQC）：按本指示要求对加工过程进行首检、巡检和产品完工后的成 品检。 4、定义 4.1 首检检验：是在生产开始时，上班或换班或工序因素调整后，换人换料换活换工装 调整设备等，对制造的第一件或前几件产品进行的检验，包括操作工自检，操作工互检和检验员首件确认 4.2 巡回检验：是指检验员在生产现场按一定的时间间隔对有关工序的产品和生产条件 进行监督检验 4.3 完工检验：是指对全部加工活动结束的成品零件进行的检验，成品检验工作包括验 证前面各工序的检验是否已完成，检验结果是否符合要求即对前面所有的检验数据进行复核。 5、工作程序 5.1操作工首检 5.1.1首次加工按图纸要求自检合格。 5.1.2向过程检验员（IPQC）报首检检验。 5.1.3 首件未经过程检验员（IPQC）检验合格不得继续加工或作业。 5.2检验员首检 5.2.1 过程检验员对首件产品按照对应产品检验指导书（SIP）要求进行首件检验。 5.2.2 首件判定后，过程检验员应对首件合格件打上确认标识，以便作业参照，并保留 到该批产品完工。 5.2.3 首检记录：首检过程如实记录于《生产过程首巡检记录表》中。 5.3 操作工自检 5.3.1 首检合格，过程加工可正式量产作业，操作工应在量产中保持一定频次的自检， 以保证质量的稳定。 5.4 巡检 5.4.1 过程检验员应对量产过程进行巡检作业，检验频次：2小时巡检一趟，每个机位产 品抽样3件，检验标准参见对应产品检验指导书（SIP），根据实际情况对关键特性、重要特性、工艺上由特殊要求，对下道工序的加工装配有重大影响和内外部质量信息反馈中出现质量问题多的薄弱环节加强巡检频次。 5.4.2 巡检中若发现不合格品，应在发现当时通知工序操作工停机，复检确认无误后开 具《不合格品评审单》按《不合格品控制程序》处理，如在巡检过程中不良的概述效果不佳时，应适当调整增加巡查的频次。 5.4.3 巡检记录：检验员每2个小时在《生产过程首巡检记录表》中如实填写记录，巡 检员必须认真收集，整理并装订成册，妥善保管，每周五下班前由巡检员将本周的检验记录送品质办公室存档备查。 5.4.4 巡回检验要抽检产品还需检查影响产品质量的生产因素，从人、机、料、法、环、 测几个方面去监督和控制，发现问题及时指导操作工或联络有关人员加以纠正，问题严
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
过程检验规程 1.目的: 规定过程检验的方式、标准，确保生产过程中产品质量能够及时控制，防止 不合格产品转入下道工序。 2.范围: 适用于本公司过程加工的产品 3.职责: 工序操作工: 加工过程中自检. 过程检验员: 按本指示要求对加工过程进行首检、巡检和产品完工后的成品检. 4. 定义: 首件检验：是在生产开始时上班或换班或工序因素调整后,换人换料换活换工装调整设备等对制造的第1 件或前几件产品进行的检验.包括操作工自检，操作工互检和检验员首件确认。 巡回检验：是指检验员在生产现场按一定的时间间隔对有关工序的产品和生产条件进行监督检验. 半成品检：是指对全部加工活动结束的半成品零件进行的检验,半成
品检验的工作包括验证前面各工序的检验是否已完成,检验结果是否符合要求即对前面所有的检验数据进行复核。 5. 运行程序： 5.1操作工首检: 5.1.1首次加工按图纸要求自检合格。 5.1.2向过程检验员报首检结果,提交样件最少2件。 葫芦岛国华能源装备集团有限公司 5.1.3首件未经检验合格不得继续加工或作业。 5.3检验员首检： 5.3.1过程检验员对首次加工样件,按《工序检验标准》要求作首件检验。 5.3.2首件判定后,过程检验员应对首件合格件打上确认标识,以便作业参照，并保留到该批产品完工. 5.3.3首检记录：首检过程如实记录于【生产过程首检、巡检质量记录表】中. 5.4操作工自检: 5.1.6首检合格,过程加工可正式量产作业,操作工应在量产中保持一定频次的自检(每0.5小时一次自检),以保证质量的稳定。 5.5个别装配难度大的零件或测量难度大的零件,首检按操作工→车间管理人员→检验员,三方确认原则执行 5.6巡检：
