临床血液学骨髓报告单样本 一、缺铁性贫血（IDA） 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生活跃，粒系占35.5%，红系占54.5%，粒红比值为1.54:1。 3、红系增生明显活跃，以中晚幼红增生为主，晚幼红增生尤其明显，细胞体积小，胞浆蓝染，胞浆量少，边缘不整齐，成熟红细胞中心淡染区扩大，可见嗜多色性红细胞。 4、粒系增生活跃，各阶段比值形态无异常改变。 5、淋巴系统正常，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞未见。 8巨核细胞易见，血小板成群分布，形态正常。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片：1、涂片、染色可，白细胞分布正常。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞同骨髓样改变。 3、血小板易见，三五成群分布，形态正常。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 组化染色：铁染色：内铁（一），外铁（一） 网织红计数：正常 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为缺铁性贫血。 二、再生障碍性贫血（AA） 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生减低，粒系占26.8%，红系占10%，粒红比值为2.68:1。 3、红系增生减低，幼稚红细胞形态无异常改变，成熟红细胞形态正常。 4、粒系增生减低，各阶段幼稚粒细胞形态正常。 5、淋巴系统比值相对升高，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞可见。 8巨核细胞未见，血小板分布减少，体积小。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片：1、涂片、染色可，白细胞分布减少。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞形态正常。 3、血小板分布减少，呈散在单个分布。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 组化染色：铁染色：内铁升高，外铁正常 网织红计数：减少 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为再生障碍性贫血。 三、急性髓细胞白血病部分成熟型（M2a型） 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生极度活跃，粒系占60.8%，红系占13.2%，粒红比值为4.61:1。
骨髓巨核细胞成熟障碍诊断详述 *导读：骨髓巨核细胞成熟障碍症状的临床表现和初步诊断?如何缓解和预防？ 骨髓细胞增生低下，增生重度低下; 白细胞粒细胞减少，以分叶核核、杆状核及晚幼粒细胞为主，中幼粒细胞极少; 幼红细胞红细胞减少，以中幼及晚幼红细胞较明显，成熟红细胞大小、染色、形态正常; 粒红比(正常)参考值范围，其他特征：巨核细胞数减少，淋巴细胞增多，浆细胞亦增多。周围血象全血细胞降低，淋巴细胞相对增多。 骨髓巨核细胞成熟障碍症状需要和下面的症状相互鉴别。 [成熟障碍型粒细胞缺乏症] 骨髓细胞增生低下，恢复期增生活跃。白细胞早、中幼粒细胞为主，晚幼、杆状核及分叶核粒细胞减少甚至消失。幼红细胞正常，以中晚幼红细胞为主。粒红比(正常)参考值范围，发作期可(正常)参考值范围。其他特征淋巴细胞及浆细胞相对增加周围血象白细胞数减少，分类中粒细胞明显减少，淋巴细胞相对增多。 [急性粒细胞性白血病] 骨髓细胞增生明显活跃。白细胞原粒及早幼粒细胞为主，可见丝状分裂型，细胞成熟停止，浆内可见Auer小体。幼红细胞少数晚幼细胞。粒红比(正常)参考值范围，其他特征巨核细胞减少周围血象可原粒及早幼粒细胞，白细胞计数明显增高，非白血性白血病时正常或减少。
[慢性粒细胞性白血病] 骨髓细胞增生极度活跃。白细胞极度增多，各期粒细胞均有，中幼及晚幼粒细胞以下各阶段占多数，丝状分裂易见。幼红细胞各期均有幼红细胞相对减少。粒红比(正常)参考值范围其他特征巨核细胞增多或(正常)参考值范围周围血象可见到各期粒细胞，嗜酸及嗜碱性粒细胞增多。 [急性淋巴细胞性白血病] 骨髓细胞增生明显活跃。白细胞原淋及幼淋细胞占多数，形态异常。幼红细胞减少，晚幼红细胞占多数。粒红比大致在(正常)参考值范围内。其他特征巨核细胞减少，破碎细胞极多。周围血象同骨髓。 [慢性淋巴细胞性白血病] 骨髓细胞增生极度活跃。白细胞成熟淋巴细胞为主，少数幼淋巴细胞，破碎淋巴细胞较多。幼红细胞减少，以中幼及晚幼红细胞为主。粒红比大致在(正常)参考值范围其他特征巨核细胞减少。周围血象同骨髓。 [单核细胞性白血病] 骨髓细胞增生明显活跃。白细胞原单核、幼单核、单核细胞及病理性单核细胞占0.60(60%)以上。幼红细胞减少。粒红比大致在(正常)参考值范围。其他特征巨核细胞减少。周围血象同骨髓。 [原发性血小板减少性紫癜] 骨髓细胞增生活跃。白细胞大致在(正常)参考值范围内。幼红细胞(正常)参考值范围，急性出血期增生。粒红比大致在(正常)参考值范围或减低。其他特征巨核细胞增多，原、幼及颗粒型巨核细胞增生，产生血小板的巨核细胞少见或缺乏。周围血象血小板计数减少。
