植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 337－343, w w https://www.doczj.com/doc/821548802.html,
收稿日期: 2007-03-13; 接受日期: 2007-11-29
基金项目: 湖北省生物资源保护与利用重点实验室开放基金(No.2007010)、国家林业局自然保护区研究中心项目(No.460-8101)和宜昌市科技局重点攻关项目(No.A06209)
* 通讯作者。E-mail: c henf j616@https://www.doczj.com/doc/821548802.html,
.组织培养简讯.
珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生
熊丹1, 陈发菊1, 2*, 梁宏伟1, 王玉兵1
1
三峡大学生物技术研究中心, 湖北省天然产物研究与利用重点实验室, 宜昌443002
2
湖北民族学院湖北省生物资源保护与利用重点实验室, 恩施445000
摘要 以香果树(Em menopterys henryi )未成熟种子为试材, 探讨不同的接种量、基本培养基、糖浓度及植物生长调节物质等对体细胞胚胎生长的影响, 建立稳定的香果树胚性细胞悬浮培养与植株再生体系。结果表明: 悬浮培养条件下, 最适接种量为2%(鲜重); 较适合的基本培养基为MS; 蔗糖浓度为1%时容易使球形胚聚合体愈伤化, 浓度为3%和6%适合球形胚聚合体增殖, 浓度为9%则容易使球形胚聚合体褐化; 添加0.5 mg .L －16-BA 和0.5 mg .L －1 NAA 的MS 液体培养基, 当初始蔗糖浓度为3%, 然后逐步提高到6%则有利于香果树各个发育阶段的同步化; 子叶胚转到不含任何植物生长调节物质的MS 固体培养基中可以长成正常植株。
关键词 胚性悬浮细胞, 香果树, 植株再生, 体细胞胚胎发生
熊丹, 陈发菊, 梁宏伟, 王玉兵 (2008). 珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生. 植物学通报 25, 337－343.
植物细胞悬浮培养(plant cell suspension culture)在现代生物学研究中有着广泛的应用。植物悬浮细胞系可以用来分离原生质, 制造人工种子, 筛选突变体, 生产次生代谢物质以及进行植物细胞代谢生理和生化特征等方面的研究。
香果树(Emmenopterys henryi ), 别名丁木, 为茜草科(Rubiaceae)香果树属高大乔木, 我国特有单种属植物, 第四纪冰川幸存的古老孑遗树种。香果树的分布零散, 种群数量不多, 自然条件下种子萌发力极低, 天然更新能力差, 现存数量有限, 处于濒危状态, 已被列为国家二级重点保护植物和林业部公布的国家珍贵树种。该树种在我国主要分布在江西、福建、湖南和湖北等地海拔400－1 400 m 的土壤湿润肥沃的山坡和谷地。香果树材质洁白细密, 纹理通直, 是一种优良用材树种。它树姿优美, 花色艳丽, 也是很好的观赏植物(傅立国和金鉴明, 1992)。迄今为止, 国内外通过体细胞胚发生途径来大量繁殖香果树的报道很少, 仅有姬飞腾等(2005)利用香果树叶片为外植体, 通过固体和悬浮培养诱导出
体细胞胚胎, 但对于细胞悬浮培养的相关影响因子尚未有系统的研究报道。本文以香果树未成熟种子为外植体, 探讨不同的接种量、基本培养基、糖浓度及生长调节物质等对体细胞胚胎生长的影响, 建立了稳定的细胞悬浮培养与植株再生体系, 以期为香果树的细胞工程和基因工程研究奠定基础。
1 材料与方法
香果树(Emmenopterys henryi Oliv)幼嫩果实于2004年8月采自神农架自然保护区。取香果树幼嫩果实(果龄30天左右)在洗涤液中用软刷刷洗, 然后用洗涤液浸泡30分钟, 自来水冲洗2小时, 在超净工作台上用75%乙醇灭菌1分钟, 0.1%HgCl 2消毒15分钟, 无菌水清洗5次。用手术刀纵向切开果皮, 挑出未成熟种子备用。
1.1 胚性愈伤组织的诱导
将未成熟种子接种到附加2.0 mg ·L －1 6-BA 的MS 固体
338植物学通报 25(3) 2008
培养基(Murashige and Skoog, 1962)中培养。6天后产生浅绿色致密愈伤组织, 继续培养4天后, 将浅绿色愈伤组织转移到附加0.1 mg·L－16-BA和0.5 mg·L－1NAA 的MS培养基上培养 30天, 浅绿色愈伤组织逐渐变为黑色。继代培养40天, 从黑色的愈伤组织表面生长出浅黄色疏松的胚性愈伤组织。在培养基中添加3%(w/v)蔗糖和0.8%(w/v)琼脂。用0.1m o l·L－1H C l或0.1 mol·L－1NaOH调节pH值, 在灭菌前各培养基pH值为6.0, 121°C灭菌20 分钟。培养温度为(25±2)°C, 光照强度为2 000 μmol·m－2·s－1, 光照时间每天16小时。
1.2悬浮体系的建立
1.2.1球形胚聚合体的获得
将浅黄色胚性愈伤接种到含0.5 mg
