蛋白质组学
【摘要】当今分子生物学领域内，蛋白质组已成为研究的热点。基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍蛋白质组学的科学背景及其最新发展。
【关键词】蛋白质组实验技术差异蛋白质组学应用前景
【正文】1、蛋白质组学产生的科学背景
众所周知，始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的
成就，几个物种（包括人类）的基因组序列已经或即将完成。生命科学已实质性
地跨入了后基因组时代，研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分
子整体水平对功能的研究上。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学
（functional genomics）这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规
律进行阐述_如在RNA水平上通过DNA芯片技术检测大量基因的表达模式。而第二
个标志则是蛋白质组学的兴起。
蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams
在1994首次提出，最早见诸于文献是在1995年7月的《Electrophoresis》杂志上
【1~4】。它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学旨在阐明生物
体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式
（修饰形式）、结构、功能和相互作用等_国内已有多篇综述文章介绍了蛋白质
组学的产生背景与科学意义，从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学
不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质
水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明
生命活动的基本规律。
2、概念及相关内容
蛋白质组用来描述一个细胞、组织或有机体表达的所有蛋白质，蛋白质组学
（proteomics）则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学【5】。
蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前
者主要研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达和功能，这
将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等, 目前蛋白
质组学的研究在这方面开展的最为广泛，其运用技术主要依赖双相凝胶电泳技术以及图像分析系统, 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变，这些技术可以直接测定蛋白质的含量，并有助于发现蛋白质翻译后的修饰，如糖基化和磷酸化等。
结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之间相互作用的改变可能引起人类疾病，因此蛋白质之间的相互作用在识别新的药物干预靶点方面有很大的潜力【6】。近年来，酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法，同时研究者也将此方法不断改进。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的。
3、蛋白质组是基因组研究逻辑性的发展
人类基因组研究的兴起标志着生命科学进入一个从总体、综合角度理解生命活动分子基础的新阶段.2001 年2月参与人类基因组计划的各国科学家宣布人类基因组图谱基本绘制完成，但对其调节及功能等仍远未解读. 被赋予研究其表达调节及其产物功能任务的“后基因组学”也即因运而生. 基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，蛋白质是生命活动的真正执行者. 蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分，与基因组相比，蛋白质组的组成更为复杂，功能更为活跃，更直接切近生命活动的本质，其研究的应用前景也更广泛和直接【7】。
1. 蛋白质组的组成远比基因组庞大和复杂
分子生物学发展初期的一个知名的信条是“一个基因一个蛋白质”。但后来已证实这是不确的，1个基因可以生产出多于1个蛋白质。越是较高等的细胞，这种数量上的差异越明显。据估计，在E.cOIi 1个基因可编码1.3个蛋白；在
S.cerevisiae 1个基因可编码3个蛋白；人的1个基因大约可编码10种蛋白。这是由于1个基因可经过基因内重组或在转录中经过不同的剪接翻译成不同的蛋白质，而蛋白质在合成之后又可能进行不同的翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、硫基化、酰基化、甲基化等. 人类基因组的基因可能生产出几十万个蛋白。仅从这一个角度也可以看出，即使我们对基因组全部读出，仍然不足以对全部蛋白质的种类和数量加以描述和预测，更不足以对主要由蛋白质演绎的复杂生命活动加以描述和预测了。
2. 蛋白质具有相对独立的代谢过程
由DNA编码合成的蛋白质，在其运输、装配方式、降解时间和途径等方面对编码它的DNA具有相对的独立性。例如，在细胞周期调控中cycIin B在G1晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期中期段，然后特异性地迅速降解。目前已知的所有细胞周期调控蛋白及其他许多蛋白都具有各自严格的代谢途径和“生命”周期。
