细胞生物学实验指导
西北农林科技大学生命科学学院细胞生物学教研室
二00九年十月
实验一叶绿体的分离与荧光观察
一. 实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法.
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法.
二. 实验原理
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。
本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
三. 实验用品
1.器材： 1）主要设备: 普通离心机,粗天平,荧光显微镜；
2）小型器材: 剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片。
2.材料：新鲜菠菜。
3.试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液,
0.01%吖啶橙(acridine orange).
0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4℃冰箱保存。放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。
吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。
四.实验方法
1.叶绿体的分离
（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;
（2）加10ml的0.35mol?L-1 NaCl溶液研磨匀浆;
（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;
（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;
（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。
2.叶绿体的观察
（1）取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
（2）在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。
（3）在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。
（4）取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。
五.注意事项：
要得到完整的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立即观察。
六．作业：
1. 描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？
2．叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？
实验二吖啶橙(acridine orange)染色
观察口腔上皮荧光
一．目的要求
1.熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。
2.观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。
二．实验原理
吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。
三．实验用品
1．器材：荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；
2．材料：口腔黏膜上皮细胞临时制片；
3．试剂:
1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。
A液：NaH2PO4·H20 2.76g加蒸馏水至100ml；
B液，Na2HPO4·7H20 5.36g加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml。
2)0.1％吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。临用时配制0.01％吖啶橙染液：将0.1％吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀释。
3）95％乙醇
四．方法与步骤
1．用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；
2．95％乙醇溶液固定5min；
3．滴加0.01％吖啶橙染液染色5min；
4．用PBS缓冲液缓慢冲洗；
5．加盖玻片镜检。
五．观察结果：
描述你所观察到的实验现象，并绘图，表明荧光的颜色。
实验三PAS（Periodic Acid Schiff）反应显示糖原
和其它多糖物质
一.实验目的
(一) 熟悉PAS法原理及操作步骤；
(二) 观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。
二.实验原理
多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。广泛分布于动、植物界。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内起着重要的作用。
淀粉和糖原均由D－葡萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基(-GHO)，游离醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物。
三.实验用品
(一)试剂：
1、过碘酸酒精溶液：取过碘酸（HIO4·2H2O）0.4g溶于35 m1纯酒精中，加入5 m1 的0.2M醋酸钠（醋酸钠2.72g溶于100 m1蒸馏水中），再加入15ml蒸馏水。溶液配好后保存在0℃～4℃的冰箱内，并加黑纸保存，此液如显黄色即失效。
2.Schiff试剂：将0.5 g碱性品红加入100m1煮沸的蒸馏水中，时时摇荡玻璃瓶或者搅拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷却至50℃时过滤到具有玻塞的棕色试剂瓶，加入10ml 的lmol／L的HCl，冷却至25℃时加入0.5g偏重亚硫酸钠，在室温黑暗条件下静置24h，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g剧烈振荡摇匀1min；过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，外包黑纸，4℃保存。本试剂可提前一天准备，此液必需保持清澈透明、无色也无沉淀，容器要小，装满后仅留很小的空隙，其中不应有任何氧化剂，不要过长时间暴露在空气中。如有白色沉淀就不能再用，如颜色变红可以加入少许偏重亚硫酸钠，使其再转变为无色就可以再用。
3、亚硫酸水溶液：取10％偏重亚硫酸钠Na2S2O5（或K2S2O5）20ml、1mmolL-1 HCl 20ml 和400ml纯水混匀即可。此液使用前配制，否则会因SO2逸出失效。（此液中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的相同）：