生产过程 检验规程 文件编号： 编制： 审核： 批准： xxxxxxxxxxxxxx 发布 2013年10月10日发布 2013年10月10日实施 1、目的 规范检验程序，阻止不良产品进入下一道工序 2、适用范围 公司生产各工序的过程检验。 3、职责 质量部负责公司生产过程中的抽检、定点检验和工艺纪录执行检查，确保每道工序产品符合质量要求； 生技部各车间负责按检验要求报检及质量整改。 4、检验规定、流程及要求 实施生产全过程检验，检验控制的内容：外观、性能、尺寸、厚度等。 生产过程中生技部要严格服从检验、并做好质量整改。 质检员要严格按产品标准、规程和相关管理制度实施过程检验； 产品转入下一道工序必须严格采取点交方式、且必须有质检员在点交单（生产流程卡）上签字确认，没有质检员签字不得转交下一道工序、同时下一道工序不得接收；
质检员在检验完成后，要对合格品与不合格品分别做出相应的标识，放入相应的合格区和不合格区； 所有检验过程质检员必须有相关记录，以利追溯。 5、抽样检查 每道工序的产品加工完毕后，质检员按随机原则对本道工序完工产品进行抽样检查。 经验合格后方可转入下一道工序，并做好标识工作，各工序加工完毕后，经质检员检验合格后填好检验记录及“生产流程卡”转入下一道工序。 对不合格品，质检员开具不合格品处置单，进行隔离标识并通知生技部、质量部等相关部门落实处置情况。 不得将未完成过程抽样检验的产品转入下一道工序，如生产急需来不及检验而转入下一道工序，需经质量部领导签字批准后，进行标识，做好记录，并留下部分产品继续检验，方可放行。 6、不合格品的处理 操作员在生产过程中所生产出的不合格品要放在不合格品区的产品箱内。 根据不合格品程度，对不合格品做出返工、报废、从检等处理，参照不合格品控制程序。具体执行不合格品管理控制程序的要求。 7、纠正措施 产品生产过程中质量部负责对质量问题报告，生产技术部负责组织相关人员对质量问题整改，参照纠正和预防措施管理程序。 8、参考文件 不合格品控制程序 纠正和预防措施控制程序 9、相关记录
生产过程的质量管理 一、质量管理 1、质量 2000版ISO9000标准中质量的定义是：一组固有特性满足要求的程度。各类有形产品具有各自的使用要求，也具有不同的质量特性，总体来说，应具六个方面，不同产品有不同的侧重，不可能六个方面并存。 A、性能：为满足使用目的的所规定的功能，性能可分为使用性能和外观性能。 B、寿命：指产品将能使用的期限。 C、可信性：可信性包括可用性、可靠性、维修性和保障性。 D、适应性：是指产品适应外界环境变化的能力。 E、安全性：产品在储存、流通和使用过程中不发生由于产品的质量问题而导致人身伤亡。财产损失和对环境造成污染 的特性。 F、经济性：指产品制造和使用成本。 2、质量管理： 质量管理是指在质量方面进行的指挥、控制、组织和协调的所有活动。也可做以下解释： A、质量管理是为保证和提高产品质量而对各种影响因素进行计划、组织、协调和控制等各项工作总称；首要任务是 制定质量方针、质量目标并使之贯彻执行。 B、质量管理工作是通过质量策划、质量控制、质量保证和质量改进等活动来进行。 C、为实施质量管理，需要建立质量体系。 D、质量管理必须由最高管理者领导，它的实施涉及到组织中的所有成员。 3、质量控制与质量改进 质量控制是质量管理的一部份，致力于满足质量要求。 质量改进是质量管理的一部份，致力于增强满足质量要求的能力。 二、压铸件的质量与检验方法 1、压铸件质量 压铸件包括外观质量、内在质量和使用质量。 外观质量是指铸件表面粗糙度、表面质量、尺寸公差、形位公差和质量偏差等。 内在质量是指铸件的化学成份、物理和力学性能、金相组织以及在铸件内部存在的孔洞、夹杂物和裂纹等。 使用质量是指铸件能满足各种使用要求和工作的性能，如耐磨性、耐腐蚀性、和切削性、焊接性等。 2、质量标准 质量标准有国家标准(GB)、国际标准或企业标准，我国是国际标准化组织(ISO)的主要成员之一，国际标准可以等效地视为国家标准。 铸件质量标准有精度标准、表面质量标准和功能质量标准。 3、铸件缺陷 铸件缺陷有广义与狭义之分。广义的铸件缺陷是指铸件质量特征没达到分等标准(合格品、一等品、优等品)，铸件生产厂质量管理差，产品质量得不到保证。狭义的铸件缺陷是铸件中可检测出的包括在GB 5611-85铸造名词术语标准中的全部名目。 铸件经检验后可分为合格品、返修品、废品三类。 铸件废品率P是铸件废品总量(内、外废)占合格品量W及内废量W1和外废量W2之和的百分比。 铸件缺陷率是有缺陷铸件数量与生产总量之比的百分数。缺陷率通常大于废品率。铸件缺陷数用计件表示。 4、铸件缺陷的检查方法 铸件缺陷检查普遍采用的有以下一些方法： 外观检查； 化学分析检查； 力学性能检测； 低倍检验(宏观检验)； 金相检查； 无损检查。