.L－16-BA和0.5 mg. L－1NAA的MS液体培养基中, 添加3%蔗糖, 100 mL 三角瓶中加50 mL液体培养基。置摇床上培养, 转速为每分钟120转, 培养温度(25±2)°C, 光照强度为1 000μmol·m－2·s－1, 光照时间每天16小时。每14天继代1次, 继代时用60目尼龙网过筛处理, 使其大小均一。继代2次后, 显微观察, 悬浮培养物主要由球形胚聚合体组成。将获得的大小均一的球形胚聚合体作为初始材料用于筛选对体细胞胚胎发生最适的基本培养基、接种量、蔗糖浓度和植物生长调节剂等。
1.2.2 不同接种量对球形胚聚合体生长的影响
分别以0.4%、1.0%、2.0%、3.0%和5.0%(w/v)接种量(鲜重)将球形胚聚合体接种到含0.5 mg·L－16-BA和0.5 mg·L－1NAA的MS液体培养基中, 添加3%蔗糖, 每个处理重复4次。培养14天后, 观察球形胚聚合体的生长情况并统计其生长量。
选取较优的接种量(2.0%)处理组测定悬浮培养物生长过程中pH值和生长量的变化, 设4个重复, 每隔2天取其充分摇匀的悬浮培养物5 mL, 8 000×g离心10分钟, 将沉淀物称重, 同时测上清液pH值, 共测定10次。
1.2.3 基本培养基对球形胚聚合体生长的影响
将球形胚聚合体以2.0%的接种量接种到1/2MS(大量元素减半,其余成分同M S)、M S、B5(L l o y d a n d McCown, 1980)和WPM (Gamborg et al.,1968) 4种基本培养基中, 不添加任何生长调节剂, 每个处理设4个重复。培养14天后, 观察球形胚聚合体的生长情况并统计其生长量。
1.2.4 不同浓度的蔗糖对球形胚聚合体生长的影响将1.0 g球形胚聚合体接种到50 mL附加0.5 mg·L－1 6-BA和0.5 mg·L－1NAA的MS液体培养基中, 添加不同浓度的蔗糖(0、1%、3%、6%和9%)。每个处理设4个重复。14天后观察球形胚聚合体的生长情况并统计其生长量。
1.2.5 不同种类和浓度的生长调节物质及蔗糖浓度对体细胞胚胎同步化的影响
将球形胚聚合体转到MS液体培养基中, 附加0.01 mg ·L－1 NAA和0.005、0.01、0.05和0.1 mg·L－1 6-BA,培养基编号依次为D1、D2、D3和D4, 编号D5为附加0.5 mg·L－1 6-BA和0.5 mg·L－1 NAA的MS液体培养基, 并添加不同浓度的蔗糖(1%、3%和6%)。每个处理设4个重复。隔适当时间换液, 更换液体时蔗糖浓度有所改变。观察不同种类和浓度的生长调节物质及蔗糖浓度对体细胞胚胎不同发育阶段同步化的影响。
1.3数据处理
用SPSS 13.0软件分析数据, 以最小显著差数法(LSD)评价差异的显著性。
2 结果与分析
2.1不同初始细胞密度下的球形胚聚合体的增殖在悬浮培养过程中, 球形胚聚合体不停地产生新的球形胚, 同时体积较大的球形胚脱离球形胚聚合体, 继续培养, 得到了心形胚、鱼雷形胚和子叶胚, 最后获得成熟胚。悬浮培养中初始细胞密度对球形胚聚合体的增殖有显著影响(表1)。初始细胞密度太小(接种量为1%)或
339熊丹等: 珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生
太大(接种量为5%)时, 球形胚聚合体的增殖较少; 当接种量为2%或3%时, 球形胚聚合体的增殖没有显著差异, 都比较大; 但接种量为3%时, 培养一段时间后, 球形胚聚合体颜色逐渐由浅黄色变成灰褐色, 并且培养液由澄清变浑浊。因此, 初始细胞密度为2%最有利于香果树球形胚聚合体的增殖。
球形胚聚合体的鲜重变化呈S形曲线, 整个生长周期可分为缓慢生长期(第0－8天)、对数生长期(第8－14天)和停滞期(第14－18天)(图1)。培养液pH值的变化近似V形曲线(图2)。在接种后1－8天内pH值不断下降, 从6.0下降到最低点4.6, 此阶段球形胚聚合体增长缓慢; 第8－14天pH值迅速回升, 从4.6增加到5.71, 此阶段球形胚聚合体增长迅速; 第14－16天, pH值缓慢回升, 此时球形胚聚合体增加缓慢; 第16天以后pH值和球形胚聚合体的增加都几乎停滞, 此时如不及时更换新鲜培养基,悬浮细胞将老化死亡。2.2基本培养基对球形胚聚合体生长的影响
先期诱导的胚性愈伤组织(图3A, B), 经培养处理(1.2.1节)获得了球形胚聚合体作为悬浮培养初始材料(图3C)。将球形胚聚合体以2%的接种量接种到1/2MS、MS、B5和W PM 4种基本培养基中, 不添加任何植物生长调节剂。14天后, 球形胚聚合体的生长情况和生长量如表2。在B5基本培养基中球形胚聚合体生长迅速, 生长量最大, 球形胚聚合体逐渐长成半透明的球形胚、心形胚和鱼雷胚(图3D), 并得到较多半透明的绿色子叶胚, 但胚状体的颜色逐渐变成浅灰黄色, 向非胚性愈伤发展。在MS基本培养基中, 球形胚聚合体颗粒均一且细碎,浅黄色结实的球形胚较多,生长量较大。在WPM基本培养基中, 球形胚聚合体增殖较少, 逐渐长成透明的球形胚、心形胚、鱼雷胚和毛状的绿色子叶胚,同时有乳白色的子叶胚生成(图3E), 颗粒非常不均一, 胚
表1 接种量对香果树球形胚聚合体增殖的影响
Table 1 Effects of innoculation quantity on pr olifer ation of globular embr yos of Emmenopterys henr yi