临床血液学检验骨髓报告单样本 一、缺铁性贫血（IDA） 骨髓片： 1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生活跃，粒系占35.5%，红系占54.5%，粒红比值为1.54:1。 3、红系增生明显活跃，以中晚幼红增生为主，晚幼红增生尤其明显，细胞体积小，胞浆蓝 染，胞浆量少，边缘不整齐，成熟红细胞中心淡染区扩大，可见嗜多色性红细胞。 4、粒系增生活跃，各阶段比值形态无异常改变。 5、淋巴系统正常，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞未见。 8巨核细胞易见，血小板成群分布，形态正常。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片： 1、涂片、染色可，白细胞分布正常。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞同骨髓样改变。 3、血小板易见，三五成群分布，形态正常。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 组化染色：铁染色：内铁（一），外铁（一）网织红计数：正常 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为缺铁性贫血。 二、再生障碍性贫血（AA） 骨髓片： 1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生减低，粒系占26.8%，红系占10%,粒红比值为2.68:1。 3、红系增生减低，幼稚红细胞形态无异常改变，成熟红细胞形态正常。 4、粒系增生减低，各阶段幼稚粒细胞形态正常。 5、淋巴系统比值相对升高，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞可见。 8巨核细胞未见，血小板分布减少，体积小。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片： 1、涂片、染色可，白细胞分布减少。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞形态正常。 3、血小板分布减少，呈散在单个分布。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。组化染色：铁染色：内铁升高，外铁正常 网织红计数：减少 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为再生障碍性贫血。 三、急性髓细胞白血病部分成熟型（M2a型） 骨髓片： 1、取材、涂片、染色良好。
小鼠骨髓的综合性实验报告 YUNNAN NORMAL UN I VER SITY 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称： 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月曰 云南师范大学教务处编印 一（实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征，统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制； 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 6掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力
二、实验原理、实验流程或装置示意图 1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象 血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核（Micronucleus）: 染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料：小白鼠（2n=40） 2、器具: 注射器（ 1 ml ，5ml 各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品： 0.15mg/ml 秋水仙素，1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS） pH6.8。