4.苏木精溶液常用的有5种，其中德拉菲氏苏木精染液(Delafield 苏木精染液)配法如下: 甲液（苏木精5g、无水乙醇30ml）
乙液（铵矾，即硫酸铝铵饱和水溶液：比例为1g硫酸铝：11ml水，用时配110ml,取100ml）丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。
配法如下：1.将甲液一滴一滴地加入乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约1周到10天；3.加入丙液；4.将混合液静置2个月至颜色变深为止（可过滤），此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保存使用，使用时可将染剂1份用3～5份蒸馏水稀释，则染色后分化更明显。
５．梯度乙醇溶液：100％，95％，90％，80％，70％，50％各两份。一份用于脱腊复
水，一份用于脱水。
６．二甲苯
7. 100%乙醇+二甲苯（1：1）
(二) 用具：
载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片
（三）材料：
土豆；小鼠肝细胞石蜡切片；
四. 实验步骤
（一）土豆切片的观察
制作土豆徒手切片→过碘酸处理15～30min →70%乙醇1min →schiff试剂15 min →亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→镜检
（二）小鼠肝细胞切片的观察
取鼠肝石蜡切片→二甲苯脱蜡约10min →二甲苯+100%乙醇（3 min）→梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100％，95％，90％，80％，70％，50％）中约2～3 min →过碘酸氧化15～30 min →蒸馏水漂洗→Schiff试剂15～30 min →亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→苏木精染色10 min →流水冲洗→梯度乙醇脱水（50％，70％，80％，90％，95％，100％），在各乙醇浓度中约2～3 min →100%乙醇+二甲苯2～3 min→二甲苯适度透明→指甲油封片→镜检
五. 作业
1、为所观察到的土豆切片和鼠肝切片绘图，标注其多糖的位置，并描述这两种细胞的多糖分布特点。
2、影响PAS反应染色效果的关键步骤是什么？
3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？
六．注意事项
1.过碘酸氧化作用时间稍长，会使反应更加充分。
2.Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过长将导致染色太深，也不利于观察。
3.二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气，后者以透明为准。如果片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。
4.试剂重复使用后，实验结果不明显（脱蜡不完全、染色不好等），因此在实验
要检查各试剂是否干净，如果污染严重，一定要更换。
实验四PEG法诱导细胞融合
一．实验目的
1.了解细胞融合的原理和过程；
2.初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。
二．实验原理
细胞融合，即在自然条件下或利用人工法(生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。
化学融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进行融合。商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞融合剂。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得融合体，融合效果好。
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。
三．实验用品
1．器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。2．材料：鸡血悬液；
3．试剂：
1）0.85%的生理盐水；
2）GKN液：8.0g的NaCl，0.4g
50%（m/V）PEG（37℃温浴）；
取50gPEG（相对分子质量＝4000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置37℃备用。
3）1%詹那斯绿B；
4)Hanks溶液（含NaCl，KCl, Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚红）
Hanks原液（10×）
NaCl 80.0g
Na2HPO4·12H2O 1.2g
KCl 4.0g
KH2PO40.6g
MgSO4·7H2O 2.0g
葡萄糖10.0g
CaCl2 1.4g
称取1.4g的CaCl2，溶于30～50ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按照上述配方水需，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可放入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已经溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000ml。
Hanks液：
Hanks原液100ml
重蒸水896ml
0.5％酚红4ml
配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。
四．实验步骤
1.鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:3~1:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细胞悬液，放入4℃冰箱内可保存3--4天；
2.取鸡血1ml，加入4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操作一次；
3.沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液，用Hanks溶液稀释沉淀，制成10%左右的细胞悬液，迅速在显微镜下观察细胞密度；
4. 取1ml上述细胞悬液，加0.5ml 50% PEG溶液，37℃水浴中进行细胞融合（30min左右）；
5.缓慢加入Hanks溶液，轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来（镜检），室温静置约20min;
6.取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；
7.镜检，观察细胞融合现象。
五．实验结果
1.绘出已融合的细胞形态图，描述你所观察到的细胞融合现象。
2.计算细胞融合率。
六．作业
1．请分析Hanks溶液的作用是什么（可以从其成分的角度来回答）？
2. PEG诱导细胞融合率受哪些因素影响？
3．你认为在进行细胞融合时，要注意哪些问题?