检验规范目录
***/GC-01-2011元件和材料进厂检验工艺
进货验证时，10个以下全检；10个以上采取抽检，抽检20%+1。当抽检发现不合格品时，应加大抽检量至50%，如果仍不合格则视为本批产品不合格。
***/GC-02-2011.生产过程检验规程 1、总则 本规程规定了本公司生产的低压成套开关设备和控制设备加工过程（半成品）的检验内容、检验方法及一般要求，通过加工过程的跟踪检验，确保产品质量符合国标的规定和要求。 2、检验内容 2.1产品钣金 按图样要求，检验零部件各部尺寸、加工精度是否满足要求。主要检验以下方面： a.展开尺寸； b.去角、冲孔尺寸及位置尺寸； c.零部件尺寸； d.表面处理（毛刺、焊接、磨光等）； e.外形尺寸。 2.2产品元器件装配、接线 a.设备内装的开关电器和元件应符合图纸及有关的国家标准，按照制造厂说明书（使用条件、飞弧距离）进 行安装，必须在成套设备内进行调整和复位的元件应是易于接近的。 b.母线和绝缘导线的尺寸和额定值应符合承载的电流和所承受的机械力。 c.导线的颜色应符合GB2681的要求。 d.指示灯、按钮的颜色应符合GB2682的要求。 e.布线 1)布线应整齐、美观、压接牢固、线号清晰且元器件之间的导线不应有中间接头或焊接点，线束需缠套 有不自燃的软管。 2)绝缘导线不应支靠在不同电位的裸带电部件和带尖角的边缘上，应用适当的方法固定线束。 3)过门的导线，应使门的移动不会对导线产生任何机械损伤，线束的受弯半径大于10倍的线束外径。 4)电气间隙配电箱≥6mm、动力箱产品≥10mm、低压配电柜≥20mm； 爬电距离配电箱≥8mm、动力箱产品≥12.5mm、低压配电柜≥20mm 5)验证成套设备的裸露导电部件和保护电路之间是有效连接，接地连接电阻不大于0.1Ω 6)无功功率补偿装置其他要求： a.操作器件的运动方向应符合GB4205之规定要求要求； b．装置中所选用的电器元件及辅件的额定电压、额定电流、使用寿命、接通和分断能力、短路强度 及安装方式等方面应适合指定用途及本身相关标准，并按照制造厂的说明书进行安装； c．所有电器元件及辅件应按照其制造厂的说明书（使用条件、需要的飞弧距离、拆卸灭弧栅需要的空间等）进行安装； d．电器元件及辅件的安装应便于接线，维修和更换，需要在装置内部操作调整和复位的元件应易于操
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
XXXXX公司作业文件 检验作业指导书 1 主题内容与适用范围 本指导书规定了服装生产用面料、里料和辅料的进货质量检验、生产过程中的工序质量检验、产品完工质量检验和成衣出厂质量检验、外协产品的质量检验的内容和方法以及外检的项目。本规定适用于服装生产过程中的所有质量检验工作。 2 目的对产品的特性进行监视和测量，以验证产品的质量要求已得到满足。 3 规范性引用文件 3. 1 GB / T2660—1999 衬衫 3. 2 GB / T2666—2001 男、女西裤 3. 3 GB / T13661—1992 一般防护服 3. 4 GB/12014---2009 防静电工作服 3. 5 GB/8965---2009 阻燃工作服 3. 6 FZ / T80004—1998 服装成品出厂检验规则 3. 7 FZ / T81008—2004 茄克衫 4 职责 4. 1 技术质量部负责本检验规程的制定。 4. 2 技术质量部负责组织服装生产全过程的质量检验工作，负责本检验规程的贯彻实施。 4. 3 质量检验员负责按本检验作业指导书的规定实施产品的质量检验工作。 5 检验的方法和内容 5．1 进货质量检验 5．1．1 采购物资按对服装产品质量影响程度的分类 A类：指构成服装产品的主要部分和关键部分，直接影响服装的外观质量和使用性能，有可能导致顾客严重投诉的采购产品。如面料、特殊服装的里料、有纺粘合衬、缝纫线、拉链、绣花、印花等。 B类：指构成服装产品的其它部分，一般不会影响服装的使用效果，即使略有影响，也可以采取补救措施的采购产品。如一般里料、钮扣、四合扣、无纺粘合衬、口袋布、垫肩、松紧、商标等。 C类：指不直接用于服装产品本身，但又起到服装保护作用的采购产品。如包装纸箱、塑
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。