Innoc ulation quantity(%)0.4 1.0 2.0 3.0 5.0
Gr ow th y ield(g) 2.2±0.40 c 4.2±0.12 b 5.5±0.47 a 6.3±0.33 a 5.3±0.40 ab
同一行数字后不同字母分别代表0.05水平差异显著。
Means pr ec eding the s ame letter for eac h line w ere not diff er ent statistic ally at 5% pr obability as deter mined by LSD multiple
comparisons.
图1 悬浮培养过程中细胞生长曲线Figur e 1 Gr ow th c urv
e o
f suspension cells 图2 细胞悬浮培养过程中pH值的变化
Figur e 2 Variation in pH during the per iod of culture
340植物学通报 25(3) 2008
状体的颜色逐渐变成灰黄色, 向非胚性愈伤发展, 继续培养, 生长越来越差。在1/2MS培养基中, 浅黄色的球形胚聚合体逐渐变成灰黄色, 生长缓慢。因此较适合体细胞生长的基本培养基为M S培养基。
2.3不同浓度的蔗糖对球形胚聚合体生长的影响
取1.0 g球形胚聚合体接种到50 mL MS液体培养基中,附加0.5 mg·L－1 6-BA和0.5 mg·L－1 NAA并添加不同浓度的蔗糖(0、1%、3%、6%和9%)。14天后,观察球形胚聚合体的生长情况并统计其生长量(表3)。结果显示, 糖浓度对球形胚聚合体的生长影响较大。不加蔗糖的球形胚聚合体几乎不增殖, 生长非常缓慢; 蔗糖浓度为3%和6%的培养基中, 球形胚聚合体增殖量最大;当蔗糖浓度增加到9%时, 浅黄色的球形胚聚合体逐渐褐化,球形胚聚合体生长受阻。
2.4不同种类和浓度的生长调节物质及蔗糖浓度对体细胞胚胎同步化的影响
将球形胚聚合体接种到含有不同种类和浓度的生长调节物质及与不同浓度蔗糖组配的液体培养基中摇床培养,每个处理设4个重复。间隔适当时间换液, 更换液体时蔗糖浓度改变。在不同浓度的蔗糖对球形胚聚合体生长的影响实验中, 发现不加蔗糖时球形胚聚合体几乎不增殖; 当蔗糖浓度为9%, 球形胚聚合体易褐化。故在进行蔗糖浓度对体细胞胚胎同步化的影响实验时, 蔗糖只选择了1%、3%和6%这3种浓度, 观察生长调节物质及蔗糖浓度2个因素对体细胞胚胎不同发育阶段同步化的影响。
2.4.1 初始蔗糖浓度为1%时的体细胞胚胎生长情况将球形胚聚合体转移到含1%蔗糖的液体培养基中, 编号依次为D1、D2、D3、D4和D5,显示胚生长缓慢且个体小。D1和D3中大多数胚为球形胚, 透明, 表面为絮状, 看似愈伤化(图3F)。D2、D4和D5中的胚比D1和D3规则, 半透明或白色不透明, 愈伤化程度比D1和D3低。培养一段时间后, 将来源于附加1%蔗糖(D3)的培养物转入附加3%蔗糖的培养基(D3)中培养。2－3天后球形胚从一端长出根状物(图3G), 同时也有鱼雷胚,但一端大多数长出根来, 成为有明显根端的鱼雷胚。接着用6%的蔗糖处理, 有明显根端的鱼雷胚会向子叶胚方向发展, 这些子叶胚可进一步发育, 长成植株, 但植株
表2 基本培养基对球形胚聚合体生长的影响
Table 2 E f fec ts of the basal medium on grow th of somatic embr yos of Emmenopterys henr yi
Basal medium Gr ow th y ield(g)Characteris tic s of s omatic embry os
1/2MS 1.6±0.17 c Unifor m particles, a considerable number of gray ish yellow and compac ted globular embry os MS 4.0±0.60 b More unifor m and fine particles, a c ons iderable number of light yellow and c ompacted
globular embry os
B5 5.5±0.60 a More unifor m and grayis h y ellow par tic les, a considerable number of green s eedlings WPM 2.4±0.41 c Non-unif orm, s emitransparent and grey y ellow par ticles, badly gr ow
同一列数字后不同字母分别代表0.05水平差异显著。
Means pr ec eding the s ame letter for eac h line w ere not diff er ent statistic ally at 5% pr obability as deter mined by LSD multiple comparisons.
