Western blot 的详细操作步骤
一．蛋白样品的提取
1.先从-80°冰箱内取出sham 1d/3d组，SAH+PBS 1d/3d组，SAH+SP 1d/3d组，
SAH+Tregs 1d/3d组脑组织样品(区分脑皮层，海马区)，并对这四种样品进行编号
样品1,2,3,4,等脑组织在室温下复温后，用预冷的PBS将脑组织表面的血性物质冲
洗掉，并用吸水纸吸掉组织表面多余的水分，然后分别把样品1,2,3,4放到预冷的
培养皿1,2,3,4中，分别用眼科剪刀1,2,3,4将脑组织分别剪成一个大块以及几个小
块。然后分别将样品1,2,3,4称重，每个脑组织样品秤取500mg(可变化)并分别装入
2ml的预冷的EP管中，同时把匀浆器（编上编号）置于冰盒内预冷。
2.按照每250mg脑组织加入1ml的RIPA的比例加入对应量的RIPA于盛有脑组织的
EP管1,2,3,4中，同时按照裂解液：cocktail=1:500的体积比加入cocktail(我们有现
成的试剂)（一种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶降解蛋白），然后用眼科剪刀（注意：
不同的样品用不同的剪刀，提前把剪刀编上号1,2,3,4）将脑组织剪碎，尽量剪的碎
一点以利于下一步的匀浆。
注意：这一步的处理过程要在冰盒中进行以抑制蛋白质的降解。
3将已经剪碎的EP管1,2,3,4中的脑组织倒入对应序号的匀浆器1,2,3,4中，在冰上匀
浆脑组织，直至匀浆液变得无颗粒（大致用30min，最少是1次/分钟，尽量多匀浆几
次）。
4.匀浆结束后，用1ml的移液枪将匀浆好的脑组织匀浆液从匀浆器中转移到对应序号的
预冷的EP管1,2,3,4（提前将要用的EP管编上号1,2,3,4并置于冰上预冷）中.每个样
品转移2ml样品匀浆液。
5. 先将盛有脑组织匀浆液的EP管配平(移液枪吸取等量)后，将其放入离心机内，4℃
离心，18000 rpm 20min。
6. 用移液枪从分层后的液体中抽取上清液(大约吸取0.5-1ml)，并转移到在冰盒中预冷的另
外4个EP管1,2,3,4中，保存上清于-80度冰箱内直至使用。
二，Western blot之蛋白定量（蛋白浓度测定）
采用96孔板法
（1.）试剂如下表配置
1 2 3 4 5 6 样品1 样品2 样品3 样品4 BSA（ul）0 2.5 5 10 20 25
ddH2O/PBS(ul) 25 22.5 20 15 5 0
MIX(A：B=50:1) 200 200 200 200 200 200
OD562平均值
Config(ug/ml) 0 50 100 200 400 500
注意：样品BSA栏中加入稀释后的样品25ul，根据样品稀释倍数来决定PBS与原液的比
例，最后保证加入的样品总体积达到25ul。
（2）将表一配制的溶液加到96孔板中，每个浓度的标准品以及样品都另设1-2个复孔。
（3）将96孔板37°干燥30min.
（4）将96孔板放入酶标仪中，490nm/630nm波长处测定吸光度值(BCA法预实验表明，490-630nm广谱测数据后，计算蛋白浓度基本一致)。
（5）根据得到的标准曲线和样品的OD值计算样品的浓度。
三．WESTERN BLOT 样品处理
1.按照每30μl蛋白样品加入10ul上样缓冲液的比例（就是将4xloading buffer稀
释4倍）来使用。
如果4xloading buffer中不含有DTT就按照4xloading buffer：DTT=4:1的比例加DTT.
