中国农业科学 2011,44(20):4142-4149
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.20.002
过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热
和抗旱能力的研究
喻 旭1，牛向丽2，杨盛慧1，李欲翔1，刘亮亮1，唐 维1，刘永胜1,2
（1四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064；2重庆大学农学及生命科学研究院，重庆 400044）
摘要：【目的】利用转基因技术研究转录因子OsbZIP60的生物学功能，为培育抗逆水稻、减轻高温干旱对水稻的伤害奠定基础。【方法】构建水稻OsbZIP60的过表达载体pHB-OsbZIP60，通过根癌农杆菌介导的遗传转化法
将其导入水稻品种日本晴，通过观察转基因植株和野生型植株在胁迫条件下的表型差异，分析其生物学功能。采
用半定量PCR和荧光定量PCR检测OsbZIP60的表达模式以及其在转基因植株中的表达水平。【结果】在转基因植
株中，OsbZIP60表达量明显高于野生型日本晴植株。OsbZIP60的表达受热信号诱导，在热激条件下，转基因植株
的OsbZIP60表达量进一步升高。OsbZIP60在水稻各组织中均有表达，且在成熟植株叶片中表达量最高。转基因
植株与野生型相比具有更强的抗胁迫能力，并且离体部分失水率更低。【结论】水稻转录因子OsbZIP60在水稻热
胁迫和干旱胁迫应答中具有重要的作用，过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热和抗旱能力。
关键词：水稻；bZIP；转录因子；抗热；抗旱
Research on Heat and Drought Tolerance in Rice (Oryza sativa L.) by Overexpressing Transcription Factor OsbZIP60
YU Xu1, NIU Xiang-li2, YANG Sheng-hui1, LI Yu-xiang1, LIU Liang-liang1, TANG Wei1, LIU Yong-sheng1,2
（1College of Life Science, Sichuan University/Ministry of Education Key Laboratory for Bio-resource and Eco-environment, Chengdu 610064; 2Institute of Agricultural and Life Sciences, Chongqing University, Chongqing 400044)
Abstract:【Objective】Dissect biological function of transcription factor OsbZIP60 by transgenic technology, making preparation for developing stress tolerance rice to reduce the hazard caused by heat and drought stresses.【Method】The overexpression vector containing the full-length coding region of OsbZIP60 gene was constructed and introduced into rice cv. Nipponbare by Agrobacterium-mediated genetic transformation. The biological function of OsbZIP60 was analyzed by observing the
phenotypes of transgenic and wild type plants under stress conditions. The expression pattern of OsbZIP60 and its expression level in
transgenic line was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and real-time quantitative PCR.【Result】The expression level of
OsbZIP60 in overexpression transgenic lines is distinctly increased compared to that of WT plants. OsbZIP60 can be induced by heat,
and it’s further up-regulated in transgenic lines under stress condition. OsbZIP60 is constitutively expressed in rice and has the
highest abundance in leaves. Transgenic plants showed significant enhanced stress tolerance. Detached aerial parts of transgenic
plants also showed a slower water loss rate compared to that of WT plants.【Conclusion】Transcription factor OsbZIP60plays an
important role in response to heat and drought. Overexpression of OsbZIP60 might be utilized in genetic improvement of heat and
drought tolerance in rice.