各种动物骨髓单个核细胞分离液试剂盒 规格：200mL/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 各种动物骨髓单个核细胞分离液200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 单个核细胞分离方法 制备骨髓的单细胞悬液： 1.取一支适当的离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。 2.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。） 3.室温，500~900g，离心20~30min。（根据骨髓单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离 效果）。 4.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第 二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细 胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL 离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤7 分层示意图
8.弃上清，细胞重悬备用。 骨髓单细胞悬液的制备方法 小动物骨髓的采集： 1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。 2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。 3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 大动物骨髓的采集： 大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 常用的骨髓穿刺点： 股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处； 胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处； 肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点； 胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。
常见血液病的骨髓检查 贫血 一、定义 在一定容积的循环血液内红细胞计数、血红蛋白量以及红细胞压积均低于正常标准者称为贫血。其中以血红蛋白最为重要，成年男性低于120g/L（12.0g/dl），成年女性低于110g/L(11.0/dl)，一般可认为贫血。 根据血红蛋白降低程度的不同，临床上将贫血分为下列4级。 贫血的临床分级 二、贫血分类 贫血可以根据红细胞的形态特点或发生的原因和发病机理加以分类。 根据红细胞形态特点分类，主要是根据患者的红细胞平均体积（MCV）及红细胞血红蛋白平均浓度（MCHC）。 贫血可分为三类： （一）、大细胞性贫血 红细胞MCV＞95fI。此类贫血大多为正常色素型，如叶酸或维生素B12缺乏引起的巨幼细胞性贫血和贫血伴网织红细胞大量增多时。 （二）、正细胞正色素性贫血 红细胞MCV＝80～95fI，MCHC＝0.32～0.36(32～36%)。属此类贫血者有再生障碍性贫血，多数溶血性贫血、急性失血后贫血及慢性系统性疾病（慢性炎症、感染、尿毒症、肝病、结缔组织病、恶性肿瘤、内分泌病等）伴发的贫血等。（三）、小细胞低色素性贫血 红细胞MCV＜80fI，MCHC＜0.31(31%)。属于此类贫血者有缺铁性贫血、海洋性贫血、铁粒幼细胞性贫血等。
根据病因和发病机理的分类，贫血可分类如表
三、贫血的实验室检查 1．血常规检查有无贫血及贫血严重程度，是否伴白细胞或血小板数量的变化。据红细胞参数（MCV、MCH及MCHC）可对贫血进行红细胞形态分类，为诊断提供相关线索。 网织红细胞计数间接反映骨髓红系增生及代偿情况，网积红细胞计数，校正网织红细胞计数＝患者的红细胞压积／0.45/L×网织红细胞（％）。 外周血涂片可观察红细胞有无异形红细胞，如球形红细胞、靶形红细胞、裂殖细胞，有无红细胞大小不均，低色素和多染性红细胞，嗜硷性点彩、卡伯特氏球、豪一周氏小体等。观察白细胞、血小板数量或形态改变，有否疟原虫和异常细胞等。 2．骨髓检查 骨髓细胞涂片检查对诊断不可缺乏，反映骨髓细胞的增生程度、细胞成分、比例和形态变化。 必要时应作骨髓活检。 骨髓活检反映骨髓造血组织的结构、增生程度、细胞成分和形态变化。骨髓检查对某些贫血，白血病，骨髓坏死、骨髓纤维化或大理石变，髓外肿瘤细胞浸润等具有诊断价值。必须注意骨髓取样的局限性，骨髓检查与血常规有矛盾时，应做多部位骨髓检查。
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养 1、取骨髓，对倍稀释 2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用) 3、2000转，离心30分钟 4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液 5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板） 6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml 7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞） 8、重复两至三次 9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞 离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL— 4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮 11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。 