4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。
4.2 菌种代号
国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003
4.3 传代和接种
4.3.1 菌种冻干粉复苏
4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。
4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。
4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。
4.3.2菌种斜面传代操作
4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
4.3.2.3堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。
4.3.2.4取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。4.4菌种的培养与保存
4.4.1 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天
4.4.2 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。
4.5 菌悬液的制备
4.5.1 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。
4.5.2 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只刻度吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中混匀，为10-2......以此类推，稀释至含活菌数在50-100个。用平板计数。
4.5.3 此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。
4.7 记录 4.7.1 传代和接种使用后，应做好《菌种传代接种记录》。
4.7.2 菌悬液制备后，应做好《菌液制备使用记录》。
依据: 中国药典2015年版二部及菌种使用说明书
1.标准菌的来源
标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及
菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.
液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.
3.3操作步骤：
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。
菌种的传代保藏过程
3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：
（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。
菌种斜面的培养、保藏条件及时间
注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。
废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行记录。
菌种的复苏传代及保存标准程序 目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 1.1冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。 1.3冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。
菌种传代与复苏 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作
培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。
菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而
4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
借用一下 标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理 介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤： a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源 标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、
余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 3.4菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 3.6菌种的传代与保藏
菌种传代与复苏
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用 说明书 导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对https://www.doczj.com/doc/875243748.html,的支持! 依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 1 CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。储存于2, 8 ?，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 2 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤: a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂)。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5,0.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌 3 种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30,35?，培养18,24小时;真菌培养温度23,28?，培养3,5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1,2滴滴在改良马丁琼
菌种传代与复苏 （实操） 一、菌种传代与复苏 1.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 1.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 1.3 传代和接种 1.3.1 菌种冻干粉复苏 1.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 1.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 1.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 1.3.2菌种斜面传代操作 1.3. 2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种 菌种冻干粉复苏 把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，
将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 菌种斜面传代操作 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一
菌种传代与保藏作业指导书 1、标准菌得来源 标准菌株必须购买具备资质得菌种保藏中心提供得冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2、标准菌得验收 从菌种保藏中心购买得原始菌种管就是玻璃安瓿装得冻干菌，接收同时应检查就是否有随菌种附有得相关资料。接收菌种时应检查安瓿得数量与名称，与每一支安瓿得完整性。在相应得菌种接收记录上记上所有得关于菌种得信息，如名称、数量与接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入得0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买得已接种好得菌种斜面（3代）应检查菌种管就是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3、标准菌得复苏、复壮及标准储备菌株得制备 3、1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3、2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮、 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、
乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 3、3操作步骤： a、打开洁净工作台。 b、在安瓿得外表面用75%得酒精擦拭并让其自然风干。 c、用一小砂轮在安瓿得上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d、以无菌方法用一无菌吸管从已准备好得上述液体培养基中移取0、5～0、8 ml到安瓿中。 e、轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种与液体培养基充分混合并完全溶解。 f、用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应得液体培养基。 g、根据安瓿上所标明得不同菌种类型而将其培养于相应得温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察就是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h、取经复苏后得上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后得菌种中加入100ml20%得无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应得确认。其
菌种得复苏传代及保存标准程序 目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、 范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、 职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。 内容: 菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。 １.菌种得复苏 1.1冻干菌种得复苏 检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1．１.１准备: ①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。 ③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。 1.１。2操作: 1。1。２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、 1.1.2。2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。 1.1。2。3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。 １．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1．1。2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将 冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液