表3 不同浓度的蔗糖对球形胚聚合体增殖的影响
Table 3 E f fec ts of suc ros e c onc entrations on pr olifer ation of somatic embr yos of Emmenopterys henr yi
Sucrose concentrations(%)01369
Gr ow th y ield(g) 1.1±0.07 d 2.0±0.29 c 5.5±0.47 a 5.4±0.32 a 4.2±0.23 b
同一行数字后不同字母分别代表0.05水平差异显著。
Means pr ec eding the s ame letter for eac h line w ere not diff er ent statistic ally at 5% pr obability as deter mined by LSD multiple comparisons.
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熊丹等: 珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生比较弱小。将在添加1%蔗糖的D3中培养14天的悬浮培养物, 转入含6%蔗糖的D3中, 胚内部变为绿色,向非胚性愈伤发展, 不再进一步分化。
2.4.2 初始蔗糖浓度为3%时的体细胞胚胎生长情况在蔗糖初始浓度为3%、编号分别为D2、D4和D5中培养的球形胚聚合体生长较快, 且个体比较大, 表面光
图3 悬浮培养条件下香果树体细胞胚胎生长情况和植株再生
(A)黑色的愈伤组织和浅黄色胚性愈伤组织; (B) 圆球状的聚集物; (C)悬浮培养初始材料; (D) 在B5培养基中生成的鱼雷胚; (E )在WPM 培养基中生成的乳白色子叶胚; (F) 蔗糖浓度为1%, 激素配比为D3(MS+0.01 mg .L －1 NAA +0.05 mg .L －1 6-BA)培养条件下的球形胚;(G)长出根的胚; (H) 蔗糖浓度为3%, 激素配比为D4(MS+0.01 mg .L －1 NAA+0.1 mg .L －1 6-BA )的培养条件下的胚状体; (I) 蔗糖浓度为3%, 激素配比为 D4的培养条件下的三角形胚; (J) 蔗糖浓度为3%, 激素配比为D4的培养条件下的鱼雷胚; (K) 蔗糖浓度为6%, 激素配比为D4的培养条件下的子叶胚; (L) 蔗糖浓度为3%, 激素配比为D2 (MS+0.01 mg .L －1 NAA+0.01 mg .L －1 6-BA )和D5 (MS+0.5 mg .L －1NA A+0.5 mg .L －1 6-BA )的培养条件下的球形胚; (M) 发育完整的植株; (N) 带有明显根端的鱼雷胚; (O) 再生植株Figur e 3 The grow th of somatic embryos and plant regeneration of Emmenopterys henryi in suspension culture
(A) Dark c allus and light yellow embr yogenic callus ; (B) Globular aggr egates ; (C) Initial mater ials in suspension c ulture; (D)Torpedo embryos gener ated in B5 medium; (E) Oyster w hite cotyledon embry os generated in WPM medium; (F) Globular embry os generated in the medium w hose sucr ose concentration w as 1% and P GR concentration w as D3(MS+0.01 mg .L －1 NA A+0.05 mg .L －16-BA); (G) Embry os w ith root; (H) Somatic embry os gener ated in the medium w hose sucr ose c onc entration w as 3% and PGR conc entration w as D4 (MS+0.01 mg .L －1 NAA +0.1 mg .L －1 6-BA);(I) Triangle embry os generated in the medium w hose s uc rose concentration w as 3% and PGR conc entration w as D4; (J) Torpedo embry os generated in the medium w hose s ucr ose conc entr a-tion w as 3% and P GR concentr ation w as D4; (K) Cotyledon embry os generated in the medium w hos e sucrose c onc entr ation w as 6% and P GR concentration w as D4; (L) Globular embry os gener ated in the medium w hose s ucr os e c onc entration w as 3% and P GR c onc entration w as D2 (MS+0.01 mg .L －1 NAA+0.01 mg .L －1 6-BA ) and D5 (MS+0.5 mg .L －1 NAA+0.5 mg .L －1 6-BA ); (M ) Devel-opmental matur e plants; (N) Torpedos w ith obv ious r oot apex; (O) Regener