2.混匀后，100°水浴加热5-10分钟（8分钟即可），使蛋白变性。
注意：水浴时，将盛有样品的EP管置于“浮子”上，要保证蛋白液面在水浴液面之下，以及EP管的底不要接触到水浴锅的底。一定要保证水开后（开始沸腾后）再把盛有样品的EP
管放进去。
3．水浴结束后，从水浴锅内取出EP管，迅速置于冰上，至温度降下来后再将EP管放到-20°或者是-80°冰箱内备用。如果后续工作准备就绪，也可以将EP管从水浴锅内取出冷却至室温后，14000rpm离心5分钟，取上清直接上样电泳即可（EP管内样品呈紫蓝色，只有底层有少量的沉淀，上清占大部分）。
四．Western blot之聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
1.1. 清洗玻璃板：双手戴乳胶手套，一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗（注
意玻璃板周围的擦洗，容易被忽略）。两面都擦洗过后用自来水冲，再用洗瓶蒸馏水冲洗干净后用电吹风吹干。
2.灌胶与上样
①.玻璃板对齐后放入夹中卡紧（要保证两块玻璃板的下缘平齐，尽量往下压玻璃板使其
与底部的海绵垫充分接触以免漏胶），然后垂直卡在架子上准备灌胶。
②.对于MMP-9，灌注8%的分离胶，对于Active caspase-3，灌注12%的分离胶。
50ml的烧杯1配制8%的分离胶，10ml的配方以及加入的顺序如下：
5.3ml的超纯水---2.5ml的1.5M的Tris(PH=8.8)--- 0.1ml的10%的SDS--- 0.1ml
的10%的过硫酸胺---2.0ml的30%的丙烯酰胺---最后加入0.008ml的TEMED.
50ML的烧杯1配制12%的分离胶，10ml的配方以及加入的顺序如下：
3.3ml的超纯水---2.5ml的1.5M的Tris(PH=8.8)--- 0.1ml的10%的SDS---0.1ml 的10%的过硫酸胺---
4.0ml的30%的丙烯酰胺---最后加入0.004ml的TEMED.
③加入TEMED后立即摇匀（可以用枪吹打均匀）即可灌胶，灌胶时，用1ml枪吸取1ml
胶沿玻璃板的一边加入（灌胶时开始可以快一点，胶面快到所需高度时要放慢速度，而且操作时胶一定要沿着玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡），待到胶面升到绿带中间线高度时即可（分离胶的高度要保证灌完浓缩胶，插梳子后梳齿的下沿不要接触到分离胶的上缘，
要保持一段距离），然后在分离胶上加入异丙醇封胶（加异丙醇封胶时要慢，），1-1.5个小时后（在异丙醇和胶之间会有一条折射线出现，这就说明胶已经凝了）倒掉异丙醇，用自来水先反复洗涤10遍，然后用超纯水洗3次（因为异丙醇为有机溶剂，要洗到油光消失），
最后用条状定性滤纸将残留的超纯水吸干。
④配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
用50ml的烧杯2配制5%的浓缩胶溶液，6ml的浓缩胶的加入的顺序如下：
4.1ml的超纯水---0.75ml的1M的Tris(PH=6.8)---0.06ml的10%的SDS---0.06m10%过硫酸胺---1.0ml 30%丙烯酰胺---0.006ml TEMED
加入TEMED后立即用1ml的移液枪吹打均匀即可灌胶。
⑤.灌胶时用1ml的移液枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！将剩余空间灌满
浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。（插梳子时要使梳子的一边先插到位，再缓缓将梳子的另一边压下去）这样可以避免气泡的产生。
⑥. 在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，待到浓缩胶凝固以后，大概需要1-1.5个小
时，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。（注意：拔梳子的时候双手平衡用力将梳子平行拔出，不要把孔拔歪）。
配方：5×电泳缓冲液
Tris 30.2 g
甘氨酸188g
SDS 10 g
溶解后用浓盐酸调pH至8.3，用超纯水定容至2L,室温保存。
电泳液的配制：用5xTris-甘氨酸电泳缓冲液（索龙宝公司的500ml每瓶）
100ml+400ml单蒸水配成500ml的1xTris-甘氨酸电泳缓冲液。
⑦加足够的电泳液后开始准备上样，电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板，槽外的电泳液面
至少要达到玻璃板下缘以上（也就是必须没过玻璃板的下缘），形成一个电势差,(如果电泳过程中内侧液面下降，可以暂停，补电泳液)。
⑧上样：因为我们的梳子是0.75mm的，所以每个加样孔加入20ul的蛋白样品即可(上样量可变化，10、15、20)，2-20ul 上样枪头，样品孔每孔20ul样品，marker（SM0671货号）上样3ul并用1×loading buffer 补齐到20ul，空孔用20ul 1×loading buffer补齐。
具体操作：用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样时不要太快，以免样品冲出污染周围的加样孔。
⑨电泳：接好电源，先用80V电泳30min使溴酚蓝到达浓缩胶和分离胶分界线后，换电压至110V（大约是200mA）跑2-3小时（若蛋白分子量过大可以将电泳时间延长），跑胶时间视所要检测蛋白质分子量而定，根据Marker条带判断你要的蛋白大概跑到了胶的哪个位置，让其跑到胶的中下部分才停止电泳。
五．转膜
转膜之前先配制电转膜缓冲液：取10x电转液(不含甲醇和SDS)100ml+甲醇200ml+单蒸水700ml.共配成1000ml的液体。
也可以按如下方法配制
5×转膜缓冲液
甘氨酸150.149g
Tris 30.28g
溶解后用浓盐酸调pH至8.5，用超纯水定容至2L，室温保存。
1.先要准备4张滤纸(3个whatman 3mm的特殊滤纸---可以重复利用)和1-2张硝酸纤维素膜主要在膜的正面的右上角剪角（与胶的张数对应）：切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的
蛋白会污染膜。然后将切好的硝酸纤维素膜置于盛有转膜缓冲液的培养皿中上浸20min才可以使用，用镊子捏住膜（marker标记区，避开蛋白条带）的一边轻轻置于有转膜缓冲液的平皿里2. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬
应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿小玻璃板便开始松动，直到撬去玻板，注意要把胶留在下面的大玻璃板上。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），并在下面的玻璃板的两边用绿色梳齿轻轻切两下，让胶和大玻璃板分开，然后将大玻璃板放到盛有转膜缓冲液的培养皿中把分离胶泡下来（分
离胶最后一道上角切角，以marker为第一道）。
3.准备三个盛有转膜缓冲液的直径10cm的培养皿，一个培养皿里放入转膜用的夹子，两块
海绵垫，一支玻棒，4张滤纸，另外两个培养皿分别放1张浸过的膜和玻璃板上撬下来的胶（几块胶用几块膜）。
4.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，再依次垫两张滤纸，然后用玻
棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一只手要压住垫子使其不能随便移动。），然后从培养皿中取出胶放在滤纸上上（要保证放正），在将膜从另一个培养皿中取出与胶对齐放好（保证膜与胶的左上角及其两个边都要对应好），用绿色梳子分别将胶和膜压一遍，保证
它们与它们的下一层紧密接触，然后盖上一层滤纸，用玻璃棒再擀一遍(力气可以稍微大一点)，再盖一张滤纸再擀一遍，最后盖上最后那层海绵垫，合上夹子，在整个操作过程中要注意将膜，胶，海绵垫尽量对齐，以方便下一步将其放入转膜槽中。
注意：整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡，还要注意膜和胶的相对位置---膜正胶负，蛋白由负极的胶上转移到正极的膜上。
5.将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，合上转膜槽后，将整个转膜装置放到冰水中来降温（我们是把转膜装置放到盛有冰水混合物的塑料盆里）。用100V（200mA左右）的电压转膜 2 -3h。
六．免疫反应
特别注意：目的蛋白（17KD和92KD）和B-actin （分子量42KD）孵育一抗和二抗时不可以同时在一个培养皿中孵育，可以根据MARKER把不同分子量的蛋白剪开后分别孵育(不同的培养皿)。
具体就是：把MARKER点在第五道，转膜结束后将膜剪开，分别把分子量42的B-actin 和目的蛋白（17KD和92KD）分开，以利于后续分别孵育一抗二抗。
配方：10×TBST溶液
Tris 48.4g
NaCl 160g
溶解后用浓盐酸调pH至7.6，用超纯水定容至2L，室温保存。
TBST配方：用之前先将TBST稀释成1x的TBST, 1XTBST 1L加入1ml的tween-20.(1:1000，TBST中的最后一个T是TWEEN-20的意思)
1.转膜结束后断开电源，拆卸转移装置，取出硝酸纤维素膜置于直径10cm的玻璃培养皿
中，如果是多个膜，尽量一个培养皿中放一张膜，以防染色不均，然后每个培养皿中均倒入适量的丽春红染液看下转膜效果(大概需要20min)。然后将丽春红回收(用5ml的移液枪)后，往培养皿中加入适量TBST洗涤10min（把培养皿放到摇床上进行，将丽春红色洗掉即可）。
2.封闭液配方：TBST溶液+5%脱脂奶粉(质量体积比：在天平上秤取5g脱脂奶粉融到100mlTBST溶液中，用量筒配制即可)。
将硝酸素纤维膜用封闭液室温封闭2h（或4°冰箱摇床上封闭时间长一些）。封闭结束后，将封闭液倒掉，加入适量的TBST,在摇床上洗涤8min 1次。
3.一抗配方：TBST溶液+5%BSA+一抗(β-actin 分子量42)
具体的配制方法：如果需要配制16ml一抗溶液，可以如下配制15.68ml 1xTBST溶液+0.8gBSA+160ul NaN3+160ul NaF+8ul β-actin+8ul 待测蛋白的一抗；如果一抗的总量有变化可以按此比例变化，把配好的一抗倒入直径10cm的培养皿中，然后从洗涤膜的培养皿中取出膜，将两张膜背靠背贴上，然后将之放入盛有一抗稀释液的培养皿中，并将培养皿放到4度摇床上，孵育12-14h。
购买BSA: solarbio公司
size:10g;
from sigma A7030;
Cat NO.A8010
3. 一抗孵育结束以后，将膜从盛有一抗稀释液的培养皿中取出放到另一个干净的培养皿中，并往培养皿中加入适量的1x TBST（是培养皿大小定，约15ml-80ml），然后将洗涤用培养皿放到摇床上，而盛一抗的培养皿放到-20度保存以备下次使用（一抗可重复使用）。
室温下，洗涤3次，每次10min （摇床上进行，NE膜在缓冲液中来回缓慢晃动）。
4. 二抗的配方：TBST溶液+5%脱脂奶粉+二抗
具体的配制方法：100ml的1x TBST+1g脱脂奶粉+5ul二抗，如果需要多配制二抗溶液可以按此比例增加（二抗不用重复利用，不加抑菌试剂NaF和NaN3）。液体混匀后将之倒入直径10cm的塑料培养皿中，将洗涤后的膜放进去，室温摇床上用二抗孵育2h。（中间孵育
1小时时，把膜翻个面继续孵育另一个小时）
二抗之后，用TBST洗膜3次，10min/次,洗涤结束后可以把膜用TBST浸泡着放到4°冰箱等着显影。
七、显影
用Western blot荧光显影试剂盒到暗室显影。
显影具体步骤：整个操作之前一定要带上乳胶手套再进行下一步的操作。
（1）取一支1.5ml(10ml按比例增加，)的EP管，将ECL发光试剂中的A液：B液按照体积比1:1 的比例配制（此处要根据膜的大小来决定配制多少体积的 A.B混合液---要保证ECL发光试剂可以铺满你的膜。预实验时配制了400ul(AB各200ul)的混合液），混合液的配制可以在光亮区。
⑴在暗室内，取出三个大培养皿，分别倒入显影液，定影液和TBST
⑵取出X线光片，先在一个角上减掉一个小角（这个角要与膜上的小角对齐），比对着膜大长和宽用剪刀剪适当大小的膜出来（注意：剪的X线光片要比膜的长和宽均大一些）
⑶打开暗盒，把X线光片放到膜<要保证是膜的正面朝上，也就是用圆珠笔写字的反面朝上>（此时的膜要护在高级护卡膜或保鲜膜里面，膜的上下均要垫上保鲜膜）的正上方。
注意：这一步中往膜上放X光片时，一定要一步到位，一旦放上就不要再移动，不然可能会出现多条显影带。
⑷刚开始时，先把红外灯关上，观察有没有发光物质出现，如果有，则说明效果不好，很难比较出各条带之间的差异，如果没有则把红外光打开并把暗盒的盖子盖上，开始倒计时大概到1-2分钟时，打开暗盒的盖子，把X光片放到显影液中显影。如果仍然没有显影，则重新剪一张X线光片放到膜上重新染，时间可以稍微长一些（可到10min左右），具体染多久根据上次染的的荧光强度再另外调整（上次染得荧光强度过强这次就染得短一些，若荧光强度太弱就延长一些时间）。
⑸时间到后，立即打开暗盒并取出X线光片放到显影液中,夹住X线光片，轻轻摇动几次，这时可见条带慢慢呈现出来。
⑹X线光片条带足够清晰时，取出来放入水中漂洗干净。
⑺漂洗干净以后，将X线光片放入定影液中定影即可。
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 （一）蛋白样品制备 培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 （二）SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样 （3）电泳 （三）转膜 （四）免疫反应 （五）化学发光，显影，定影 （六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
westernblot原理及步骤 Western blot基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2 有机溶剂提取法； 3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题：
1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2．Western 印迹 在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1）裂解细胞或组织 a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体， 加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。 b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。