参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。即： 1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。 2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。 3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。 4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度 10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。 5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。 6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。 7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。 8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。 9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow- derived dendritic cell, BMDC)。经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。 楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。
1. 你了解骨髓及其功能吗？ 骨髓是人体的造血组织，位于身体的许多骨骼内。成年人的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞，血小板和各种白细胞（包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等。某些淋巴细胞能制造抗体。因此，骨髓不但是造血器官，它还是重要的免疫器官。黄骨髓主要是脂肪组织，当人体贫血时，它可以转化为红骨髓。 骨髓中的造血干细胞除了不断分化成熟，随时补充人体损耗的血球外，骨髓自身有损伤（如骨折、跌打损伤）时，亦能再生。若骨髓细胞不正常，就会导致“白血病”、“再生障碍性贫血”等血液疾病。 2. 捐献骨髓会影响身体健康吗？ 捐献骨髓不会影响人的身体健康。许多人认为捐献骨髓是抽取脊髓，这完全是一种误解。骨髓移植需要的是人体内的红骨髓--造血干细胞。一个成年人的骨髓重量为3公斤，一名供髓者提供不足10克的骨髓造血干细胞就能挽救一名白血病患者的生命。因此不会减弱其免疫功能和造血能力。骨髓是再生能力很强的组织，一般健康者捐献造血干细胞后在十天左右即可补足所捐的干细胞量。 3. 健康者在多大年龄适合捐献骨髓？ 健康者年龄在18至55岁均可捐献骨髓。 4. 什么是骨髓移植？ 骨髓移植是指把骨髓中的造血干细胞从一个人体内移植到另一个人体内（一般是通过静脉输入）。确切他说，骨髓移植就是造血干细胞移植。 5什么人需要进行骨髓移植？ 人体造血系统及免疫系统的严重疾病，如白血病（俗称血癌）。淋已瘤、再生障碍性贫血、地中海贫血、重症放射病等患者，继续生存的希望就是骨髓移植。我国每年约400万名各类疾病的患者等待着骨髓移植。 6捐献多少干细胞能救活一个人？ 骨髓移植需要的是人体内的红骨髓--造血干细胞。一个成年人的骨髓重量约3公斤，一名供髓者提供10克的骨髓造血干细胞就能挽救一名白血病患者的生命。
各种动物骨髓单核细胞分离液试剂盒 规格：200ml/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 试剂A200mL 试剂D200mL 全血及组织稀释液200mL 细胞洗涤液200mL 操作步骤： 1.制备骨髓的单细胞悬液。 2.取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如细胞悬液的体积小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如细胞悬液的体积大于5ml，试剂总量与细胞悬液量相等），两种试剂的分层一定要清晰。 3.将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面） 4.室温，水平转子500~800g，离心20~30min（样本的体积越大所需的离 心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需自行摸索，离心转速最大不 超过1000g）。 5.离心后将出现明显的分层：第一层为稀释液层；第二层为白色单核细 胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。 6.小心吸取第二层乳白色细胞层和第三层试剂D层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。 7.弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。 稀释液 单核细胞层 试剂D 试剂A 红细胞层分层示意图
