三棱黄酮抗HeLa 宫颈癌：降低分裂期
细胞比率诱导细胞凋亡
孙 杰，王 芍，郭 斌，尉亚辉*
(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西 西安 710069)
摘 要：目的：研究三棱的总黄酮(Rhizoma sparganii flavonoids ，RSF)对HeLa 宫颈癌细胞的毒理作用及其作用机制。方法：分别检测用含有质量浓度11.7～750μg/mL RSF 的DMEM 培养基培养时，组间HeLa 细胞的增殖活性差异，通过免疫荧光技术、流式细胞术和核型分析方法分析RSF 诱导HeLa 细胞毒理的机制。结果：RSF 含量高于188μg/mL 的DMEM 培养基可呈剂量性抑制HeLa 细胞的增殖活性(P ＜0.01)、增加细胞凋亡小体的比率(P ＜0.01)；与1%甲醇对照组相比，RSF-375(RSF 含量为375μg/mL)与RSF-750(RSF 含量为750μg/mL)药物组HeLa 细胞的分裂(M)期细胞比率显著下降(P ＜0.01)，细胞间的接触生长状态消失，体积增大；在本次实验中，RSF-375与RSF-750药物组HeLa 细胞微管(a-tublin)细胞骨架形态的特异性免疫结果与对照组相比，细胞形态呈显著不规则状改变，微丝突触增多，表现为较高的迁移运动趋势。结论：RS F 是三棱抗HeLa 宫颈癌的有效成分，在本实验中，RSF 可以通过干扰细胞有丝分裂相关的机制显著抑制HeLa 细胞的增殖活性(P ＜0.01)并诱导细胞凋亡(P ＜0.01)。关键词：三棱；黄酮；H e L a 细胞；宫颈癌
Suppressive Effect of Rhizoma sparganii Flavonoids on HeLa Cells (I): Induce M Stage Arrest and Cell Apoptosis
SUN Jie ，WANG Shao ，GUO Bin ，WEI Ya-hui*
(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, College of Life Science,
Northwest University, Xi ’an 710069, China)
Abstract ：Objective: To explore the toxicity effect and mechanisms of Rhizoma sparganii flavonoids (RSF) on HeLa cells.Methods: The effect of RSF at a concentration range of 11.7 to 750μg/mL on the proliferation of HeLa cells was evaluated. The toxic mechanisms were elucidated by immunofluorescence, flow cytometry and karyotype analysis. Results: RSF at a concen-tration higher than 188μg/mL could significantly (P < 0.01) inhibit the proliferation of HeLa cells in a dose-dependent manner,and increase the proportion of apoptotic bodies (P < 0.01). Compared with the control group, the RSF treatment groups at doses of 375μg/mL (RSF-375) and 750μg/mL (RSF-750) revealed a significant decrease of HeLa cells number at M stage (P ＜0.01), disappearance of intracellular interaction and an increase of cell volume. In addition, RSF-375 and RSF-750 also showed irregular morphological changes, an increase of synaptics and higher moving trend of microfilament, which were observed in monitoring the specific immnuofluorescence of microtubule protein. Conclusion: RSF is a group of bioactive components against HeLa cervical cancer cells, with the physiological functions of significantly inhibiting proliferation and inducing apoptosis by interfering the mitosis of HeLa cells.