实验基本步骤 提取细胞蛋白 ↓ BCA定量 ↓ 制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶) ↓ 蛋白样品变性 ↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ ＴBＳT洗涤 ↓ 二抗 ↓ TBST洗涤 ↓ 显影 ↓ 结果分析
试剂配制 １。PBS磷酸盐缓冲溶液1L 磷酸二氢钾0、24g 磷酸氢二钠 1.44ｇ 氯化钠 8ｇ 氯化钾 0。2g 加入50０mｌ纯水,调PH=7、2 定容至1L,高压蒸汽灭菌 ２。PBST(PBS+０、05%吐温—2０) 5０0ｍｌPBS+0。２5ml吐温-２0 3。电转液50０mｌ Ｔris １。5g 甘氨酸 7。2ｇ ４０0ｍl水溶解 加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷 ４.电泳液(1Ｘ) 1０x稀释,５０ｍl1０ｘ电泳液+450ml纯水 5.TBS 6。TBST(TBＳ+0。05%吐温－20) 5０ｍlＴBS+４50ｍl纯水+0.25ml吐温-2０
7、封闭液 ＴＢＳT1X＋５%奶粉 4０ml封闭液=4０mlTBST＋２g奶粉,40℃预热 ＷB实验 一、蛋白样品制备 准备:一管细胞,PBＳ(４℃预冷),PMSF(1０0ｍM),移液枪(1０00ul,１0ul),1、5ｍlEＰ管2个,高速冷冻离心机4℃预冷 1.于—2０℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液 2.加入1mｌ4℃预冷得PBS(0、0１M ｐＨ７。２～７、3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,８0００r离心５ｍin,然后弃去上清、重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。 3、按1ml裂解液加10 μlＰMSＦ(100 mM),摇匀置于冰上。(ＰMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) ４.在样品中加入3００ul含PMＳF得裂解液,吹匀,于冰上裂解30 ｍｉn,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动、 5.裂解完后,于4℃下1２000 rpm离心5 miｎ。 7.将离心后得上清分装转移倒0。5 ml得离心管中放于－20℃保存、 二、蛋白含量得测定(BCＡ定量) 准备:96孔板,移液枪(10０0uｌ,10ul,２00ul),ＢCA工作液(A+Ｂ),５０mlＥＰ管,１xPＢS,BＳA标准液 1.将９6孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈得孔最好不用) 2.算好孔数(总得)每孔加２0０ｕlBCA工作液(Ａ+B),(A液:B液＝50:1,一般配多些,如６０孔,A液12000ｕl,B液2４0ｕl) 3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20uｌ样品(2uｌ样品+１8ulPBS,即稀释10倍),
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
Western实验步骤 ????Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) ????可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(///)。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用。
Western Blot原理、显色分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59) 标签：western blot显色教育 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 二、操作步骤： (一) 配胶 1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。 2、封胶： 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有
westernblot原理及步骤 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。 一、Western Blot的原理 Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、操作步骤 （一）蛋白质样品获得： 1.所需试剂： (1)蛋白酶抑制剂mix： hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度 *PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM *Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml *EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM *EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mM Aprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml Pepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/ml Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/ml Benzamidine 100mM 250ul 5mM NaF 5M 250ul 250mM NaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM 注意：*代表必须加的试剂 (2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。 配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。 （3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入） 也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)；100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1. 裂解 1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml 裂解液，加20μlPMSF 混匀 2) 称取30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入600μl 上述1中液体（加入液 体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2. 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s ，两次（间隔5s ），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室） 1) 自带1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超 纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5. 保存 变性结束 AP 管盖放一然后4℃1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2. 配制分离胶 1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl （白色枪头） 2) 10%分离胶的配置：（用50ml 烧杯。板配块胶，板配2块板） 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3. 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4. 水封