实验五电子显微镜
电子显微镜技术(electron microscopy)是细胞生物学学科建立的基础之一，也是细胞生物学不断发展、不断获取新知识的重要手段。电子显徽镜(electron microscope，EM)是以电子波作光源、电磁场作透镜、利用电子散射过程产生的信号进行显微成像的大型仪器设备。根据电子波照射样品方式的不同、利用电子散射信号的不同以及加速电压的不同等，可以把EM分为各种类型。针对各种EM又有多种与之相应的生物样品制备方法。其中，常规透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)技术和扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)技术是生物电镜常用的基本方法，故本节主要介绍TEM与SEM的基本结构特点、工作原理、仪器操作以及两种电子显微镜的生物样品制备技术，使学生初步了解有关电子显微术方面的知识。
一、透射电子显微镜
透射电子显微镜是发展最早、应用最广泛的电子显微镜,适用于观察研究组织、细胞内部的亚显微镜结构、蛋白质、核酸等生物大分于的形态结构及病毒的形态结构。配合样品制备技术或使用分析电镜(analytical electron microscope，AEM)技术，可以在超微结构水平上，对组织细胞内部成分进行定性定量的综合分析。
[目的要求]
(1)了解透射电子显微境的性能、结构及基本工作原理
(2)熟悉透射电子显微镜的使用范围。
[实验原理]
为了简单、形象地理解TEM，可以把它与普通光学显微镜加以比较，其主要差别是用电子波(电子束)代替可见光波作光源，用轴对称的电磁场作透镜。TEM的聚光镜把电子束聚焦并照射在样品上，带有样品结构信息的透射电子(transmission electrons。TE)进入成像系境，被各级成像透镜聚焦、放大后，投射在观察荧光屏上，形成透射电于显微镜像。如果把荧光屏移开，便可以拍照记录。
[实验用品]
(1)仪器：透射电子显微镜
(2)材料：具生物样品的铜网。
(一)透射电镜的结构
普通TEM由电子光学系统 (简称镜筒)、供电系统和真空系统三部分组成。TEM的镜筒(图1)是由电子枪，6—8级电磁透镜(electron magnetic lenses)及一些
图1 TEM镜简结构
光路元件组成的密闭圆筒，是TEM的核心。电子枪发射电子波作为“光源”，而电磁透镜则是由电流流过线圈产生的一个个磁场。当电子束穿过这些磁场时，磁场对运动电子的作用类似玻璃透镜对可见光的作用。根据每个磁场的功能并沿用光镜的称呼习惯，自上而下依次称为；聚光镜(2～3级)、物境，中间镜(2～3级)和投影镜。样品置于最后一级聚光镜和物镜之间。观察室和照相室在投影镜下方。TEM庞大的供电系统和真空系统是根据镜筒要求设计的,加速电压及透镜电流稳定度优于10-6，镜筒真空度优于1.3X10-7kPa。
(二)透射电镜的基本工作原理
一般生物样品的TEM图像，可以用“质量—厚度”(mass-thicknes,ρt) （“质量－厚度”,是描述样品性质的物理量，在TEM中,等于一微细结构点的密度ρ(μg/㎝3)乘以入射电子束通过该点的距离t(㎝)，单位是μg/㎝2，常记为“ρt”。）反差成像原理作简单描述(图2)。TEM镜筒内建立强加速场，生物样品常采用60～100kv
图2 TEM 散射吸收(“质量-厚度”)反差成像原理