Key words ：Rhizoma sparganii ；flavonoids ；HeLa cell ；cervical cancer
中图分类号：TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)01-0210-05
收稿日期：2010-05-26
基金项目：国家自然科学基金项目(31000144)；陕西省教育厅专项(09JK746)； “十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD06B00)
作者简介：孙杰(1981—)，女，博士研究生，研究方向为中药、天然药物化学。E-mail ：y ssjmm@126.co m *通信作者：尉亚辉(1960—)，男，教授，研究方向为中药生物工程。E-mail ：weiyahui@https://www.doczj.com/doc/7a6677595.html,
植物黄酮是重要的保健食品资源，富含黄酮的蜂胶、山楂、大豆、绿茶、葡萄、玫瑰、藏红花、
姜黄、仙灵脾、艾蒿等药食同源性植物已被普遍用于抗氧化、降低胆固醇、改善血液循环、抗衰老、降
血糖、消炎、维护心脑血管健康的研究[1-6]。已有研究结果证实，以异黄酮为主的多数天然植物黄酮类物质具有类雌激素作用，可以用于美容养颜、维护心脑血管健康、改善妇女绝经后综合症、预防绝经妇女因雌激素缺乏而导致的骨质疏松，以及治疗白血病、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等疾病[7-10]。
然而，天然的植物黄酮种类繁多且功效差异悬殊。实验及临床研究已经证实“雌激素-受体”复合物可以与特定的DNA序列相结合，正向调控细胞周期蛋白表达，对多种重大疾病尤其恶性肿瘤疾病的发展具有显著的促进作用[11]，部分植物黄酮体外实验时可以起到与雌激素相似的刺激乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用[12]，长期服用包括大豆异黄酮等在内的多种雌激素结构类似物，可以增加绝经后妇女卵巢癌的发病风险[13-15]。因此，国内外都曾对富含黄酮的天然植物资源及其黄酮药理进行深入的筛选研究和开发[16-17]，以期为合理安全的食用植物黄酮提供指导和帮助。
目前已见报道的具有生物活性的植物黄酮主要来源于豆科、姜科、蔷薇科、菊科、梅亚科等药食同源性植物[1-6,9]，鸭跖草亚纲中的香蒲科、禾本科、灯心草科、黑三棱科植物均见富含黄酮的实验研究报道，其中黑三棱科植物在我国分布较广，资源丰富，富含黄酮与苯丙素类成分，其总黄酮在动物实验时表现为明显的镇痛、抗肝纤维化、抗血小板聚集及抗血栓作用，具有开发价值[18-20]。此外，有药理研究报道三棱丸(SLW)提取物在体外实验时有效降低了子宫内膜异位症大鼠异位膜的微血管密度、抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的mRNA表达，SLW给药大鼠后制备的含药血清可以明显降低内异症子宫内膜细胞中的雌二醇与VEGF蛋白水平[21-22]。灌胃三棱、莪术可以抑制大鼠VEGF的表达进而减少皮下海绵移植模型中新生肉芽的血管新生，而含有三棱、莪术提取物的血清则可抑制VEGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞增殖[23-24]。由于VEGF 与性激素水平是肿瘤血管生成的重要诱导因素[25-26]，因此已有的研究结果提示，RSF在恶性肿瘤的预防方面可能具有潜在的食疗价值。
黑三棱(Sparganium stoloniferum Buch. Ham.)植物削去外皮的干燥块茎也是我国治疗瘀血经闭、癓瘕痞块和食积胀痛的传统草药[27]。“癓瘕痞块”是中国传统医学对妇女下腹部伴有胀、痛、出血症状肿瘤病症的统称，属现代医学妇科炎症、子宫肌瘤、卵巢囊肿、附件肿瘤及癌症的疾病范畴。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，其发病机理不明，转移速度极快且无有效的治疗药物。目前三棱的总黄酮对宫颈癌的药理活性尚不明确，因此本实验对三棱黄酮(RSF)的抗HeLa宫颈癌疗效进行验证，通过研究RSF对人宫颈癌HeLa细胞的体外增殖活性、细胞凋亡率、细胞周期以及细胞形态学的影响，确定RSF抗HeLa宫颈癌的细胞毒理作用，并进一步分析其抗癌的细胞毒理机制。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
三棱饮片(1kg)购自西安怡康医药连锁超市，质量标准符合《药品经营质量管理规范》。
小鼠制备的单克隆anti-a-tubulin一抗抗体、DAPI 染液(避光保存于－40℃) 美国Sigma公司；荧光标记的羊抗小鼠IgG二抗抗体 Jackson Immuno Research公司；0.1mg/mL的Texas-red-鬼笔环肽西安润德生物技术有限公司；噻唑蓝(MTT)储备液与碘化丙啶(PI)染液保存于4℃。