ated plants
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滑。D4中的体细胞胚胎为透明或半透明(图3H－J)。在蔗糖浓度提高到6%的D4中继续培养, 显示无明显根端的鱼雷胚能进一步发育成子叶胚(图3K)。D2和D5中的球形胚为白色不透明(图3L), 在蔗糖浓度提高到6%的D2和D5中培养, 胚经历心形胚、无明显根端的鱼雷胚和子叶胚, 最后发育成完整的植株(图3M), 其中D5培养基中生成的再生植株最多。将在初始蔗糖浓度为3%的D2中生长的悬浮培养物转移到含蔗糖6%的D2中, 14天后转入含蔗糖1%的D2培养液中, 愈伤上长出透明鱼雷胚, 质软, 生长比较均一, 但不能进一步发育。将初始蔗糖浓度为3%的D2中生长的胚状体转移到含1%蔗糖的D2中, 胚开始褐化, 失去发育能力。
2.5悬浮体系的建立
本研究证明初始细胞密度为2%最有利于香果树球形胚聚合体增殖; 继代周期是14天; 较适合球形胚聚合体的基本培养基为MS。悬浮培养条件下, 1%的蔗糖浓度容易使胚愈伤化, 3%和6%的蔗糖浓度适合球形胚聚合体增殖, 9%的蔗糖浓度容易使球形胚聚合体褐化。添加0.5 mg·L－1 6-BA 和0.5 mg·L－1 NAA的MS液体培养基, 初始蔗糖浓度为3%, 然后逐步提高蔗糖浓度到6%有利于香果树体细胞胚胎不同发育阶段的同步化。以2.0%的接种量将球形胚聚合体接种到含0.5 mg·L－1 6-BA和0.5 mg·L－1NAA的MS液体培养基中, 添加3%蔗糖, 培养14天, 平均1.0 g培养物可产生约1.1×105个球形胚, 有95%的球形胚发育为子叶胚。
2.6植株再生和移栽
将香果树带有明显根端的鱼雷胚(图3N)接种到不添加任何生长调节物质的MS固体培养基中, 结果显示不能长成植株, 但将其转入含0.5 mg·L－1 6-BA和0.5 mg·L－1 NAA的MS固体培养基中, 则可以萌发成植株。将已经长出2片子叶的子叶胚转移到不含任何植物生长调节物质的MS固体培养基上, 茎端先发育, 然后开始长根, 最终长成正常植株(图3O)。子叶胚转变为再生植株的频率可达100%, 形态上没有观察到畸形苗, 移栽成活率达95%以上。3讨论
细胞悬浮培养是植物细胞生产工业化必经的重要步骤,通过悬浮培养可获得大量的体细胞胚。与固体培养相比, 细胞悬浮培养具有细胞繁殖速度快, 能大规模培养和可提供大量均匀一致的植物细胞培养物的特点。本实验中, 液体培养的悬浮细胞分裂速度快, 球形胚数量多且较同步, 并可以得到较多的各个时期的胚。球形胚经过体胚成熟和体胚萌发等步骤, 成功获得了体胚的再生植株。
蔗糖在体胚发生过程中不仅可作为碳源, 而且可作为渗透剂调节培养基渗透势(Pa rk an d Ah n, 2005; Shohael et al., 2006; Jheng et al., 2006)。本实验中,蔗糖的浓度不同, 则香果树体细胞胚胎的生长情况也有些不同。当初始蔗糖浓度比较低时, 胚容易发生早熟现象, 胚个体小, 容易愈伤化, 且几天后就跨越正常的发育阶段长出根来, 生成的植株比较弱小。在初始蔗糖浓度为3%的培养基中, 胚个体大, 生长正常, 不易再次愈伤化, 最有利于形成正常的香果树体细胞胚。在悬浮培养过程中逐步提高蔗糖浓度有利于香果树体细胞胚胎不同发育阶段的同步化。在蔗糖浓度改变的过程中, 改变的范围不宜过大, 应逐渐提高糖浓度, 如果糖浓度跨度过大,则形成的胚极易愈伤化。
进一步研究利用生物反应器大规模生产香果树体细胞胚胎, 将会节约成本, 提高生产效率。由于体胚发生体系较为稳定,可以在分子水平上研究胚胎发生的机理。体细胞胚胎发生系统是遗传转化研究的良好受体系统, 利用农杆菌介导的转化方法, 可以转入有用抗性基因,进行遗传改良研究。
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En shi 445000, Chi na
Abstr act E mbry ogenic cell suspension c ultures w er e establis hed from calli of immature s eeds of Emmenopterys henryi. Callus could be obtained fr om immatur e seeds on MS solid medium augmented w ith 2.0 mg·L －1 6-benz ylaminopur ine (6-BA) and 3%sucros e. E mbryogenic calli w er e induced on MS basal medium supplemented w ith 0.1 mg·L －1 N-acetyl aspar tate (NAA) and 0.5 mg ·L －1 6-BA. Numer ous somatic embryoids appeared on MS liquid basal nutr ient medium w ith 0.5 mg·L －1 NA A and 0.5 mg·L －1 6-BA. The optimal value of the initial cell density w as 2.0% (fresh w eight). Sever al par ameter s that might be as soc iated w ith grow th w ere determined over a 14-day period. The embryo-der ived plantlets w ith w ell-developed roots and shoots w ere transfer red succes s-fully to the gr eenhouse, w ith a high sur viv al rate of 95%.