Key words: Oryza sativa L.; bZIP; transcription factor; heat tolerance; drought tolerance
收稿日期：2011-04-08；接受日期：2011-05-13
基金项目：国家杰出青年科学基金项目（30825030）、国家转基因生物新品种培育科技重大专项课题（2009ZX08001-011B，2009ZX08009-072B）
联系方式：喻旭，Tel：134********；E-mail：yu_story@https://www.doczj.com/doc/7a11795073.html,。通信作者刘永胜，Tel：028-********；E-mail：liuyongsheng1122@https://www.doczj.com/doc/7a11795073.html,
20期喻旭等：过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究 4143
0 引言
【研究意义】随着温室效应和全球变暖，高温和干旱成为粮食作物生产的重要限制因素[1-2]。田间作物遇到的非生物胁迫，往往是多种胁迫的结合，培育抗逆作物，应该把对多重胁迫的研究作为重点[3]。bZIP （basic leucine zipper）类转录因子在植物逆境应答中具有重要的作用[4-6]。因而，水稻bZIP类转录因子生物学功能的研究，对培育抗逆水稻、降低高温和干旱对水稻的危害具有重要的意义。【前人研究进展】在热胁迫下，植物将启动热激应答反应（heat shock response），热激转录因子（heat shock transcription factors，HSFs）在热激信号传导中调节热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）的合成以及其它受热激诱导的转录。Baniwal等[7]研究发现在番茄中，热激转录因子HsfA1a、HsfA2和HsfB1构成一个热激应答反应调节体系。Li等[8]研究发现拟南芥转录因子WRKY39受到热信号诱导，在抗热方面有重要的功能。Wu等[9]研究发现过表达水稻转录因子OsWRKY11增强水稻的抗热和抗旱能力。Sakuma等[10]与Schramm等[11]研究发现转录因子DREB2A与乙烯应答元件相结合，对抗热和抗旱起重要的作用。Gao等[12]研究发现在拟南芥中，转录因子AtbZIP28与内质网膜相结合，对抗热起重要的作用。在植物中，bZIP类转录因子与种子成熟与萌发、光信号途径、花器官的形成有关,也参与胁迫和激素应答[4-6,13-17]。Thurow等[5]和Zhang等[17]研究还发现bZIP参与抵抗病原菌入侵。Xiang等[18]和Lu等[19]研究发现水稻转录因子OsbZIP23、OsbZIP72是通过ABA途径发挥抗旱功能。Nijhawan等[20]在水稻中找到了89个bZIP转录因子，发现它们在水稻幼苗非生物胁迫应答中表现出不同的表达模式。本研究中的OsbZIP60就是其中一个，于是沿用其名。【本研究切入点】目前对于水稻bZIP类转录因子的研究，主要集中在ABA激素应答和抗旱抗盐胁迫等方面,而对抗热方面的研究还比较少。【拟解决的关键问题】本研究利用反向遗传学的方法，通过根癌农杆菌介导将OsbZIP60导入水稻品种日本晴，获得阳性植株，对其进行胁迫处理，从而验证OsbZIP60的生物学功能，为培育抗逆性水稻、减轻高温干旱对水稻生产的不良影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻粳稻品种日本晴（Nipponbare）由四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室和四川农业科学院作物研究所提供。本研究于2009—2010年在四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室完成。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室保存。质粒载体pEasy-Blunt购于TRANSGEN 公司。pHB质粒由中国科学院上海植物生理研究所杨洪全老师惠赠。高保真DNA聚合酶、Taq酶、限制性内切酶、T4连接酶以及SYBR Green荧光染料购于TaKaRa公司。DEPC以及组培试剂购于Sigma公司；Trizol购于英骏公司；RNApre纯化试剂盒购于TIANGEN公司。反转录试剂盒购于ToYoBo公司；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒购于Omega公司。引物合成和测序由英骏生物技术有限公司完成。
1.2 OsbZIP60的扩增和植物表达载体的构建
按照水稻OsbZIP60（GenBank登录号AK121898，TIGR locus ID：Os07g44950）序列设计半巢式引物（表）OsbZIPF1、OsbZIPF2和OsbZIPR进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min。PCR产物回收、纯化后，与pEasy-blunt质粒载体连接，转入大肠杆菌。PCR鉴定重组克隆，并进行测序。测序结果采用DNAMAN（版本 6.0.3）软件进行分析。将测序正确的目的片段，用Hin d Ⅲ和PstⅠ进行双酶切，并插入到植物表达载体pHB的多克隆位点区域，构建植物表达载体pHB-OsbZIP60（图1）。
