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远志种质资源遗传多样性ISSR分析

远志种质资源遗传多样性ISSR分析

王光志1,万德光

(成都中医药大学药学院, 成都 610075)

E-mail:kzwon@https://www.doczj.com/doc/7012883637.html,

摘要:目的:用RAPD技术分析远志Polygala tenuifolia Willd.及卵叶远志P.sibirica L.的遗传多样性。方法:用CTAB法提取基因组DNA。反应总体积25μl,内含10×PCR buffer2.5μl、dNTPs 0.2mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、引物0.2μmol/L、模板40 ng、Taq酶0.3μl。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性0.30min,Tm复性0.45min,72℃延伸2min,循环40次:72℃延伸5min。结果:5条引物扩共增出96条DNA片段,其中有84条具多态性,平均多态性扩增产物为87.5%。不同的ISSR扩增引物,扩增片段的多态性因引物而异,多态性片段为3~8条,平均每条引物能扩增4条多态性带;距离系数为17时,11个样品聚为远志Polygala tenuifolia Willd.居群和卵叶远志P.sibirica L.居群两类。结论:远志与卵叶远志具有丰富的遗传多样性,遗传聚类与其地理分布有一定的相关性。

关键词:远志,卵叶远志,遗传多样性,RAPD

中图分类号:

远志为常用中药,具有安神益智、祛痰、消肿的功效,临床上有广泛应用。历版《中国药典》均规定用远志科(Polygalaceae)植物远志P. tenuifolia willd或卵叶远志P.sibirica L.的干燥根。前者主要分布在西北、华北等地,而后者全国广布。近年来由于需求量增加和对该药材的过度采挖,导致其野生资源骤减,二者已被收入《国家重点保护野生药材物种名录》,保护级别为Ⅲ级。现在山西、陕西等地已有大面积栽培。对于野生药材变人工种植,其种质资源遗传多样性研究与遗传特性的研究成了筛选优良品种的前提,对于后期合理的人工种植有着十分重要的意义。目前在国内尚未见到远志遗传特性与遗传多样性研究的报道。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat ISSR)技术是在SSR基础上发展起来的,由Zietkiewicz 等[1] 在1994年创立的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术。ISSR结合了SSR和RAPD的优点,操作简单,检测结果方便,已在多种动植物的种质鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究方面得到应用。国内尚未见到远志属药用植物ISSR标记的研究报道。本研究通过对远志P. tenuifolia willd及卵叶远志P.sibirica L. ISSR研究分析,初步探讨远志及卵叶远志遗传多样性的程度。

1. 材料与方法

1王光志(1976~),男,博士。研究方向:中药品质与资源。电话:028-80975717。

Email: kzwon@https://www.doczj.com/doc/7012883637.html,

1.1 仪器试剂与材料

1.1.1 仪器

Ⅲ型HB-100型恒温金属浴(杭州博日科技有限公司),Sartorius超纯水系统,DYY-2

恒压电流电泳仪,DYY-Ⅲ型电泳槽(北京六一仪器厂),Heraeus台式离心机(德国),SANYO 超低温冰箱,VIPseries -86℃(日本三洋),BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶自动成像系统,Bio-Rad PCR仪, MyCyclerTM ThermalCycler(德国),Therme ElectronTM 加样器。

1.1.2 试剂

10mer随机引物(北京赛百盛基因技术有限公司),DNA Marker 15000(TakaRa),DNA Marker2000(TakaRa),Taq酶(TaKaRa)2500U,dNTPs(TaKaRa) 2.5mM,MaCl2(TaKaRa)25mM,10×Buffer(Mg2+free)(TaKaRa),CTAB(Amresco) ,PVP(Sigma),β-巯基乙醇(Sigma),琼脂糖(上海 YITO 生物仪器有限公司分发),其余为国产试剂。

1.1.3 实验材料

分别从山西、陕西、甘肃、河北、四川等地采得远志P. tenuifolia Willd 及卵叶远志P.sibirica L.,采集后立即将新鲜叶片埋入变色硅胶干燥。在实验室保存在-70℃超低温冰箱内。材料收集地点及时间见表1. 凭证标本保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。