Ke y w ords e mbryoge nic suspen sio n ce ll, Emm en opt erys he nryi , pla nt rege nerati on, som ati c e mbryoge nesis
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(责任编辑: 白羽红)
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Shohael AM , Chak rabart y D, Ali MB, Yu KW, Hahn E J, Lee
HL, Pae k KY (2006). E nhancement of eleutherosides produc-tion in embryogenic cultures of Eleutherococcus sessiliflorus in response to sucrose-induced osmotic stress. Proc B iochem 41, 512－518.
试论贴壁细胞悬浮培养的特点及其体系的建立 摘要：文章主要对贴壁细胞悬浮培养进行研究。本次研究中通过文献资料分析了贴壁细胞悬浮培养的特点，然后对培养中体系建立的要求进行明确。体系建立的过程中严格依照外植体培养标准及愈伤组织选取标准实施，体系建立非常科学。该体系的构建对细胞培养学的丰富具有一定的贡献性作用。 关键词：植物细胞；悬浮培养；特点；培养体系 1 贴壁细胞悬浮培养的特点 细胞悬浮培养主要指在培养的过程中将细小的细胞聚集在培养液上实施培养，该操作主要在摇床上完成，可以在短时间内获得大量细胞，培养效果非常显著。该培养的过程中主要选取植物细胞完成培养过程，通过将植物愈伤组织处理后放置在液体培养基上进行培养操作，可以有效改善愈伤组织的分裂和增殖能力，细胞生长速度大大提升。 植物细胞悬浮培养时一般不需要支持物，生长速度较快，对培养条件要求并不苛刻。这种培养的过程中植物细胞可以悬浮在培养基中培养，上述状况下植物细胞悬浮培养面积有效提升，培养效果较好。与此同时，这种培养的过程中植物细胞敏感性一般较低，培养操作中无需加入动物细胞培养过程中的血清、微生物培养过程中的有机物质等，整体培养成本较低，经济效益较好。其具体培养特点见表1. 表1 植物贴壁细胞悬浮培养中培养特点 性质微生物植物细胞植物器官大小（μm）1-10 10-200 ≥103 细胞聚集经常发生通常成团毛状根、芽、体胚等倍增时间≤1h 24-150h 几天不等 接种密度小整个体积的5%-20% 大剪切力敏感程度低高、敏感高、敏感 遗传稳定性强弱一般耗氧量一般低高 营养要求简单较复杂较为复杂 产物积累胞外，高常存于液泡中，浓度低多为胞内产物，较高通气量（L/(L.min)）高≥1 低≤0.6 略高，1左右环境敏感性适应范围广可浸没培养长期浸没易玻璃化传统变异筛选技术广泛使用有时使用有时使用 2 贴壁细胞悬浮培养体系的建立 2.1 培养流程 在实施植物细胞贴壁悬浮培养的过程中人员要严格依照培养原则要求，细化细胞培养流
基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼 醇的合成研究” (524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。 作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21 责任编辑:董志坚 E 2mail:yckj2256@yahoo https://www.doczj.com/doc/821548802.html, 电话:0371267672650 烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立 岳彩鹏,李 品,黄象男,朱大恒 郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号 450001 关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号 摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。中图分类号:S572.01 文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1 Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula . 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的 理想途径[1] 。有关烟草组织和细胞培养已有不 少报道[225] ,近年来在抗性研究、基因转化和次生 物质生产等方面也取得一些进展[629] 。有研究表 明 [10] ,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢 物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具 有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。
细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化
1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
非洲紫罗兰悬浮细胞系的制备（初稿） 一、实验目的和要求 1. 了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。 2. 通过实验熟悉无菌操作技术，培养无菌操作技能。 二、实验原理 将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。 三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。本实验仅介绍最常用的悬浮培养技术。 植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有旺盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核质比率大，胞质浓厚，无液泡化程度较低。