1.3 水稻的遗传转化及转基因植株鉴定
采用根癌农杆菌介导法对水稻进行遗传转化[21-22]，各种培养基的配方参照四川大学生命科学学院生物资
表 用于扩增OsbZIP60全长的寡核苷酸引物
Table Sequence of oligonucleotide primers used for amplification of OsbZIP60 full length sequence
引物名称
Primer
name
引物序列
Primer sequence (5′-3′)
酶切位点
Restriction
site OsbZIPF1 CGTGATCCCATCCACCTCC
OsbZIPF2 AAGCTTATCCCATCCACCTCCATCG Hin d ⅢOsbZIPR CTGCAGACATCGCACAATAAAGTCAGC PstⅠ
下划线部分为酶切位点The underlines indicate the sites of restriction enzymes
4144 中国农业科学44卷
图1 植物表达载体pHB-OsbZIP60的构建图
Fig. 1 Schematic construction of expression vector of pHB-OsbZIP60
源与生态环境教育部重点实验室水稻组织培养体系[23]。用CTAB法[24]提取转基因水稻植株叶片基因组DNA，用于阳性植株的鉴定。通过pHB载体中潮霉素抗性基因（hygromycin phosphotransferase gene，GenBank登录号：E00777）鉴定阳性植株，引物和方法参照高永峰等[23]研究。
1.4 OsbZIP60的生物信息学分析
通过SWISS MODEL网站（http://swissmodel.expasy. org/workspace/index. php?func=tools_sequencescan1）对转录因子OsbZIP60的结构域和二级结构进行分析。并通过NCBI（https://www.doczj.com/doc/7a11795073.html,/BLAST/）和EMBL-EBI（https://www.doczj.com/doc/7a11795073.html,/tools/sss/wublast/）网站对其蛋白质序列进行同源性比对。
1.5 RT-PCR分析
根据Trizol试剂操作手册提取水稻组织的总RNA，DNase处理后，取约1 μg的总RNA用于cDNA 第一链的合成。以水稻ACTIN（GenBank登录号：X16280）为内参基因[25]。半定量RT-PCR的扩增引物为ACTIN（5′-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTT AC-3′；5′-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3′）；OsbZIP60（5′-TCTAGAAACCAAGGAAAGGAGGAG AC-3′；5′-GAATTCACTACAACGGACGAAACTGG- 3′）。在实时荧光定量PCR中，用TIANGEN公司的RNApre纯化试剂盒提取总RNA，取约1 μg的总RNA 用于cDNA第一链的合成。荧光定量PCR的扩增引物为OsbZIP60（5′-CCGCAGTGGTTTAGTGAAGC-3′；5′-CCCAGAGTAGACAGGCACAATG-3′），内参ACTIN（5′-ACCTTCAACACCCCTGCTAT-3′；5′-CA CCATCACCAGAGTCCAAC-3′）。荧光定量PCR反应条件为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环。扩增后，样品在95℃保持15 s，60℃保持1 min。然后每15 s上升0.5℃进行溶解曲线分析。每样品重复3次。PCR反应在Applied Biosystems Step-One RT-PCR system上运行。
1.6 转基因植株的表型分析
挑选生长时期相近的野生型植株（WT）和3个独立的转基因株系（OX-6、OX-9和OX-10）T1幼苗进行抗热和抗旱试验。在抗热试验中，所有的植株放于同一个含水的大培养皿中，在38℃热驯3 h后，移至42/27℃（12/12 h）条件下生长2周。然后，所有植株再于27/18℃（12/12 h）条件下恢复生长1周。测量所有植株热处理前后的根长和苗长。植株的耐热性按照植株气生部分（暴露在空气中的茎和叶）中绿色存活部分的比例进行评价。计算公式为绿色存活部分的干重/气生部分总的干重*100%（n=4）。
热/旱的双重胁迫处理，1周大的幼苗在42/27℃（12/12 h）条件下供水生长2周，然后在相同温度但不供水条件下生长3 d，最后置于27/18℃（12/12 h）供水条件下恢复生长1周。植株热/旱双重胁迫抗性评估计算公式同上。
1.7 离体部分失水率测定
1周大小野生型和转基因植株幼苗在42/27℃（12/12 h）条件下预处理2周，然后截下其气生部分，于25℃放在实验台上，每40 min称重1次。最后在70℃干燥48 h后测定干重。根据给定时间间隔含水量计算公式[(FW i-DW)/(FW0-DW)]*100%，（其中，FW i 代表每个给定时间间隔的鲜重，FW0代表起始鲜重，DW代表干重），检测离体部分的失水率。试验重复3次。
2 结果
2.1 OsbZIP60蛋白质生物信息学分析