表1. 远志及卵叶远志材料来源

编号学名采集地采集时间

远志P. tenuifolia Willd 四川茂县

PTZY 远志P. tenuifolia Willd 甘肃镇原2005.8.24

PTCH 远志P. tenuifolia Willd 陕西淳化2005.8.17

PTHY 远志P. tenuifolia Willd 陕西合阳2005.8.18

PTFY 远志P. tenuifolia Willd 山西汾阳2005.8.28

PTXT 远志P. tenuifolia Willd 河北邢台2005.9.10

PSMX 卵叶远志P.sibirica L. 四川茂县2005.9.1

PSYZ 卵叶远志P.sibirica L. 甘肃榆中2005.8.26

PSXL 卵叶远志P.sibirica L. 甘肃兴隆山2005.8.22

PSMY 卵叶远志P.sibirica L. 四川米易2004.10.17

PSJL 卵叶远志P.sibirica L. 四川九龙2005.9.15

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

用CTAB法提取远志基因组DNA:(1)取约150mg用硅胶干燥的远志叶片,置-70℃冰箱冷冻1h,取出后在研钵中快速磨成粉末,迅速将粉末转入 1.5ml离心管中,加入700μlCTAB提取液,置65℃金属浴中30min,其间不时摇动。(2)取出冷却至室温,加等体积氯仿/异戊醇(24:1),混匀后于12000g/min离心10min。(3)取上清液,重复第(2)步操作。(4)取上清,加入2/3体积的异丙醇,于-20℃放置30min,于10000/min/g离心10min,去上清。(5)用80%乙醇洗沉淀2次,风干沉淀。(6)将沉淀溶于100μl ddH2O 中,-20℃保存备用。

采用凝胶自动成像系统照相检测DNA的质量和含量,取2μl加样缓冲液(6×Buffer)与10μlDNA样品混合,在0.9%琼脂糖凝胶上以5V/cm电压条件下电泳,在紫外灯下观察电泳凝胶。用凝胶自动成像系统照相,用TotalLab软件分析凝胶图像,定量。基因组DNA 电泳图谱见图1.

图1. 远志及卵叶远志DNA电泳图谱

1~2: P. tenuifolia;3~4 :P. sibirica

1.2.2 ISSR反应体系的建立

1.2.2.1 引物退火温度的筛选

在25μL反应体系里,对10条ISSR随机引物的退火温度进行了筛选。针对每条引物的Tm值设定8个温度梯度,以扩增条带多,背景清晰的温度作为最适退火温度:退火温度的反应体系包括10×Buffer(Mg2+free) 2.5μL,MgCl2(25mM) 2.0μL, dNTP(2.5mM/L) 2.0μL,引物1.0μL,Taq酶(5U/μl) 0.3μL,模板DNA3.0μL,最后用灭菌ddH2O补充至25ul。反应程序为94℃预变性5min,94℃变性0.30min,Tm复性0.45min,72℃延伸2min,循环40次:72℃延伸5min,取出,4℃保存。从10条ISSR随机引物中筛选出5条引物作为ISSR反应引物。引物的退火温度与碱基序列见表2.。

表2. 筛选的引物退火温度

引物最适退火温度(℃)Tm(℃)引物序(5’→3’)

ISSR001 58.6 48 ACTG ACTG ACTG ACTG

ISSR 873 47.6 48 GACA GACA GACA GACA

ISSR 811 48.0 52 GA GA GA GA GA GA GA GA C

ISSR 817 43.5 50 CA CA CA CA CA CA CA CA A

ISSR 802 46.5 36 AT AT AT AT AT AT AT AT G

1.2.2.2 ISSR反应条件筛选

在特定的退火温度条件下,对影响ISSR反应的模板浓度、Mg2+浓度、引物浓度、dNTP 浓度以及Taq酶浓度进行了筛选:模板浓度共设计了0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ng五个梯度,Mg2+设计了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L五个浓度梯度,引物设计了1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L五个浓度梯度,dNTP设计了0. 05、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/L五个浓度梯度,Taq酶设计了0.1、0.3、0.5、1.0、1.5μl五个浓度梯度。最终确定ISSR-PCR的最佳反应条件为反应总体积25μl,内含10×PCR buffer2.5μl、dNTPs 0.2mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、引

物0.2μmol/L、模板40 ng、Taq酶0.3μl。反应程序同引物退火温度筛选程序。

1.2.3 远志及卵叶远志ISSR-PCR

利用筛选的引物和建立的ISSR反应条件,对不同居群的远志及卵叶远志进行ISSR-PCR 扩增,对扩增产物电泳,进行凝胶成像分析。分析多态性并聚类。

1.2.4数据处理

每个样品电泳条带按有或无记录,电泳条带存在时赋值为1。否则赋值为0。利用SPSS10.0计算材料间遗传相似系数(GS)。计算公式为:GS=2Nxy /(Nx + Ny),其中Nxy为材料x和y共有的扩增片段数目,Nx 、Ny为材料x、y中出现的扩增片段总数目。选择类间平均连锁法(Between group linkage)聚类,距离测量方法用Pearson correlation 法。得到远志及卵叶远志欧氏不相似系数平方矩阵表与亲缘关系聚类。