植物细胞悬浮培养 一、实验目的及意义 植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。由于培养的细胞对外界的各种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分子生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。烟草（Nicotiana tubacum Linn.）为茄科经济作物，同时也是植物分子生理生化研究一种重要的模式植物。丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。 二、实验原理 植物细胞悬浮培养（plant cell suspension culture）是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。本实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。 植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液中的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基中均匀分布，有利于培养基与细胞间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面之间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的排除。 三、实验仪器与药品 超净工作台，恒温振荡器（摇床），高压灭菌锅，培养室（培养箱），封口膜，油性标记笔，无菌蒸馏水 四、实验材料 烟草愈伤组织 五、操作步骤与方法
实验五植物细胞悬浮培养与同步化 一、实验目的与意义 学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法。 植物离体细胞作为生物反应器具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰，而且产量高、化学稳定性和化学特性好等特点，利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者们的重视，也有成功的先例。同时，研究发现，离体培养条件下，细胞系的种类以及培养条件、培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度对目的产物的产量有很大的影响。 二、基本原理 利用固体培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变。而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 三、实验器材 超净工作台、震荡摇床、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、镊子、锥形瓶、各种接种工具、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机
毕业论文(设计) 中国·武汉 二○一二年四月
目录 摘要 (3) 关键词 (3) Abstract (3) Key words (3) 前言 (4) 1.细胞悬浮培养的定义 (4) 2.单细胞制备的方法 (4) 2.1 机械法 (4) 2.2酶解法 (4) 2.3 愈伤组织诱导法 (4) 3.悬浮培养的条件 (5) 4.细胞初始培养 (5) 5.细胞悬浮培养的类型 (5) 5.1分批培养 (5) 5.2连续培养 (6) 6.悬浮培养细胞的同步化 (6) 6.1 物理方法 (6) 6.1.1 体积选择法 (6) 6.1.2低温处理法 (6) 6.2 化学方法 (6) 6.2.1 饥饿法 (6) 6.2.2抑制法 (6) 7.规模化培养 (7) 8.存在问题与前景展望 (7) 8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7) 8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7) 8.3前景展望 (7) 参考文献 (8) 致谢 (8)
植物细胞的悬浮培养技术 摘要 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词 植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学 Plant cell suspension culture technology Abstract Because plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technology Key words .Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 337－343, w w https://www.doczj.com/doc/821548802.html, 收稿日期: 2007-03-13; 接受日期: 2007-11-29 基金项目: 湖北省生物资源保护与利用重点实验室开放基金(No.2007010)、国家林业局自然保护区研究中心项目(No.460-8101)和宜昌市科技局重点攻关项目(No.A06209) * 通讯作者。E-mail: c henf j616@https://www.doczj.com/doc/821548802.html, .组织培养简讯. 珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生 熊丹1, 陈发菊1, 2*, 梁宏伟1, 王玉兵1 1 三峡大学生物技术研究中心, 湖北省天然产物研究与利用重点实验室, 宜昌443002 2 湖北民族学院湖北省生物资源保护与利用重点实验室, 恩施445000 摘要 以香果树(Em menopterys henryi )未成熟种子为试材, 探讨不同的接种量、基本培养基、糖浓度及植物生长调节物质等对体细胞胚胎生长的影响, 建立稳定的香果树胚性细胞悬浮培养与植株再生体系。结果表明: 悬浮培养条件下, 最适接种量为2%(鲜重); 较适合的基本培养基为MS; 蔗糖浓度为1%时容易使球形胚聚合体愈伤化, 浓度为3%和6%适合球形胚聚合体增殖, 浓度为9%则容易使球形胚聚合体褐化; 添加0.5 mg .L －16-BA 和0.5 mg .L －1 NAA 的MS 液体培养基, 当初始蔗糖浓度为3%, 然后逐步提高到6%则有利于香果树各个发育阶段的同步化; 子叶胚转到不含任何植物生长调节物质的MS 固体培养基中可以长成正常植株。 