反向色谱柱Hypersil BDS-C18(4.6mm×200mm，5μm)；Waters 2695 Separations Module高效液相色谱仪；Waters 2414 Refractive Index Detector 检测器；Empower Pro色谱工作站；AXIMA CFR Plus- MALDI-TOF-MS 色谱仪；Axio Oberver Z1-倒置荧光显微镜 Carl Zeiss 公司；u Qu e n t-酶标仪B IO-TEK仪器有限公司；EPICS@XL-流式细胞仪 Beckman Coulter公司。
1.2三棱总黄酮的提取和鉴定
三棱饮片(1kg)使用水提制备为浸膏后，乙酸乙酯萃取除去脂溶性杂质及非极性黄酮苷元，过100目聚酰胺柱，合并甲醇洗脱液于60℃ 0.7Pa浓缩得到三棱的总黄酮RSF(得率3.75%)，本实验所得RSF经过盐酸-镁粉、AlCl3与NaOH黄酮类定性反应证明呈查耳酮阳性，HPLC 指纹图谱共识别13个色谱峰，基质辅助激光解吸电离质谱法分析可识别4个为138.05、231.30、398.46、613.81的主要成分特征相对分子质量，所得黄酮提取物在－40℃保存。
1.3免疫荧光法分析细胞骨架
将处于对数生长期的HeLa细胞继代培养48h后，以预冷的甲醇于－20℃固定过夜，使用相同1:1000工作浓度的单克隆一抗抗体anti-a-tubulin于4℃孵育过夜；1:200工作浓度的羊抗小鼠二抗抗体37℃孵育1h；5μg/mL的鬼笔环肽室温复染30min；1μg/mL的DAPI荧光核染料复染10min；于倒置荧光显微镜下观察组间细胞的形态学差异。
1.4MTT法测定细胞生长曲线
将处于对数生长期(4×103个/mL)的HeLa细胞接种于96孔板，待24h细胞贴壁后换液为RSF含量分别为11.7、23.4、46.8、93.8、188、375、750μg/mL的DMEM培养基(甲醇体积分数小于1%)共培养5d；每隔24h 取样一次(n=6)检测细胞增殖活性，移除平行孔中的RSF
含药培养基后换液为含有100μL 5mg/mL 噻唑蓝的新鲜DMEM 培养基避光反应4h ；加入100μL 10% SDS 充分裂解过夜，使用酶标仪于570nm/630nm 双波长法检测样品的OD 值。含有1%甲醇的DMEM 培养基作为对照。1.5
流式细胞术检测细胞周期
分别使用RSF(11.7～750μg/mL)药物组及含1%甲醇的DMEM(对照组)培养HeLa 细胞48h ，以0.25%胰酶消化并收集细胞；5m L PB S 溶液洗涤去除样品培养基，1000r/min 离心收集细胞并迅速注入预冷的70%乙醇中吹打均匀，－20℃固定24h ；1000r/min 收集固定细胞，PBS 洗涤去除乙醇后加入终质量浓度50μg/mL 的RNA 酶37℃孵育30min 后将样品管插入冰浴；冷却后每个样品加入50μL 的0.5mg/mL PI 染液避光冰浴染色30min ；流式细胞仪检测PI 含量，随机计数10000个细胞，使用FlowJo 5.7.2.程序进行细胞凋亡分析。1.6
统计学处理
MTT 法所得处理组HeLa 细胞每24h 时间点的样品
O D 值取“x ±s ”，与对照组进行组间t 检验(双侧)比较；细胞凋亡检测使用FlowJo 5.7.2.程序统计凋亡率(x ±s )进行t 假设检验(双侧)。2结果与分析2.1
细胞增殖活性
48～120h 期间的细胞增殖活性极显著低于对照组(P ＜0.01)；RSF 质量浓度为375μg/mL 及RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组在5d 内对HeLa 细胞增殖活性的抑制作用与对照组相比差异均极显著(P ＜0.01)，RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组在培养72h 后可以完全诱导HeLa 细胞凋亡(图1)。2.2
细胞凋亡
MTT 法细胞增殖活性的实验结果证实，RSF 质量浓度为375μg/mL 与RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组在本次实验中可以极显著(n =6，P ＜0.01)抑制所培养HeLa 细胞的增殖活性，且抑制作用持续120h 以上，因此，本实验收集培养48h 时的RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组HeLa 细胞，使用流式细胞计数法(n ＞10000)进行细胞凋亡检测并统计凋亡小体比率(n =6)，含有1%甲醇的DMEM 培养基组作为对照组。