转膜（Trarsmembran） 1 转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2 转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： p 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； p 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； p 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 几种膜的性质对比 PVDF膜NC膜尼龙膜 背景低低较高蛋白结合能力100-200 μg/cm280-100 μg/cm2>400 ug/cm2 机械强度强干的膜很脆软而结实 溶剂抗性强差差
WB实验的基本原理及操作流程 【实验原理】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要 标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的 蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决 定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单 个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下， 每克多肽约可结合 1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩 于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之 后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 【常用试剂】 1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1.裂解 1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀 2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3.离心（在基础4楼416室） 1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4.变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： S5 00：10 S5 100．0 00：10 温度时间（时： 5.保存 变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用 WB实验步骤
1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 2.配制分离胶 1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris?HCL 10%SDS 150μl AP（催化剂促凝作用） 150μl TEMED 9μl 3.灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封
WB的原理操作及注 意事项
WB的原理、操作及注意事项 原理： 经过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，经过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常见此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常见于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。 2.Lowry法： 此法是双缩脲法的进一步发展。她的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受她们的影响更大，硫醇和许多其它物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须马上搅拌，以使磷
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 深圳子科生物技术部主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术： 一、原理 与 Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固 相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显 影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广 泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验 条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，
N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和 48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于 40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到 100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱 制备，再用HCL调节PH值，而不用 Tris.CL。 5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形 成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘 油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝 1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。 7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS， 用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。 8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、 5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。