3. 蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用
在很大程度上我们可以说“没有一个蛋白质是单独发挥其生物学作用的”，它需要与其他的分子相互作用才能完成其复杂的生理功能。蛋白质之间的相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应，它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络。蛋白质组学从多方位、多角度去研究蛋白质之间的相互作用和相互调控。相对来说，基因之间并不发生这种直接的相互作用。因此，只有通过对所有蛋白质的总和进行研究，即开展蛋白质组学研究，才能更加贴近地掌握生命的现象和本质，找到生命活动的规律。
4、蛋白质组学实验技术——二维聚丙烯酰胺凝胶电泳【8】
1．样品制备
样品制备是二维凝胶电泳成功的关键，直接影响到蛋白质组研究结果。其一般过程是：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原，断开蛋白质之间的连接键，提取全部蛋白质，除去非蛋白质部分。为获得最佳双向电泳分离结果，样品应当用脲素、一种非离子去垢剂、IPG缓冲液和还原剂将其变性并充分溶解。2．二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
Farrell、Klose和Scheele(1975年)分别建立了二维凝胶电泳(two- dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis，2一D PAGE)。目前在一张凝胶上能同时分离几千个甚至上万个蛋白质点。二维凝胶电泳的第一向是等电聚焦(isoelectric fo—cusing，IEF)，根据蛋白质等电点(pI)不同而将之分离。最早采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦。其中包括平衡pH梯度电泳(IS0一DALT)；非平衡pH梯度电泳(nonequilibri—UlTI pH gradients electrophoresis，NEPHGE)。后者常用于分离碱性蛋白质，pI7 l1．5，电泳展开时间相对比较短。
Biellqvist(1982年)等发明了固相化pH梯度(immobilizedpH gradients，IPG)等电聚焦。它的优点是：不产生电极漂移；pH梯度稳定，pH相差1个pH单位的商品胶条已经上市；上样量大，可达几十毫克，因此常用于蛋白质微量制备；重复性好，使不同人、不同实验室之间的实验结果能够相互比较，这是它最突出的优点。
双向凝胶电泳的第二向是sDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质分子质量不同而将之分离。一般采用垂直电泳或水平电泳，两种方法的实验结果没有明显的差别，均适用于分子质量在10～150ku蛋白质。判断双向凝胶电泳的好坏通过其图谱而获得。一张好的图谱必须低背景、少纹理、分辨率高、灵敏度高，而且图谱之间必须存在良好的重现性。为了达到上述目的，已经对双向凝胶电泳进行了改进。市售的微型2-D PAGE系统，从IPG胶条的重泡胀到考马斯亮蓝染色，整个操作9小时内完成。另外Large Scale Biology公司(Rockville，MD，美国)开发研制了每周展开100块凝胶的仪器，还有Proteome公司(Beverley，MA，美国)已经开发了一种完全自动化的仪器一Proteomatron，6张大胶(40cm~40cm)从灌制、展开、染色全部实现自动化。从商业购买预制IPG胶条、sDS一聚丙烯酰胺垂直预制胶或水平预制胶。对样品采用同位素标记，以此提高检测灵敏度。对样品采用两种不同的同位素进行标记，如125I、131I，能在两种不同实验条件下，在同一块凝胶上进行双向凝胶电泳，根据标记的同位素不同，可得到二张凝胶电泳图谱，并能观察到不同的蛋白质表达。
为了获得一张包含细胞内表达的全部蛋白质图谱，有报道采用“蛋白质组重叠群”(proteome contigs)方法。该法与高灵敏度的质谱联用能检测出低丰度蛋白质。双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图(vector map of the 2一D ge1)是专门用来研究蛋白质翻译后是否修饰的一种方法，通过此法能了解蛋白质翻译后修饰程度。
3．蛋白质点的染色
凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染色、考马斯亮蓝染色法，另外还采用以下染色试剂：丽春红S、氨基黑、印度墨、S硫脲银、胶态金、咪咪锌等。银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色，该法灵敏度为4ng，但对质谱测定有干扰，必须先脱银。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色，
该法操作方便、重现性好，同银染法一样，质谱测定时必须先脱色。
4．凝胶图像分析
凝胶图像分析首先是建立以向凝胶电泳图谱，可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等，把双向凝胶电泳后凝胶上的蛋白质点数字化。
其次是对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较。常用的软件有Amersham Pharmacia公司ImageMaster2-D、Bio-Red公司Pdquest，另外还有Tycho、Gellab、Kepler、GR42、Lips、Hermes、Elsie、Gemini和Melanie。运用软件对凝胶图谱去除纹理及背景，找出表达上差异的蛋白质点，并对其进行分析，发现有生物学意义的蛋白质。
5、差异蛋白质组研究