本次实验结果显示，培养48h 时的RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组HeLa 细胞与1%甲醇对照组相比，凋亡小体比率与培养基中所含的RSF 质量浓度呈剂量正相关性提高。RSF 质量浓度为375μg/mL 与RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组在培养48h 时诱导HeLa 细胞凋亡的作用与对照组相比有显著性差异(P ＜0.01)，可提高HeLa 细胞的凋亡小体比率至对照组的3～4倍以上。此外，RSF 实验组HeLa 细胞的平均FS 值及SS 值与对照组相比也随培养基中所含RSF 浓度的提高而显著升高，该结果证实在R SF 作用下，R SF 质量浓度为375μg/mL 与RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组HeLa 细胞(n ＞10000)的平均细胞体积增大且细胞内容物分布不均(表1)。
组别凋亡率/%前向散射值 FS
侧向散射值 SS
对照组 2.08 ± 0.59315.12161.5RSF(375μg/mL)7.75 ± 0.68**328.41180.6RSF(750μg/mL)
8.43 ± 0.74**
362.11
191.8
注：**.与对照组相比，有显著性差异(P ＜0.01)。
表1 RSF 质量浓度为375、750μg/mL 培养48h 时显著诱导
HeLa 细胞凋亡(n =6)
Table 1 Significantly induced apoptosis of HeLa cells from groups
RSF-375 and RSF-750 after 48 h of culture (n =6)在本实验中，对照组(1%甲醇)HeLa 细胞培养0～96h 时的对数生长状态良好，96～120h 时细胞生长达到平台期，RSF(11.7～93.8μg/mL)药物组的HeLa 细胞与对照组相比未见明显的组间细胞增殖活性差异(P ＞0.05)；RSF 质量浓度分别为188、375、750μg/mL 药物组在本实验过程中，5d 内呈剂量性抑制所培养HeLa 细胞的增殖活性；RSF 质量浓度为188μg/mL 药物组HeLa 细胞在培养24h 时的增殖活性显著低于对照组(P ＜0.05)，而
培养细胞每24 h 取样一次，MTT 法570nm/630nm 双波长检测细胞增殖活性；*.与对照组相比，有显著性差异(P ＜0.05)；**.与对照组相比，有极显著性差异(P ＜0.01)。
图1 梯度质量浓度RSF 含药培养基对HeLa 细胞增殖活性的影响
(n =6)
Fig.1 Effect of different doses of RSF on the proliferation of HeLa
cells (n =6)
0.80.70.60.50.40.30.20.10.0RSF 750μg/mL RSF 375μg/mL RSF 188μg/mL RSF 93.8μg/mL RSF 46.8μg/mL RSF 23.4μg/mL RSF 11.7μg/mL 对照
O D
时间/h
24
48
7296
120
***************************** 2.3
细胞骨架形态
进一步对培养48h 时，凋亡及细胞增殖活性受抑制显著的RSF 质量浓度为375μg/mL 与RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组的H eLa 细胞进行了微管蛋白(anti-a-tublin)，微丝蛋白(鬼笔环肽)和染色体(DAPI)标记，倒置荧光显微镜下观察组间细胞骨架形态差异。结果显示，培养48h 时的对照组(1%甲醇)HeLa 细胞的生长状态良好，细胞呈圆润、致密且接触生长形态(图2 A ，对照组)；RSF 质量浓度为375、750μg/mL
在本实验结果中，RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组HeLa 细胞的a-tublin 微管骨架形态与1%甲醇对照组相比，呈显著的放射状延伸改变(图2B)。组间HeLa 细胞的微丝骨架形态较a-tublin 微管骨架形态受RSF 影响显著，RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组在培养
48 h 时的HeLa 细胞微丝骨架与对照组相比呈现明显的不均匀分布状态；RSF 质量浓度为375μg/mL 药物组HeLa 细胞的微丝骨架接触生长现象消失，微丝皱缩减少(图2C ，375μg/mL 组)，RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组细胞形态呈显著不规则改变，微丝显著皱缩但突触增多，表现为较强的细胞迁移运动状态(图2D)。2.4
DNA 含量分析细胞周期
本次实验通过流式细胞术检测PI 含量，对培养48h 的1%甲醇对照组、RSF 质量浓度为375μg/mL 药物组的HeLa 细胞进行DNA 含量检测。实验结果显示，RSF 质量浓度为750μg/mL 药物组与对照组相比，所培养HeLa 细胞的G 1期百分比升高而G 2期百分比下降，但在本次实验中48h 时对HeLa 细胞周期的阻滞作用，组间差异不显著(图3)。