8.重复步骤7 9.弃上清，细胞重悬备用。 10.差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。 1)2~4h内贴壁的为单核细胞。 2)10~24h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 3)不贴壁的为淋巴细胞。 根据不同细胞的贴壁时间存在差异，以达到简单纯化单核细胞的目的。此法成本低，操作简便。如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。 骨髓单细胞悬液的制备方法 小动物骨髓的采集： 1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。 2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。 3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 大动物骨髓的采集： 大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。 常用的骨髓穿刺点： 股骨：穿刺部位在股骨内侧面，靠下端的凹面处； 胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
临床血液学骨髓报告单样本 一、缺铁性贫血(IDA) 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生活跃，粒系占35.5%，红系占54.5%，粒红比值为1.54:1。 3、红系增生明显活跃，以中晚幼红增生为主，晚幼红增生尤其明显，细胞体积小，胞浆蓝染，胞浆量少，边缘不整齐，成熟红细胞中心淡染区扩大，可见嗜多色性红细胞。 4、粒系增生活跃，各阶段比值形态无异常改变。 5、淋巴系统正常，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞未见。 8、巨核细胞易见，血小板成群分布，形态正常。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片：1、涂片、染色可，白细胞分布正常。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞同骨髓样改变。 3、血小板易见，三五成群分布，形态正常。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 组化染色：铁染色：内铁（—），外铁（—） 网织红计数：正常 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为缺铁性贫血。 二、再生障碍性贫血（AA） 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生减低，粒系占26.8%，红系占10%，粒红比值为2.68:1。 3、红系增生减低，幼稚红细胞形态无异常改变，成熟红细胞形态正常。 4、粒系增生减低，各阶段幼稚粒细胞形态正常。 5、淋巴系统比值相对升高，均为成熟淋巴。 6、单核细胞正常。 7、其他非造血细胞可见。 8、巨核细胞未见，血小板分布减少，体积小。 9、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 血片：1、涂片、染色可，白细胞分布减少。 2、白细胞分类正常，成熟红细胞形态正常。 3、血小板分布减少，呈散在单个分布。 4、未见血液寄生虫及其他异常细胞。 组化染色：铁染色：内铁升高，外铁正常 网织红计数：减少 结合骨髓象、血象、组化染色，提示为再生障碍性贫血。 三、急性髓细胞白血病部分成熟型（M2a型） 骨髓片：1、取材、涂片、染色良好。 2、骨髓有核细胞增生极度活跃，粒系占60.8%，红系占13.2%，粒红比值为4.61:1。 3、粒系极度增生，比值明显增大，以原粒增生为主，原粒38.9%，NFC86.8%，白