关键词 胚性悬浮细胞, 香果树, 植株再生, 体细胞胚胎发生 熊丹, 陈发菊, 梁宏伟, 王玉兵 (2008). 珍稀濒危植物香果树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生. 植物学通报 25, 337－343. 植物细胞悬浮培养(plant cell suspension culture)在现代生物学研究中有着广泛的应用。植物悬浮细胞系可以用来分离原生质, 制造人工种子, 筛选突变体, 生产次生代谢物质以及进行植物细胞代谢生理和生化特征等方面的研究。 香果树(Emmenopterys henryi ), 别名丁木, 为茜草科(Rubiaceae)香果树属高大乔木, 我国特有单种属植物, 第四纪冰川幸存的古老孑遗树种。香果树的分布零散, 种群数量不多, 自然条件下种子萌发力极低, 天然更新能力差, 现存数量有限, 处于濒危状态, 已被列为国家二级重点保护植物和林业部公布的国家珍贵树种。该树种在我国主要分布在江西、福建、湖南和湖北等地海拔400－1 400 m 的土壤湿润肥沃的山坡和谷地。香果树材质洁白细密, 纹理通直, 是一种优良用材树种。它树姿优美, 花色艳丽, 也是很好的观赏植物(傅立国和金鉴明, 1992)。迄今为止, 国内外通过体细胞胚发生途径来大量繁殖香果树的报道很少, 仅有姬飞腾等(2005)利用香果树叶片为外植体, 通过固体和悬浮培养诱导出 体细胞胚胎, 但对于细胞悬浮培养的相关影响因子尚未有系统的研究报道。本文以香果树未成熟种子为外植体, 探讨不同的接种量、基本培养基、糖浓度及生长调节物质等对体细胞胚胎生长的影响, 建立了稳定的细胞悬浮培养与植株再生体系, 以期为香果树的细胞工程和基因工程研究奠定基础。 1 材料与方法 香果树(Emmenopterys henryi Oliv)幼嫩果实于2004年8月采自神农架自然保护区。取香果树幼嫩果实(果龄30天左右)在洗涤液中用软刷刷洗, 然后用洗涤液浸泡30分钟, 自来水冲洗2小时, 在超净工作台上用75%乙醇灭菌1分钟, 0.1%HgCl 2消毒15分钟, 无菌水清洗5次。用手术刀纵向切开果皮, 挑出未成熟种子备用。 1.1 胚性愈伤组织的诱导 将未成熟种子接种到附加2.0 mg ·L －1 6-BA 的MS 固体
细胞悬浮培养研究进展 「摘要」：细胞在培养液中呈悬浮状态生长与增殖的培养技术。是一种通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。 「关键词」：植物细胞的悬浮培养愈伤组织动物细胞悬浮培养展望 「引言」：植物培养细胞中含有各种特殊的代谢产物，如生物碱、色素、甾体、萜等药 用成分及香精等, 有的含量很高。因此，利用植物细胞培养技术生产药物已成为当代 生物技术的一个重要领域，特别是培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究已成热点。动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用，通常动物细胞培养 为病毒疫苗的生产提供培养基质同时也是多种生物药品生产不可缺少的工具包括单克 隆抗体和基因治疗产品等。 （一）植物细胞悬浮培养 植物细胞能合成许多具有重要价值的次级代谢产物,它们可作为农药、杀虫剂、调味剂及香精等。这些产物传统上是从天然植物中直接提取,但天然植物生长周期较长,而且生长还受地域和环境因素的限制,所以采用直接提取具有较大的局限性。化学合成法已用于多种产品的生产,但是有些物质不能通过化学法合成,或虽能合成,却比较困难。植物细胞培养可大规模生产代谢产物,现已成为生产某些高价值产品的重要途径。一般情况下,培养细胞中的次级代谢物含量明显高于原来植物细胞中的含量,而且这种方法还能避免地域和环境的影响。19 0 2年,Haberlandt在营养液中成功地培育了单个植物细胞,尽管未能使其分裂生长但为植物细胞培养翻开了新的一页。此后,许多科学家在植物细胞培养方面进行了研究,特别是近二十年里,植物细胞培养取得了飞速发展,悬浮培养日益完善,固定化培养逐步显示其优势,膜培养技术也已崭露头角。以下介绍有关植物和动物细胞的悬浮培养情况。 1.悬浮培养特点 植物细胞培养与微生物有许多相似的地方,但两者又存在着明显的不同,如植物细胞对剪切力敏感,培养要求小通气量,还需要C仇和光照等条件。 1.1对剪切力敏感:植物细胞的个体大,细胞壁僵脆且具有大的液泡,这些特性
波斯菊植物细胞悬浮培养 一．实验目的 1.了解植物细胞悬浮培养的基本过程。 2.掌握植物细胞悬浮培养的基本技术步骤。 二．实验原理 植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 三．实验器材和试剂 材料：波斯菊愈伤组织 试剂：悬浮培养配方：MS+1.5mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA+1000mg/L CH 设备：超净工作台；高压灭菌锅；旋转式摇床；水浴锅；倒置显微镜；镊子酒精灯；三角瓶；移液器；pH计；恒温培养室；漏斗；不锈钢筛血球计数板等 四．实验方法和步骤 1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入三角瓶中并轻轻夹碎。每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基（通常溶液占培养瓶体积1／3左右）30ml，每瓶接种1~1.5g（小麦40ml,1.5g ?）愈伤组织(挑选颗粒细小，疏松易碎，外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织有利于诱导悬浮细胞系)，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 2.将已接种的三角瓶置于旋转式摇床上。在100r/min，25~28℃，光照强度 1 500～20t30lx条件下，进行振荡培养。，1周后用200目不锈钢滤网过滤，除去大的细胞团，加入新鲜培养基开始继代培养。 3.经6~10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10ml，必要时，可用大口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。（若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可进行第一