A.细胞经anti-a-tublin(FITC)免疫荧光显色，鬼笔环肽(Texas-red)孵育30min ，DAPI 复染10min ，放大×200(微尺：20μm)；
B.细胞的a-tublin 微管骨架形态；
C.细胞的微丝骨架形态，箭头(白)所示为部分细胞的微管骨架正常而微丝生长异常情况；
D.细胞的普通光学显微图片，箭头(黑)所示为细胞的接触生长状态消失且微丝突触增多。图2 RSF 质量浓度分别为375、750μg/mL 作用下HeLa 细胞的
微丝与微管骨架形态变化
Fig.2 Immunofluorescence and ordinary light micrographs of microfilament and microtubule skeleton in HeLa cells from groups
RSF-375 and RSF-750 after 48 h of culture
C D
750μg /m L
375μg /m L 对照
→
→
→
→
→
→
A
B
750μg /m L
375μg /m L
对照
药物组HeLa 细胞与对照组相比，细胞间接触减弱、细胞体积增大且形态发生明显不规则改变(图2A)，该实验结果与流式细胞术检测细胞凋亡结果中RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组HeLa 细胞平均FS 值较对照组显著升高结果相符。
2.5细胞核型分析
分别对1%甲醇对照组、R SF 质量浓度为375、
750μg/mL 药物组所培养的HeLa 细胞进行DAPI 染色核型分析，统计比较组间的M 期细胞比率。实验结果显示(表2)，与对照组(1%甲醇)相比，RSF 质量浓度为
A.对照组；
B.375μg/mL 组；
C.750μg/mL 组。图3 RSF 对HeLa 细胞周期(DNA 含量)的影响
Fig.3 Effect of different doses of RSF on the cell cycle of HeLa cells
G 1S G 258.411.829.7
细胞数
DNA 含量
064128192256320384448512
C
560480400320240160800
350300250200150100500
细胞数
DNA 含量
064128192256320384448512
B
G 1S G 257.413.629.0
480
400320240160800
细胞数
DNA 含量
64128192256320384448512
A
G 1S G 256.412.431.2
3结 论
本次实验的研究结果证实，三棱的总黄酮可以呈持
续性显著的抑制人宫颈癌HeLa 细胞的增殖活性(P ＜0.01)，是三棱抗宫颈癌的有效成分。当DMEM 培养基中所含的RSF 质量浓度高于188μg/mL 时，三棱的总黄酮质量浓度与诱导的HeLa 细胞毒理作用的强度呈剂量性正相关；在培养48h 时，RSF 可呈剂量性提高实验组HeLa 细胞的凋亡小体比率，RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组的细胞凋亡率与对照组(1%甲醇)相比呈显著提高(P ＜0.01)；此外，RSF 质量浓度为375、750μg/mL 药物组培养基可诱导所培养HeLa 细胞的细胞骨架尤其微丝骨架形态异常，促进细胞的迁移运动，减弱细胞间接触并诱导细胞凋亡，其诱导的HeLa 细胞毒理及相关抗癌机制与影响细胞周期进程、阻碍细胞的有丝分裂密切相关。
参考文献：
[1]王培源, 王海萍, 李光武. 葛根黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(7): 577-579.
[2]贾长虹, 常丽新, 杨亚男, 等. 玫瑰叶黄酮提取及其对亚硝酸盐的清除作用[J]. 食品与机械, 2009, 25(5): 78-81.
[3]张海容, 武晓燕. 荧光探针法研究10种中药多糖及黄酮对DNA 的保护作用[J]. 光谱学与光谱分析, 2007, 27(2): 346-349.
[4]王婷, 张金超, 陈瑶, 等. 6种淫羊藿黄酮抗氧化和抗肿瘤活性的比较[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(8): 715-718.
[5]马慧萍, 贾正平, 陈克明, 等. 含淫羊藿总黄酮大鼠血清对成骨细胞发育的影响[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(8): 928-931.
[6]吴春, 陈林林. 菟丝子黄酮体外清除自由基活性的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2005, 17(5): 553-556.
[7]张强, 赵新淮. 黄酮和黄酮醇通过诱导PIG3表达引发人食管癌细胞凋亡[J]. 生物化学与生物物理进展, 2009, 36(2): 213-219.