骨髓单核细胞移植促进大鼠急性心肌梗死后局部血管新生 发表时间：2011-09-01T16:51:28.810Z 来源：《中外健康文摘》2011年第20期供稿作者：盖玉生崔连群刘继东李锋刘尊奇 [导读] 成年近交系Wistar雄性大鼠36只，体重170g～200g。 盖玉生崔连群刘继东李锋刘尊奇（山东大学山东省立医院山东济南 250021） 【中图分类号】R542.2+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）20-0238-02 【摘要】本文通过探讨大鼠急性心肌梗死(AMI)后骨髓单核细胞（BMMNCs）移植对心功能和梗死局部血管新生的影响及其可能机制得出结论：大鼠AMI1w后BMMNCs移植可以增加梗死局部血管新生，进而改善心梗后心功能，其心功能改善及血管新生与BMMNCs的横向转化无关。 【关键词】骨髓单核细胞细胞移植心肌梗死血管新生 本试验探讨了骨髓单核细胞(BMMNCs)移植对急性心肌梗死(AMI)后心功能的影响及其机制，旨在为老年AMI患者BMMNCs移植的临床应用提供实验依据。现报告如下： 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组成年近交系Wistar雄性大鼠36只，体重170g～200g。随机分为对照组10只，AMI 1h移植组10只，AMI 1w移植组10只，剩余6只作为BMMNCs供体。 1.2 动物模型建立 3%戊巴比妥钠，腹腔麻醉，气管插管，呼吸机正压辅助呼吸，采取胸骨正中切口开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处用4-0 无损伤线结扎左冠脉前降支,造成左室前壁MI。 1.3 BMMNCs的制备与标记移植前2h，取3只大鼠，断颈处死。无菌条件下取两后肢长骨，离心获取骨髓细胞，密度梯度离心法获取BMMNCs并制成细胞悬液，DAPI （sigma）染色40min，离心去除残留DAPI，无血清L-DMEM重悬细胞、计数，调整细胞密度为 1×108/ml，转入1ml EP管中，置于冰上保存(不超过1h)直至移植。 1.4 心梗后BMMNCs移植动物模型建立后，观察1h，直视下用微量注射器将已经过DAPI标记的BMMNCs（2×107个）（AMI 1h移植组）或NS（对照组）各0.2ml，多点注射至心肌梗死区中央和边缘处心肌层，AMI 1w移植组，则在AMI1w后再次开胸，相同部位多点注射BMMNCs（2×107个，0.2ml），术后常规预防感染。 1.5 心功能检查分别于AMI前、AMI后8w超声心动图测量实验鼠的下列指标: 乳头肌水平短轴观行M型取样测量左室舒张末内径(LVEDd)，收缩末内径(LVEDs)，左室射血分数（LVEF），左室短轴缩短率（LVFS）。所有数值均测量三个连续心动周期，然后取其平均值。 1.6 组织学检查 AMI后8w处死动物，取移植区及周围组织，10%中性甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，片厚4μm。 1.6.1 移植细胞检测每块石蜡块间隔切片10张，紫外线作为激发光源，荧光显微镜下观察DAPI标记的细胞。 1.6.2 局部毛细血管密度测定切片进行HE染色，普通光学显微镜下观察心肌梗死区域，10×40倍视野下随机计数5个视野的毛细血管数目，取其平均数作为这一切片心梗区域的毛细血管数目，按照同样方法计数同一心脏标本的所有其他组织切片（共15张）的毛细血管数目，再次取平均数，作为这个心脏标本心梗区域的毛细血管数目。 1.7 统计学处理所有数据采用x-±s表示,组间两两采用t检验进行比较，检验水平为α=0.05。 2 结果 2.1 动物生存情况对照组死亡2只，AMI 1h移植组死亡2只，AMI 1w移植组死亡3只。其余动物均成活良好，直至8w后处死。 2.2 BMMNCs移植前后心功能 AMI前M超声检查结果显示，对照组、AMI 1h移植组及AMI 1w移植组各项指标均无差别（未显示数据）；术后8w，AMI 1h 移植组与对照组比较，各项超声指标无差异；AMI 1w移植组LVEDd明显低于AMI 1h移植组，而与对照组相比，无显著差异，其LVEDs则显著低于其他两组，相应其LVFS及LVEF显著高于对照组和AMI 1h 移植组。 2.3 移植细胞检测结果 AMI 8w后，在紫外线激发下，正常心肌区域、对照组梗死区域、MI 1h移植组梗死区域及MI 1w移植组梗死周边区域均可见自发荧光，在所有移植过BMMNCs的心脏标本切片中均未发现DAPI标记的细胞。 2.4 局部毛细血管密度测定对照组和AMI 1h移植组之间无统计学差异(P＞0.05)。AMI 1w移植组心肌梗死区域毛细血管数目较其他两组则明显增多(均P＜0.01)。 3 讨论 骨髓单核细胞移植可以改善大鼠急性心肌梗死后心功能，其改善心功能的机制可能与促进梗死局部血管新生有关；干细胞移植时，应注意移植时机，本实验提示急性心梗后1周进行细胞移植优于心梗后1小时干细胞移植。期待以后更大样本及更为深刻的研究。 参考文献 [1]Orlic D, Kajstura J, Chimenti S,et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium[J]. Nature,2001,410(6829):701-5. [2]张少衡,葛均波,孙爱军等.纯化人源骨髓单克隆间充质细胞移植更利于梗死心脏功能恢复[J].中国介入心脏病学杂志,2005,13(3):149-53.