的加速电压。电子枪阴极发射出的电子在加速场中获得速度和能量，足以透射过50～70nm 厚的生物样品并使之成橡。聚光镜使来自电子枪的电子束聚焦，并照射在样品上。此时，入射电于束与样品原子之间相互作用发生一种物理现象——电子散射(electronscattering)。在电子散射过程中，大部分电于直接透过样品，称为直接透射电子(transmission electron，TE),有一部分电子在穿透样品过程中不仅改变运动方向，而且可能还损失能量，这些 TE称为弹性或非弹性散射电子( elastically scattered electrons，inelastically scattered electrons)。样品结构的“质量—厚度”(ρt)越高，元素的原子序数越大，电子散射越强，TE中的直接透射电子越少，而弹性或非弹性散射电子越多。样品下方设计了一个30～80μm 的小孔，称“反差光阑”(contrast aperture)，拦截(吸收)掉散射强的电子，而使直接TE及部分弱散射电子通过。这样，能通过光阑进入成像系统的TE就带有样品上的微细结构信息了。相对质量—厚度高的结构区域，电子散射强，能通过“反差光阑’进入成像系统的TE少，反之。则多。这些TE经过几级成像透镜的放大，由末级投影镜投射到观察室荧光屏上，激发荧光屏发出可见光。TE多，屏亮，TE少，屏暗。屏上各点的亮暗程度一一对应着样品微细结构Pt的高低。这样，生物样品的透射电于显微图就形成了，其图像分辨率(resolution)比TEM的分辨本领(resolvingpower)差一个数量级。事实上，TEM成像机制，比上述复杂得多，尤其对原子尺度的透射电子显微成像，则必须用波的传输理论解释，相关理论和技术属于高分辨率电子显徽学范畴。
［演示教学］
(1)打开电源，抽真空。
(2)演示照明系统(电子枪+聚光镜)合轴。
(3)演示取放样品。
(4)演示加速电压选择、物镜光阑选择、观察区域选择、放大倍数选择、图像聚焦及拍照记录。
(5)观察动物切片和植物切片，了解动植物组织的超微结构。
(6)关机操作。
二、透射电子显微镜样品制备
TEM生物样品制备是20世纪50年代以后发展起来的。针对不同的观察目不同的材料，已有几十种不同的样品制备方法。如超薄切片技术、负染色技术、电镜细胞化学技术、免疫电镜技术、电镜放射自显影技术、真空喷镀技术、核酸电镜技术、冷冻蚀刻枝术及其他冷冻制样技术，同时尚有各种技术方法的交叉结合等，在TEM“质量—厚度”成像原理解释的工作范围内，任何样品制备方法，其样品都必须满足下述4项基本要求：①样品结构应有·质量’厚度”差异：②对“厚度”一致的样品，其厚度最好在50～70nm~⑧尽可能减少人工损伤及附加结构：④能耐受镜筒内高真空及高能量入射电子束，不变形，不升华。本实验仅就超薄切片技术进行演示教学。
[实验目的]
(1)了解对透射电子显徽镜生物样品的基本要求
(2)了解常规超薄切片技术的基本过程及原理。
[实验原理]
超薄切片技术是TEM样品制备最基本最常用的技术，其制备过程与石蜡切片有许多相似之处，即都包括：取材、固定、脱水、包埋、切片、染色等基本步骤不同的是：使用的试剂不同，对样品制备过程中各种条件的要求更严格、更精细。
[实验用品]
(1)器材：超薄切片机、制刀机、玻璃条、恒温箱、控温烤箱、冰箱、光学显微镜、磁力搅拌器、手术剪刀、眼科镊子、铜网镊子、量杯、量筒、烧杯、培养皿、注射器、吸管、青霉索小瓶、玻璃缸、载玻片、酒精灯、铜网、滤纸、牙签、睫毛笔、样品盒、包埋模具、医用胶布。
(2)试剂：o。2mol／LPBS、2。5％戊二醛、1％OsO4、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇、环氧丙烷、环氧树脂Epon8l2、DDSA、MNA，DMP—30、醋酸铀染液、枸橼酸铅染液，
(3)材料；动物或植物组织。
[方法与步骤]
(一)试剂配制
(1)0.2mol／L PBS：A液：磷酸氢二钠(Na2~HPO4·2H2O)35.61g加双蒸水溶解至1000mi，
B液：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2lg加双蒸水溶解至1000ml。
根据不同要求，按不同配比，可得不同pH值的0.2mol／L的PBS，见下表:
PH(25℃) 7.0 7.2 7.4 7.6
A液(m1) 30.5 36.0 40.5 43.5
B液(m1) 19.5 14.0 9.5 6.5
(2) 2.5％（动物）或4％（植物）戊二醛固定液：2.5％戊二醛固定液（25％戊二醛10ml, 0.2mol／L PBS 50 ml ,加双蒸水40ml）； 4％戊二醛固定（25％戊二醛16ml, 0.2mol／L PBS 50 ml ,加双蒸水34ml）。
(3) 1％四氧化锇(OsO4)固定液。
2％贮存液：将装1g0sO4的安瓿泡酸48h，冲洗后用双蒸水漂洗30min。干后用玻璃刀刻划1～2道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静置48h,OsO4溶解后4℃避光保存备用。
1％使用液：取2％Os04贮存液10ml，加o。2mol／L PBS10ml混合。
(4) 不同浓度的乙醇溶液；用无水乙醇稀释成90％、80％、70％、60％、50％的乙醇。
(5) 环氧树脂Epon812包埋剂(Luft配方)；
A液：Epon812 6.12ml，DDSA lOml
B液：Epon812 10ml，MNA 8。9ml。
使用时根据不同硬度要求按一定比例(1: 1～1:9)混合。A液多，则软。AB液混匀后，逐滴加入DMP—30，其浓度控制在1%一2%左右。边加边搅，充分搅拌30min。
(7)醋酸铀染液；醋酸铀(Uranlumacetate)溶于50％一70％乙醇溶液中至饱和，静置1—2d，使未溶的部分沉淀，取上部黄色透明溶液用，避光保存。
(8)枸橼酸铅溶液：A液：硝酸铅：(必须为新近产品)1.33g，枸橼酸钠1。76g，双蒸水<用前加沸冷却)30ml，充分摇匀，混悬液为乳白色构橼酸铅铬合物。B液：氢氧化钠(NaOH)lmol／L。
使用液：A液配制完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮(pHl2)。如有沉淀，离心后再用，最多保存半年。
(二)超薄切片制备
1. 取材
将动物处死后，要快速取出组织。以免细胞内部细微结构发生改变。取材过程要注意以下几点：①取材部位要准确：②无人工损伤，不要牵拉、挤压，⑧样品块要小，一般切成1mm的小块，起码在某一个方向上的厚度要小于lmm；④组织离开活体后尽快(1min之内)进入预冷的戊二醛固定液中(4℃)保存(图2-3)。
2.固定
固定是电镜样品制备中最重要的一环，其目的是使细胞生命过程立即终止，使细胞结构和化学成分保持生前状态。电镜材料固定一般采用双重固定法，即先用戊二醛进行前固定，然后再用饿酸进行后固定。两次固定之间要进行漂冼。
图2-3 超薄切片制备过程(参考Hall JL,1978)
(1)前固定：将取的材料立即投入预冷的戊二醛固定液（动物2.5％，植物4％）中，4℃条件下固定，若不马上进行后面的制备程序，可继续保存在4℃。
说明：戊二醛(glutaraldehyde)C5H8O2，分子量为100.12，是一种五碳双醛，市售浓度多为25％水溶液，无色透明，pH 4.0～5.0。氧气、高温，中性或碱性均可使其失去醛基，应低温、密封保存。两个醛基与蛋白质，核酸等的氨基发生交链作用，可以较好地固定蛋白质、核酸和多糖等，能保存微管、糖原、核蛋白和细胞基质等，不易使酶失活，可以用于细胞化学研究。但不能固定脂类，对脂质颗粒、膜结构等保存不好。如果对保存超微结构<尤其膜系统)有较高的观察要求。经戊二醛溶液单固定的样品不宜保存过长时间，在1周内进入常规制备程序为好。
(2)锇酸后固定，进行后固定以前，材料要用0.1mol／LPBS漂洗3次，每次 lOmin。避免戊二醛与O S O4发生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。漂洗后取出，转入l％OSO4固定液中，4C条件下固定1～2h。