1. 差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的可实现性
目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术，例如双向电泳、质谱。双向电泳虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术，并在技术上已有了很大的改进，使其重复性和灵敏度大大提高，但它无法检测疏水性蛋白、极端pH的酸性蛋白和碱性蛋白以及某些低丰度蛋白，因此远不能捕获细胞内的全部蛋白质。质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而无法实现高通量的蛋白质分析【9】。此外，质谱是通过分子的飞行时间和带电荷多少来计算分子的分子质量的，因而它无法区分分子和带电荷相同的同分异构体的质量。上述这些技术的不完善都使得蛋白质组学建档式的研究在当前还难以大规模地迅速开展。
另一方面差异蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白，而重在找出有意义的差异蛋白，因而有着高得多的可实现性。双向电泳在差异蛋白质组分析中如同在“完全”蛋白质分析中一样，仍然是一项重要的技术，适用于差异蛋白质的检出。美国Ciphergen 公司研发的基质辅助激光解析离子化系统（SELDI）集分离纯化和质谱检测于一身，虽然它不具有分辨率和灵敏度方面的特别优势，但它可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测，从而提供了适合于差异蛋白质组学研究的可比较性系统。此外，一些新的方法如稳定同位素标记技术等正在迅速发展，它们使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高了，这将会有力地促进差异蛋白质组学研究的进展。
2. 差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质
一个生物体在经历生长、发育及各种生理过程，甚至病理过程中，其基因组通常是始终维持稳定不变的，也即它可能表达的全部蛋白质的总和也是不变的，而其蛋白质组的构成却在随时发生着严格而活跃的改变。实际上几乎没有任何一种细胞在任何一个时刻是表达“所有”蛋白质的。例如人类细胞大约有290 种左右分化的细胞，在每个细胞中约只有10 000 种蛋白质. 而每个细胞在它不同功能状态、细胞周期不同时相、接受不同条件因素刺激或药物作用下，其蛋白质组也会发生相应的变化。正是这种不同的蛋白质组构成了这一细胞这一时刻的特征性生命活动的基础。因此，对于这种蛋白质组的特有组成及其改变的研究，即差异蛋白质组研究，是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径.例如对细胞周期曾进行过形态的、生理的、动力学的大量观察与研究，而直到发现了CDK（它本身是蛋白质，又促进特定蛋白质的磷酸化）以及cyciin（周期蛋白）严格按照时限出现与消失，才算真正揭示了细胞周期运转的本质。毫无疑问，更多的生命现象将会在分子水平获得日益深入的解释. 而在差异蛋白质组学的推动下，这一进程会变得更加自觉和快速。
3. 差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景
一个细胞的生命活动，基本上说就是构成其相应蛋白质组的蛋白质的相互装配及相互反应的表现和结果。只要能够获得它们在蛋白质组上的差别或变化的足够信息，就能够指证这个细胞或生物体所处的状态，以及它们的状态是正常或是异常，甚至常常可能找到其异常的原因。因此，差异蛋白质组学的研究在疾病的早期诊断、病程及疗效监测、环境因素影响分析等方面的应用价值是不言而喻的。例如目前对疾病特别是肿瘤的早期标志蛋白分子（biomarker）的筛选已在世界范围内形成热潮。以这类标志分子（主要是蛋白质）为依据的分子诊断技术将形成未来临床诊断的主流，而这又会有力地促进网络辅助医疗诊断的发展，使整个医疗事业的面貌发生巨大的变化，这种前景的到来已为时不远。此外，在农业育种、基因工程产物的鉴定、食品蛋白质评价等方面，差异蛋白质组学也有着广泛的应用前景。这除了样品的选取不同外，在研究方法上与上述的biomarker 筛选并没有什么不同。
7、蛋白质组学的应用
1. 蛋白质组学在细菌研究中的应用
蛋白质组学方法已广泛用于研究细菌在外界环境变化时其表达蛋白的变化情况。如对霍乱弧菌以及大肠杆菌在不同酸碱条件下蛋白表达的变化的研究，表明这些病原菌会随环境的改变而调节蛋白表达以使其达到最大的致病能力。
蛋白质组学可以与基因组学互补，它能识别某些基因的预测产物，尤其是膜蛋白，这些膜蛋白往往是疫苗的有效成分，如Deb N.Chakravarti 等研究了Hp 疫苗的相关组分，加速了疫苗的开发。
蛋白组学研究也应用在细胞周期研究中，细菌在繁殖周期的每个阶段合成大量蛋白，表明周期性的蛋白表达有助于细菌充分利用能源，保持合适的细菌数量，对机体产生一定的作用。这种对细菌细胞周期调控蛋白表达和降解的研究有助于抗感染措施的制定。
对细菌某些特异抗原的识别可以为一些疾病提供诊断标记。
2. 蛋白质组学在真核生物研究中的应用
蛋白质组学研究已广泛应用于真核生物的研究中。Michel Perrot等用2DE及质谱、免疫杂交、微量测序等方法分离和鉴定了酿酒酵母的401种蛋白，309种以前曾报道过，剩余的92种是新发现的，从而拓展了酵母参考图谱，为研究细胞功能、酵母翻译因子靶点提供了条件【10】。
3. 蛋白质组学在植物研究中的应用
植物蛋白质组学虽然刚刚起步，但它的发展将对植物界有很大的冲击。H型硫氧还蛋白能减少靶蛋白的二硫键，促使种子发芽。为了更好地了解硫氧还蛋白在种子中的作用，应先了解其作用的靶蛋白。Hiroyuki Yano等运用蛋白组学方法分离了20多种靶蛋白，并鉴定了其中的5种，其中3种是变态反应原，2种与落叶及种子成熟有关