常见血液病的诊断与鉴别诊断 Hb<120g/L ，女性 <110g/L ，孕妇 <100g/L Hb ：≤ 30g/L Hb ：31～60g/L Hb ：61～90g/L Hb ：<90g/L 贫血是一组症状，不是疾病名称。贫血的病因诊断非常重要。 、贫血的分类 三、缺铁性贫血的诊断与鉴别诊断 （一）诊断 ： 1、存在缺铁的病因 ：慢性贫血、需要量增加摄入不足、吸收不良 2、缺铁的临床表现：贫血、毛发、反甲、异食癖等 3、血象特点：小细胞低色素性贫血 4、骨髓象特点：铁染色（－） 、幼红细胞 5、铁代谢检查：血清铁↓、总铁结合力↑、转铁蛋白饱和度↓ <15 ％ 6、贮备铁缺乏：骨髓外铁（－） 、血清铁蛋白（ SF ） <14μ g/L 、贫血概论 贫血的标准：成人男性 贫血程度：极重度贫血 重度 中度 轻度
7、红细胞原扑啉升高 8、铁剂治疗有效 四、巨幼细胞性贫血的诊断和鉴别诊断 （一）诊断 1、病史：叶酸和VitB12 缺乏的病因 （1）摄入不足：婴幼儿、喂养不当、素食者、食品加工不当等 （2）需要量增加：婴幼儿、妊娠、甲亢、肿瘤、溶血等（3）吸收不良：内因子缺乏、胃肠疾病、手术 2、临床表现：（1）贫血（2）消化道症状及体征：口炎、舌炎、牛肉舌（3）神经系统表 现：末梢神经炎、椎体束征（少）；恶性贫血多见 3、血象特点：（1）大细胞性贫血：MCV↑（2）白细胞、血小板减少（3）中性粒细胞分 叶过多 4、骨髓特点：巨幼红、巨幼粒（幻灯122、126） 5、叶酸和VitB12 测定：降低 6、治疗观察 （二）鉴别诊断1、再障2、溶贫3、MDS 五．阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH ）（一）诊断标准：１．临床表现：夜间发作性酱油色尿；贫血 ２．实验室检查：（１）酸化血清溶血试验（Hams 试验），糖水试验，蛇毒因子溶血试验，尿潜血（或尿含铁血黄素）等试验中凡符合下列任何一项即可诊断: 1）两项以上阳性. 2）一项阳性，但须具备下列条件：①两次以上阳性，或一次阳性，但结果可靠．②有溶血的其他证据（如网织红细胞增高，血中间接胆红素增高等）．③能除外其他溶血（如球形红细胞增多症，自身免疫性溶血性贫血，G6PD 酶缺乏症，阵发性冷性血红蛋白尿等）． （２）流式细胞仪检查发现：外周血中CD59或CD 55阴性，中性粒细胞或红细胞>10%. 临床表现符合，实验室检查结果具备（１）或（２）项者皆可诊断． （二）鉴别诊断：１．其他溶血性贫血２．再障３．MDS 六．骨髓增生异常综合（ＭＤＳ） （一）诊断要点１．临床表现常以贫血为主，可伴有发热或出血，早期可无症状．２．外周血一系或多系减少．３．骨髓有核细胞常增多，髓系细胞一系或多系呈病态造血形态学表现．４．能除外巨幼贫，溶贫，中毒，病毒感染等引起的血细胞发育异常．５．其他检测：如骨髓组织切片，染色体，癌基因等．（二）分型： １．FAB 分型：难治性贫血（RA）；难治性贫血伴环状铁粒幼细胞（RARS）；难治性贫血伴有原始细胞过多（RAEB）；转化中的RAEB （RAEB-t）；慢性粒单核细胞白血病（CMML）２．WHO 分型：取消RAEB-t ，归为AML;取消CMML ，增加一个难治性血细胞减少伴有多系发育异常（RCMD ）新亚型;增加５q-综合征;MDS 不能分类亚型． 七、再生障碍性贫血的诊断和鉴别诊断 （一）诊断 1、贫血、出血、感染的症状、体征（慢性与急重症再障不同） 2、骨髓增生低下，非造血组织增多，巨核少或无 3、全血细胞减少，网织红细胞绝对值减少 4、能除外其他全血细胞减少的疾病 5、一般贫血药物治疗无效 6、再障分型：急性型：重Ⅰ、Ⅱ型慢性型：包括重Ⅱ型急、慢性再障的鉴别
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
小鼠骨髓的综合性实验报告 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称: 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月日 云南师范大学教务处编印 一( 实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制; 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义; 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序; 6、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 二、实验原理、实验流程或装置示意图
1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核(Micronucleus):染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料:小白鼠(2n=40) 2、器具:注射器(1ml，5ml各一支)、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品: 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液(3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配)，Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH6.8。 4、生物显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。四、实验方法步骤及注意事项