通过SWISS-MODEL网站分析，OsbZIP60蛋白由568个氨基酸组成，第113—171位氨基酸含有bZIP 结构域，二级结构为螺旋状。该结构域含有与干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）相同的DNA结合区域，在蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）中，该结构域蛋白被称为1t2kD。通过NCBI和EMBL-EBI网站对OsbZIP60进行蛋白同源性比对，得到50个以上的高同源蛋白，其中包括一些研究较多的重要蛋白，比如植物光调控因子HY5（表2）。
2.2 OsbZIP60的表达模式
20期喻旭等：过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究 4145
提取野生型日本晴的成熟植株不同组织（根、茎、叶、节间和花）以及幼苗的根和叶的总RNA，进行OsbZIP60表达水平检测（图2，图3）。结果显示，
R：根Root；S：茎Stem；L：叶Leaf；J：节间Internode；F：花Flower；YR：幼根Young root；YL：幼叶Young leaf；YF：幼花Young flower 图2 不同组织中OsbZIP60的RT-PCR分析
Fig. 2 RT-PCR analysis of OsbZIP60 in different tissues
1：27℃ 4 d；2：42℃ 4 d；3：42℃ 2 d，27℃ 2 d
图3 OsbZIP60的热诱导表达
Fig. 3 Expression of OsbZIP60 is induced by heat OsbZIP60为组成型表达，且在成熟植株的叶片中丰度最高。OsbZIP60的表达受温度的影响，热胁迫时，表达水平提高，温度降低时，表达量随之下降，表明OsbZIP60可能在水稻抵御高温伤害方面有重要功能。
2.3 转基因植株鉴定
提取转基因植株的基因组DNA，利用植物表达载体pHB携带的潮霉素标记基因（hyg）设计引物进行PCR扩增，进行阳性鉴定。结果（图4）表明，阳性植株能扩增出预期大小的560 bp的条带，而阴性对照植株不能扩增出该条带，可以初步确定这些阳性植株为目的转基因植株。
M：DL5000；P：阳性对照pHB质粒；C：阴性对照野生型日本晴植株；1—5：转基因植株
M: DL5000; P: pHB plasmid as positive control; C: WT plant as negative control; 1-5: Transgenic plants
图4 转基因植株PCR鉴定
Fig. 4 PCR analysis of the transgenic plants
2.4 转基因植株中OsbZIP60的表达水平检测
提取正常温度（27℃）条件下以及热胁迫（42℃）条件下的野生型日本晴和3个独立株系转基因水稻植株（OX-6、OX-9和OX-10）的RNA，以此为模板进行半定量RT-PCR，分析转基因植株中OsbZIP60的表达水平。结果（图5）显示，正常温度条件下，转基
A：正常温度（27℃）下OsbZIP60的表达情况；B：热胁迫（42℃）下OsbZIP60的表达情况
A: The expression levels of OsbZIP60 under normal condition (27℃); B: The expression levels of OsbZIP60 under heat stress condition (42℃)
图5 转基因植株中OsbZIP60的表达水平
Fig. 5Expression levels of OsbZIP60 in transgenic plants
4146 中国农业科学44卷
因植株中OsbZIP60的表达水平均显著提高，说明植物表达载体pHB-OsbZIP60在水稻基因组中整合成功，起到了过量表达的效果。在热胁迫条件下，转基因植株中OsbZIP60的表达量进一步上升，且表达量高于野生型。
2.5 水稻幼苗胁迫试验
选取野生型日本晴和已检测OsbZIP60表达水平的3个转基因株系水稻进行胁迫试验。在42/27℃（12/12 h）条件下处理2周并恢复生长一段时间后，3个转基因株系的生长都明显优于野生型，表现为枯萎速度较慢和绿色存活部分较多。热处理前后幼苗的根长和苗长的统计显示，在适宜温度条件28/17℃（12/12 h）下，转基因植株反而有一定的生长迟滞，表现为转基因植株的根长明显短于野生型，但在热处理后，转基因植株的根生长迅速，最终略长于野生型（图6），表明转录因子OsbZIP60在抗热胁迫方面有重要功能。挑选转基因OX-6株系植株和野生型日本晴植株在42/27℃（12/12 h）条件下热激预处理2周，然后在相同温度条件下，停止浇水3 d，进行热/旱双重胁迫试验（图7），结果显示，热/旱双重胁迫后，所有植株
A：热激处理后转基因与野生型植株的表型；B：热激后转基因与野生型植株的绿色存活部分；C：热激前后转基因与野生型植株的苗长和根长，C 代表对照，即热激前，H代表热激后
A: Phenotype of transgenic plants and WT plants after heat treatment; B: The surviving green parts (%) of transgenic plants and WT plants after heat treatment; C: The shoot and root length of transgenic plants before and after heat treatment, C means control, before heat treatment, H means after heat treatment