说明：四氧化饿(O S O4)分于量254.2，呈淡黄色结晶，其水溶液呈中性。对氮有较强的
亲和力，能与蛋白质氨基迅速结合形成交链化合物，对含蛋白质的各种结构成分均能固定。能与不饱和脂肪酸反应，生成四氧化饿二酯化合物，使含有脂类的结构固定。因为饿是一种高原子序数元素，在用O S O4固定样品的同时，还起到一种电子染色作用。但是，O S O4不能固定核酸，对糖原、微管等保存不好。同时，O S O4又是酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究。O S O4固定时间太长，不仅易丢失成分，而且会使组织变脆，难切片。O S O4具有极强的挥发性和毒性，在任何污染和光照条件下，都可能还原成水和二氧化物而减弱固定效果，故不易长期保存，呈棕色或黑色时，均被认为失效。1％O S O4,固定液对组织的有效渗透深度为0.5mm，深度内有迅速均匀的固定，稍大的组织易形成固定梯度。
3.脱水
(1)将OsO4固定后的材料取出，在脱水以前要用0.1mol／L的PBS漂洗3次，每次10min。以避免在脱水时OsO4与乙醇产生氧化还原反应，生成沉淀，所以要彻底洗干净。
(2)将漂洗后的材料依次放入50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇2次，每级15～20min，环氧丙烷2次，每次15～20 min使组织中的水分充分除去。
说明：脱水剂一般用乙醇、丙酮和环氧丙烷等，利用它们具有能与水也能与包埋剂混溶的特点，以取代样品中的水分，使水分充分除去。浓度梯度脱水是为了减少样品收缩。
4.侵透
经脱水后的材料在包埋以前要经过浸透处理，即用包埋剂与脱水剂按浓度梯度分级换液，使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织中去，最终使组织细胞内所有空隙均充满包埋剂。
具体操作方法；在室温下或37℃条件下将样品置入3：1的100％环氧丙烷溶液与包埋剂的混合液1—2h；1 :1（1—2h）；1:3（1—2h），纯包埋剂过夜。
5.包埋
包埋的目的是让样品材料获得一定的硬度、弹性和韧性，以便制成超薄切片。操作过程如下；在包埋模具内滴一滴包埋剂，把样品置入并使之定位于合适位置(依模具而异)，缓缓注入包埋剂，然后放入烤箱中进行聚合(使包埋剂固化)。控温及时间依次为：37℃l2h；45℃12h；60℃24h。
说明在包埋过程中，充分浸透的样品包埋在包埋剂中，加温使包埋剂逐渐由单体聚合成高分子，样品及包埋介质获得高度的稳定性、均匀性、合适的硬度和弹性。
EponSl2是一种优良的包埋剂，为进口环氧树脂(epoxyresin)；DDSA（dodc-
cenyl sueelnleanhydride)为十二烷基琥珀酸酐，是一种软化包埋块的长链脂肪族分子；MNA(methyl nadicanhydride)为六甲酸酐，可以硬化包埋块；DMP—30为二甲基氨基甲基苯酚，可以加速固化。
6.制备超薄切片
制备超薄切片的主要步骤有：修块(包埋块粗修)，制备玻璃刀、制备支持膜、半薄切片、修块(包埋块细修)、制备超薄切片。
(1)包埋块粗修；在对包埋样品进行超薄切片之前，先要粗修包埋块，机修、手修均可。一般可在解剖镜下先小心地把块顶端的包埋介质修去，暴露出组织，再把样品四周修成锥体形，顶面修成梯形。
(2)玻璃刀的制备；超薄切片常用玻璃刀或钻石刀。玻璃刀要用含72％～75％二氧化硅、5—8mm厚的硬质玻璃，并在专门的制刀机上制备。制备好的玻璃刀还要在刀刃背部用胶布或胶带围成一个水槽(钻石刀水槽是固定的)，用石蜡封固，以方便切片的收集。