骨髓巨核细胞计数 1.实验原理 用瑞氏染色法，对制备好的骨髓片进行染色，低倍镜下（必要时转油镜确认）以1.5cm×3cm为单位面积，计数巨核细胞数，并加以分类。 2.标本采集： 2.1骨髓穿刺部分：一般取胸骨、棘突、髂骨前、嵴或后嵴等部分，两岁以内小儿主张用胫骨穿刺。穿刺部分不同，取材可能有明显的差异，必要时可做多部位取材，以便能得到更准确的分析数据。 2.2骨髓采集量：一般不超过0.2ml，否则易于稀释。 2.3骨髓取材满意的几项指标： 2.3.1抽取骨髓时，患者有特殊酸痛感。 2.3.2骨髓涂片应有骨髓小粒。 2.3.3显微镜下可见骨髓特有细胞成分，如巨核细胞、浆细胞、网状细胞、组织嗜碱细胞、幼稚红细胞、幼稚粒细胞等。 3.标本储存：取材后应立即推制成骨髓薄片，并尽快送检。 4.标本运输：保持干燥，室温运输。 5.标本拒收的标准：重度血稀，无骨髓特有细胞成份标本。 6.实验材料：瑞氏血细胞染色液，生产厂家：（台资）珠海贝索生物技术有限公司。 7.实验仪器： 7.1仪器名称：OLYMPUS显微镜
7.2仪器厂家：北京普利生公司骨髓细胞分析软件系统 7.3仪器型号：OLYMPUSCH30 8.操作步骤： 8.1骨髓片瑞氏染色：将制好的干燥骨髓涂片平置于染色架上，滴加瑞氏染色液A液3-5滴使其迅速盖满骨髓膜，然后加瑞氏染色B液3-5滴，轻轻摇动玻片或用洗耳球吹气使A、B染液充分混匀，染色1-2分钟（气温低或涂片较厚时可适当延长染色时间），用自来水冲去染液，待干。 8.2巨核细胞计数：将瑞氏染色干燥后的骨髓片，用低倍镜计数巨核细胞，并按原始巨核细胞、幼稚巨核细胞、颗粒型巨核细胞、产板型巨核细胞、裸核型巨核细胞分类记录，计数面积以1.5cm×3cm为一单位面积。 9.质量控制：每30份样本，抽两份样本进行室内工作人员比对分析，要求差异在10％以内。 10.临床意义： 10.1参考值：巨核细胞参考值7-35个∕1.5cm×3cm面积。分类：原始巨核细胞0，幼稚巨核细胞0-0.05，颗粒型巨核细胞0.10-0.27，产板型巨核细胞0.44-0.60，裸核型巨核细胞0.08-0.30。 10.2原始巨核细胞增多见于巨核细胞白血病（M7），幼稚型巨核细胞比例增多见于特发性血小板减少性紫癫的急性型，颗粒型巨核细胞增多比例增多见于特发性血小板减少性紫癫的慢性型。巨核细胞减少见于巨核细胞系统再生障碍及某些白血病。 11.变异的潜在来源
骨髓单个核细胞分离液试剂盒使用说明 规格：4×200mL/kit 保存：18-25℃保存，有效期2年。骨髓单个核细胞分离液试剂盒易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后置于常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 试剂盒内容： 动物骨髓单个核细胞分离液200mL 样本稀释液200mL 清洗液200mL F液200mL 一、各种动物骨髓细胞的采集方法 1.大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清。沉淀以F液重复洗涤一次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 2.大动物骨髓的采集： A．骨髓穿刺点定位 （1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处,或选胸骨上1/3部。 （2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1厘米处。 （3）肋骨：穿刺部位在第5～7肋骨各自的中点上。 （4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3厘米的髁嵴。 （5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。
B．骨髓穿刺方法 （1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。 （2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5mL F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 （3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。如穿刺的是肋骨，除压迫止血外，还需胶布封贴穿刺点，防止发生气胸。 3.人骨髓的采集： 临床方法收集骨髓细胞加入4-5mL F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/mL），备用。 二、骨髓单个核细胞分离方法 1.取一支15mL离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3mL）。 2.用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。 3.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