[8]
张强, 赵新淮. 黄酮和黄酮醇诱导人食管癌细胞周期停滞的分子机制[J]. 生物化学与生物物理进展, 2008, 35(9): 1031-1038.
组别M 期细胞比率/%
细胞数对照组 4.5±0.610786RSF(375μg/mL) 2.2±0.4**10679RSF(750μg/mL)
2.2±0.3**
10735
表2 RSF 抑制HeLa 细胞有丝分裂(48h)
Table 2 Effect of different doses of RSF on cell mitosis of HeLa cells
注：**.与对照组相比，有显著性差异(P ＜0.01)。
[9]
GOSSNER G, CHOI M, TAN L, et al. Genistein-induced apoptosis and autophagocytosis in ovarian cancer cells[J]. Gynecologic Oncology, 2007,105: 23-30.
[10]
常徽, 糜漫天, 顾艳艳, 等. 植物黄酮抗人白血病HL-60细胞增殖的结构-效应关系[J]. 癌症, 2007, 26(12): 1309-1314.
[11]
GRUBER C J, TSCHUGGUEL W, SCHNEEBERGER C, et al. Produc-tion and actions of estrogens[J]. New Engl J Med, 2002, 346: 340-352.[12]余增丽, 张立实, 吴德生, 等. 植物雌激素对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响[J]. 营养学报, 2002, 24(4): 401-404.
[13]邹自英, 朱运龙, 王高峰, 等. 他莫昔芬促进HeLa 宫颈癌细胞系增殖[J]. 第四军医大学学报, 2003, 24(6): 540-542.
[14]UNFER V, CASINI M L, COSTABILE L, et al. Endometrial effects of long-term treatment with phytoestrogens: a randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. Fertility and Sterility, 2004, 82(1):145-148.
[15]
MCCLUGGAGE W G, SUMATHI V P, MCMANUS D T. Uterine serous carcinoma and endometrial intraepithelial carcinoma arising in endometrial polyps: report of 5 cases, including 2 associated with tamoxifen therapy[J]. Human Pathology, 2003, 34(9): 939-943.
[16]KIM I G, KANG S C, KIM K C, et al. Screening of estrogenic and antiestrogenic activities from medicinal plants[J]. Environmental Toxi-cology and Pharmacology, 2008, 25: 75-82.
[17]VELD M G R, ZAWADZKA E, RIETJENS I M C M, et al. Estrogenic-ity of food-associated estrogenic compunds in the fetuses of female transgenic mice upon oral and IP maternal exposure[J]. Reproductive Toxicology, 2009, 27: 133-139.
[18]黄新炜, 段玉峰, 韩果萍, 等. 中药三棱的研究进展[J]. 中成药, 2003,25(7): 576-578.
[19]陆兔林, 叶定江, 毛春芹, 等. 三棱总黄酮抗血小板聚集及抗血栓作用研究[J]. 中草药, 1999, 30(6): 18.
[20]邱鲁婴, 毛春芹, 陆兔林. 三棱总黄酮镇痛作用研究[J]. 时珍国医国药, 2000, 11(4): 291-292.
[21]
陈怡, 徐晓玉, 叶兰, 等. 三棱丸抑制大鼠子宫内膜异位症血管生成及VEGF, TNF-α表达的研究[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(3): 303-307.
[22]李傲, 况刚, 汪莹, 等. 加味三棱丸对人子宫内膜异位症内膜雌激素分泌及血管生成的影响[J]. 中国新药与临床杂志, 2009, 28(11): 831-836.[23]叶兰, 徐晓玉, 李荣亨, 等. 三棱、莪术对大鼠皮下移植人工海绵新生血管的影响研究[J]. 中国药房, 2008, 19(21): 1610-1611.[24]
叶兰, 徐晓玉, 李荣亨, 等. 三棱、莪术含药血清对培养的人脐静脉血管内皮细胞生长和VEGF 表达的影响[J]. 第三军医大学学报,2007, 29(2): 121-124.
[25]FERRARA N, KERBEL R S. Angiogenesis as a therapeutic target[J].Nature, 2005, 438: 967-974.
[26]
ROSKOSKI R Jr. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology,2007, 62: 179-213.
[27]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 化学工业出版社,2005: Part I-11.
375、750μg/mL 药物组均可显著降低HeLa 细胞的M 期细胞比率(P ＜0.01)。