(3)支持膜的制备：通常用铜网做超薄切片的载网，类似光镜下载玻片的作用。电镜细胞化学样品则需要用镍、铂、金、不锈钢或尼龙网等。载网直径一般为3mm，厚20～50μm，网孔数量1～400目不等，形状多种多样。网上一般要覆盖一层支持膜，膜的厚度约10～20nm，以防止漏片、卷片，加强切片的稳定性(较大的切片最好不用支持膜)。常用支持膜为Formvar 膜(聚乙烯醇缩甲醛膜)或者火棉胶膜，也可用碳膜等。
(4)切片：切片可分两步进行。
半薄切片：先将粗修好的包埋块在超薄切片机上切成厚o。5～1μm的半薄切片，用甲苯胺蓝染色或亚甲蓝、天青B和碱性品红染色后，在光镜下观察。其目的是：
①可以根据半薄切片精确定位，准确保留超薄切片位置，避免丢失有价值的结构。
②了解样品包埋质量，以确定是否继续做超薄切片，⑧半薄切片可以得到比一般石蜡切片更清晰的图像，所以便于进行定量形态学分析，而且可与超薄切片对照观察研究。
超薄切片：超薄切片用超薄切片机完成。根据推进原理，切片机分为热膨胀式和机械推动式两大类。TEM常规超薄切片厚度最佳值为50～70nm，观察干涉色可以判断漂在刀槽里的切片厚度，以便确定用铜网捞取哪那些切片。超薄切片要求在防震、恒温和无较大气流流通的环境下进行，否则会影响切片效果。
7.电子染色
电镜观察时，切片需具有一定的反差，故常用重金属盐染色，也称电子染色。常用的重金属盐有铀盐和铅盐，
(1)醋酸铀可与大多数细胞成分结合，尤其易于与核酸结合，不易出现沉淀。但铀盐见光分解，应避光染色。用醋酸铀染液染20～30min后，先用双蒸水漂洗，再用滤纸吸千。
(2)铅盐易与蛋白质、糖类结合。因为铅盐与二氧化碳反应生成碳酸铅沉淀，所以防止铅污染至关重要。用枸橼酸铅染液染10～15min，立即用双蒸水漂洗，自然干燥后观察。
说明：几十纳米均一厚度的生物样品，大都是由碳、氢、氧、氮等低原子序数物质组成的结构，在TEM下很难获得“质量—厚度”反差成像。尽管在OsO4固定时，形成了一些结构间的“质量—厚度”差异，但不足以造成清晰的高反差像。所以，“电子染色”是非常必要的。它利用重金属盐(铀盐和铅盐)与组织细胞内的微细结构发生不同程度的结合，提高结构间的‘质量—厚度’差异，进而造成电子散射的强弱对比，以形成高反差透射电子显微像。故从某种意义上可以认为，一幅透射电子显微图则是电子染料分布图(图2—3)。
［作业］简述TEM样品制备过程和各种处理的作用
三、扫描电子显微镜
扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)适于观察各种样品的表面形貌。在生物方面，SEM适合于观察研究组织、细胞表面或断裂面的三维立体显微及亚显微结构。配合适当的样品制备技术或者分析技术，可以对组织、细胞表面或断裂面的成分进行定性定量的综合分析。
[目的要求]
(1)了解扫描电子显微镜的性能、结构及基本的工作原理
(2)了解扫描电子显微镜的使用范围。
[实验原理]
SEM的分辨本领虽然不如TEM，但却具有很强的立体感，可以在亚细胞水平上生动地显现生物样品的三维结构。与TEM相同的是都采用电子束作光源，电磁场作透镜。所不同的主要是电子束、电子束照射样品的方式不同，被利用来成像的信号电于不同，而且所有的透镜都位于样品的上方，在SEM镜筒中，经多透镜聚焦形成极细的电子束(比TEM中细三个数量级以上)，逐点逐行地在样品表面上扫描，被激发产生的样品表面二次电子信号，通过收集、转换、放大，在观察及照相荧光屏(CRT)上同步地被扫描。在这里，使二次电子信号仅仅与形貌参数有关，便在CRT上得到样品表面形貌的立体图像。同时可以进行拍照记录。
[实验用品]
(1)仪器：扫描电子显徽镜(SIEMENS—AUTOSCAN)。
(2)材料：制备好的扫描样品。
[内容与方法]
(一)扫描电镜的结构与工作原理
SEM由电子光学系统(镜筒)、扫描系统、信号检测及显示系统、供电系统、真空系统五部分组成(图3)。其中，镜筒是由电子枪和几级电磁透镜和样品室组成的。
图3 SEM结构