4. 蛋白质组学与肿瘤研究
肿瘤涉及到控制正常细胞增殖机制的破坏。对原癌基因的鉴定和描述已通过分子生物学方法完成。然而有些基因并不是自己单独作用，也不是典型地破坏正常细胞增殖机制。用传统的生物化学方法、基因、药物学方法都不能分析。蛋白组学技术可以比较正常组织与癌组织的变化，这种肿瘤相关的变化可以为医疗干预提供新的标记和位点。Mrtin.J.Page等用蛋白组学技术分离和研究了乳腺癌相
关蛋白。对肿瘤抗原或与其相关抗体的分离和鉴定给肿瘤的早期诊断和治疗提供了一种新的方案。Franck M.Brichery等运用蛋白组学方法研究了肺癌组织中引起体液免疫应答的蛋白及自身抗体。他们所研究的肺癌病人中多于一半的人血清中有针对AnnexinI或/和II的IgG1和IgM自身抗体，AnnexinII自身抗体仅在肺癌病人血清中出现，而AnnexinI自身抗体也在其他类型病人血清中出现。这些研究有助于推动针对肿瘤中某种蛋白的自身抗体的发展【11】。Shugo Nawata等用2DE及免疫杂交法研究了鳞状细胞癌肿瘤组织抗原-1、抗原-2，发现了鳞状细胞癌抗原新的酸性蛋白，有助于开发一种检测此蛋白的系统，为鉴别诊断提供依据。
8、展望
目前有约60种微生物的全基因组序列已经测出, DNA序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照, 蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生(如蛋白翻译), 以及非基因编码的活动之间的关系(如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用)【12】。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率，蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达必不可少的一种手段，它的发展将给分子生物学领域带来革命性变化。
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12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室蛋白质组学的相关技术及应用
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.doczj.com/doc/7f12609257.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
蛋白质组学技术在农业生物科研领域、疾病机理机制研究、药物研究、海洋环境、植物胁迫机制研究等方面具有广泛应用。蛋白组学的研究通常遵循以下思路： 蛋白质组学研究思路 图 1 蛋白质组学研究思路 一、蛋白质组学在农业生物科研领域的应用 蛋白质组学技术在农业生物科研领域的应用为作物生长发育、病虫害防治、遗传育种、畜牧兽医学疾病诊断和治疗等方面发挥重要的作用，为现代农业发展开辟新途径。 1 .蛋白质组学在农作物研究中的应用 农业是我国人口赖以生存的基础，而提高粮食产量和品质则是农业发展的关键。蛋白质组学关键技术在作物遗传育种、品系鉴定、品质改良、逆境胁迫应答等关键环节的应用，为农业作物的进一步开发利用提供巨大的参考价值。蛋白质组学可系统研究农作物在特定环境或某个发育阶段的组织和器官中蛋白质的表达变化，有助于作物发育过程机制的理解。 Jia等人利用SWATH等技术对四种玉米组织中的蛋白质进行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日龄幼苗的根。在玉米的4种组织中总共鉴定到4551个蛋白质，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分别鉴定到3916、3707、3702和2871种蛋白质。利用生物信息学技术将蛋白质组和转录组进行关联分析，并且进一步分析组织特异性高表达的基因和蛋白，以了解玉米组织结构和器官发生的调节机制，为研究玉米发育生物学研究提供了新的线索。相关成果2017年发表在Journal of Proteome Research上。
图 2 实验流程图 文献来源：Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017. 2.蛋白质组学在食品科学中的应用 在食品安全研究中，蛋白组学的出现为食品科学的研究指明了方向，同时也为食品科学的研究奠定了良好的发展平台。蛋白质组学在粮油食品、肉类食品、水产食品、乳品食品等方面的应用，不仅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及储存条件的同时，还可以提高食品的口感以及营养程度。 在热处理过程中，肉类的主要成分蛋白质会发生结构性变形，如氧化、降解、变性和聚集。蛋白质的这些变化对最终肉制品的质量、颜色、嫩度和风味有重要影响，并最终影响适口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技术手段研究了在加热中心温度为72℃时用不同的烹饪方法，例如水浴烹饪-WB、短时欧姆烹饪-STOH和长时间欧姆烹饪-LTOH，对牛肉的颜色、烹饪损失、剪切值和蛋白质组变化的影响。蛋白质组学分析表明，欧姆烹饪的烹饪损失、剪切值显著低于水浴烹饪（P<0.05）。利用2-DE蛋白组学技术成功鉴定到STOH和WB烹饪样品之间的17个差异蛋白质，并鉴定出LTOH和WB样品之间的13个差异蛋白质。大多数差异蛋白是肌原纤维和肌浆蛋白，可能与肉质的变化相关。WB烹饪可改变蛋白质溶解度并降低2-DE图像中的蛋白质斑点强度。应用欧姆烹饪会产生更高质量的牛肉产品，并减少烹饪时间。相关成果2016年发表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2. 生物质谱技术