2. 结果分析

2.1 多态性分析

本实验用ISSR引物10条,从中筛选出5条可扩增出条带的引物用于ISSR分析。5条引物扩共增出96条DNA片段,其中有84条具多态性,平均多态性扩增产物为87.5%。不同的ISSR扩增引物,扩增片段的多态性因引物而异,多态性片段为3~8条,平均每条引物能扩增4条多态性带。从扩增产物的多态性数据表明,远志的种质资源具有相当丰富的遗传多样性。ISSR引物873 的扩增电泳图谱见图2.。

图2.引物ISSR873 ISSR-PCR扩增结果

1~6,P.tenuifolia;7~11,P.sibirica

2.2遗传关系聚类分析

由亲缘关系聚类图可知,当距离系数为17时,11个样品明显聚为两类,一类为远志Polygala tenuifolia Willd.居群,另一类为卵叶远志P.sibirica L.居群,说明ISSR标记的结果与经典形态分类学对远志及乱也远志的划分结果是一致的。在卵叶远志居群里,甘肃榆中和甘肃兴隆山卵叶远志遗传距离最小为,为0.860 ,其次是四川茂县和四川米易,为0.908,表明这两个产地的卵叶远志亲缘关系较近,同时四川九龙的又和四川茂县、米易类群聚为一类,与其他省区的明显区别开来,说明卵叶远志ISSR标记上的差别与其地理分布的不同较一致;在远志居群里,甘肃镇原和陕西淳化遗传距离最小,为0.248,其次为陕西合阳和山西临汾,为0.236。陕西合阳和山西汾临类群又与河北邢台聚为一类,与四川茂县产者距离

最远。显示了不同地理条件下丰富的遗传多样性。聚类图见图3..

图3. 远志及卵叶远志遗传距离聚类图

3.讨论

我们对远志与卵叶远志也进行了遗传多样性的RAPD分析研究,通过RAPD和ISSR结果的对比,两种方法聚类的结果有所不同。由于两种方法所用DNA均为基因组DNA,方法有差异,从而得出了相近而又不同的结果。无论哪一种方法,均能明显区分远志与卵叶远志。两种方法说明远志具有较为丰富的遗传多样性。

在远志野生资源日益减少的情况下,对远志药材遗传特性与遗传多样性评价显得十分必要,从而为远志人工种植中优良品种的选育提供科学依据。由于采样地点和样本数量有限,本研究所得结果是初步的。今后将扩大样本和样地的数目,多方法、多手段研究远志的遗传多样性,为该药材品质系统评价、优良品种的选育以及合理的人工栽培提供帮助。

参考文献

[1] Zietkiewica E. Rafalski https://www.doczj.com/doc/7012883637.html,buda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics,1994,20:176~183

Genetic diversity of Polygala tenuifolia Willd and

P. sibirica L. with ISSR-PCR

WANG Guangzhi , WAN Deguang

(Pharmacy school of Chengdu University of TCM. Chengdu 610075 China)

Abstract: Objective: To analyze genetic diversity of Polygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. with ISSR-PCR. Methods: Genome DNA was extracted with CTAB method. The ISSR-PCR reaction system was constructed with 2.5μl 10×PCR buffer, 0.2mmol/L dNTPs, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.2μmol/L primer, 40ng template and 0.3μl Taq with total reaction volume being 25μl. PCR amplifying sequences as follows: Initial denaturating for 5min at 94℃,then denaturating for 0.3min at 94℃, annealing for 0.15min and extension for 2.0min at 72℃. After 40 times cycle, keeping extension for 5min. Results : 96 polymorphism strands were detected with 5 primers, among which 84 strands were of polymorphism. Cluster analysis indicated that all samples can be clustered into two populations with distance coefficient being 17. Conclusion: Polygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. have rich genetic diversities. The genetic clustering has some relevance with geographical distribution of P. tenuifolia Willd and P. sibirica L.

Key words: Polygala tenuifolia Willd.; Polygala sibirica L. ; Genetic diversity; ISSR,PCR

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