图6 转基因植株的热胁迫试验
Fig. 6 Heat treatment of transgenic plants
A：热/旱双重胁迫处理3 d后野生型日本晴和OX-6的表型；B：对照，热预处理2周时野生型日本晴和OX-6的表型
A: Phenotype of WT and OX-6 plants after heat/drought combined treatment for 3 days B: Control, phenotype of WT and OX-6 plants after heat pretreatment for 2 weeks
图7 转基因植株的热/旱双重胁迫试验
Fig. 7 Heat/drought combined treatment of transgenic plants
20期喻旭等：过量表达转录因子OsbZIP60对水稻抗热和抗旱能力的研究 4147
表2OsbZIP60部分代表性同源蛋白质
Table 2Part of representative homologous proteins of OsbZIP60 protein
蛋白质/位点Protein /Locus ID
氨基酸个数
No. of amino acid
同源性
Identity (%)
物种
Species
E值
E value
OsbZIP39 646
60
Oryza sativa subsp. Japonica 4.5E-82 HY5 140
48
Zea mays 6.5E-4
AtbZIP28 326 41 Arabidopsis thaliana 5.1E-33
AtbZIP17 721
41
Arabidopsis thaliana 1.0E-70
HYH 135
46
Arabidopsis thaliana 0.0048
的存活部分均比只有热胁迫时明显减少，说明双重胁迫对水稻的危害性更大。野生型日本晴植株几乎全部死亡，而转基因植株仍有较多的绿色存活部分，表明转录因子OsbZIP60在抗旱方面也有重要的功能。
2.6 离体部分失水率试验
通过对转基因植株和野生型日本晴植株气生部分（暴露在空气中的茎和叶）中绿色存活部分的检测，发现3个转基因株系均比野生型日本晴植株失水慢（图8），即转基因植株在体内水分维持方面具有一定优势。
图8 离体部分的失水率
Fig. 8 The water loss rate in detached aerial parts
3 讨论
本研究克隆了水稻OsbZIP60，并构建了该基因的过表达载体，通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将其导入水稻，并获得OsbZIP60表达量升高的转基因独立株系。OsbZIP60受热诱导调控，在水稻各个组织中均有表达，但在成熟植株叶片中丰度最高（图2和图3）。热胁迫和热/旱双重胁迫试验中，转基因水稻植株具有明显的耐热性和抗旱性（图6和图7），表明转录因子OsbZIP60在抗热和抗旱方面有重要的功能。离体部分的失水率试验进一步表明转录因子OsbZIP60在水分维持、抵抗干燥环境方面有重要作用（图8）。通过生物信息学分析，得到了一些与转录因子OsbZIP60高度同源、有重要功能的蛋白质。如：AtbZIP28被证明在抗热方面有重要的功能[12]，转录因子OsbZIP23、OsbZIP72被证明是通过ABA途径发挥抗旱功能[18-19]。本研究的结果与这些bZIP类转录因子的功能是一致的。
在拟南芥和水稻的耐热胁迫试验中，多采用42℃作为热激温度[12,25-26]，因此，本研究的胁迫试验均在42℃条件下进行。在水稻生长的正常适宜温度条件下，使用CaMV35S作为启动子的OsbZIP60过表达植株，反而表现出生长迟滞，说明正常温度下过量表达OsbZIP60是不必要、甚至反而有害的。前面的一些研究也得出了类似的结论[27]。为了消除CaMV35S启动子在适宜温度下对转基因植株造成生长缺陷，在今后的胁迫试验中应尽量使用仅在特定胁迫条件下才发挥作用的诱导性启动子。如：使用HSP101启动子，仅在热胁迫条件下表达。
在拟南芥中，一些bZIP蛋白拥有参与内质网应激反应的跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）。AtbZIP28被证明具有TMD，而且与内质网相连。当受到热胁迫时，AtbZIP28重新定位到核内，启动抗热相关基因的表达，抵御高温伤害[12]。本研究中的转录因子OsbZIP60与AtbZIP28高度同源，而且被证明具有潜在的TMD区域[28]，因此，推断OsbZIP60蛋白质也应该定位在内质网膜上，在热胁迫下进入细胞核，调控基因表达以抵御高温伤害。这将在进一步的研究中通过观察YFP融合蛋白进行验证。
4 结论
克隆了OsbZIP60，发现其在水稻中为组成型表
4148 中国农业科学44卷
达，且在成熟植株的叶片中表达量最高。OsbZIP60受到热胁迫诱导，在水稻热胁迫、干旱胁迫应答以及水稻体内水分维持方面具有重要的作用。过量表达转录因子OsbZIP60能够增强水稻的抗热性和抗旱性。
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（责任编辑李莉）
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