划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1。2。6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。 １。1.2。7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。 １、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。 1.２.1准备:①冻存保护液(４0%无菌甘油)及灭菌冻存管、 ②细菌冻存液:由液体培养基与冻存保护液按1:１比例混匀制成。 1.２．２按1.１、２。1～1、1.２。４操作,将冻干菌复溶后,吸取菌悬液加入到细菌冻存液中,混匀。 １。２.3按1mｌ/管得量分装至灭菌冻存管中,密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-２0℃或－80℃条件下冷冻保存。 １.2.４制备第２代冻存菌悬液时,可用接种环直接刮取第１代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长得纯菌落,再接种至细菌冻存液中,混匀后按1.２。3冻存。 1。3冻存菌悬液得复苏: 1.3．1准备: ①用具:灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基:根据菌种得特性选择适宜得液体培养基(如营养肉汤培养基10mｌ、硫乙醇酸盐流体培养基１2ml或改良马丁培养基1０ml等)、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液:75％酒精、０、1%新洁尔灭或84消毒液等、 1。3。2操作: 1。3。２。１从低温冰柜中取出菌种冻存管,室温下放置使其自然解冻。1．３。２、2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台、 1.3．2、3用75％酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁,稍干。 1.3. 2.4点燃酒精灯,在火焰旁打开菌种冻存管盖,用一支灭菌滴管吸取解冻得菌悬
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。 2.2 穿刺接种
菌种验收、传代与保藏作业指导书 1.目的 为确保菌种管理的正确操作性，制定本作业指导书。 2.适用范围 适用于实验室各菌种。 3.职责 检验员负责菌种的验收、传代与保藏。 4.内容 4.1定义 标准菌株是指由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每培养一次即称为一代。所有传代用菌种和工作用菌种的传代次数应严格控制，原则上不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度传代增加菌种变异和污染的风险。 4.2标准菌的来源 标准菌株需有明确来源，应可溯源至国内或国际认可的菌种保藏中心的标准菌株。 4.3标准菌的验收 新购买的标准菌株应检查是否随菌种附有菌种证书。接收时还应检查菌种数量和名称及每一支包装的完整性。在相应的菌种验收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和验收日期等。新购入的标准菌株储存于－20℃冰箱。 4.4菌种的复苏与传代 根据不同的菌种保存方法和保存形式，选择适宜的方法无菌开启菌种。应减少开启过程对菌种活力的影响，且不要引入外部污染。 经冷冻干燥安瓿保存的菌种：先用适宜的消毒剂擦拭安瓿后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，将安额管顶部烧热，将无菌水滴于加热处使顶部出现裂纹，用无菌器具轻叩裂
纹处上部，开启安瓿管的顶端，用适宜的缓冲液或液体培养基溶解菌块，并转移至新鲜的培养基上培养。 甘油小瓷珠保存法保存的菌种：取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出1个小瓷珠，拧紧瓶盖。尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生产能力。取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。 斜面低温保存法保存的菌种：从冰箱中取出菌种斜面，放置室温后，移入生物安全柜。点燃酒精灯，把接种环金属部分放在火焰上灼烧，往返通过3次，然后用左手握住培养基试管，将管口靠进火焰旁，右手用无名指、小指及掌部夹住塞子，拨开塞子，用接种环在营养琼脂斜面刮取少量菌苔堵上塞子，左手将菌种管放下，另取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开塞子，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌划在斜面的表面上。取出接种环，在火焰旁将培养基管塞子堵上，然后将接种过菌的接种棒在火焰上灼烧灭菌。 4.4.1标准菌株传代 4.4.1.1从冰箱中取出的新购买的标准菌株（一般为第二代，G2），以及灭菌的对应培养基一起移入生物安全柜。按照说明书指示复溶标准菌株，用10μL一次性接种环蘸取菌液，直接接种至平板或液体培养基，置于对应的温度培养，此为第3代（G3）。 4.4.1.2挑取平板上纯菌落按甘油小瓷珠保存法保存，作为保存菌种（G3），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面培养数支，按斜面低温保存法保存，作为工作用菌种，此为第4代（W4）。 4.4.1.3将第3代（G3）瓷珠保存的菌于-20℃冻存，将工作用菌（W4）于适当温度下培养适当时间后在4℃冰箱保存，用于日常检验。 4.4.1.4取冷冻保存的第3代（G3）瓷珠菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成瓷珠菌种保存菌第4代（G4）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后4℃冰箱保存用作工作用菌种，此仍为第4代（W4）。 4.4.1.5将第4代菌种（G4）于瓷珠菌种保存管冻存，将生长、转种后的第3代（G3）菌种经高温灭活处理后丢弃。 4.4.1.6按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新采购标准菌株，重复上述操作，保存和使用菌种。 4.4.1.7当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用
目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1. 2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1. 2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1. 2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1. 2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1. 2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将
冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1. 2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。 1.1. 2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。 1.2.1准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1：1比例混匀制成。 1.2.2按操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。 1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按冻存。 冻存菌悬液的复苏： 1.3.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。 ③消毒液：75%酒精、%新洁尔灭或84消毒液等。 1.3.2操作： 1.3. 2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。 1.3. 2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。
四、试验用菌种的培养传代方法 ●程序： 冻干菌复苏————接种（斜面）（菌种传代） （营养肉汤） 制备菌悬液对照菌液 ●检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。 ●菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。 1 菌种的复苏 ?把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。 ?先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 ? 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。 ? 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3 代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 2 菌种的传代与保存 方法（1）：菌斜面菌斜面（保存） ? 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 ? 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。 ? 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。? 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。? 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。 方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面 如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）： 用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。 常用分离平板： 大肠埃希菌——EMB琼脂平板 铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基 金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基 沙门菌——SS琼脂平板