生物技术制药
第一章绪论
★生物技术与生物技术药物的概念
生物技术药物的分类
?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)
?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物
?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物
★生物技术药物的特性
?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差
?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性
?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染
?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)
第二章基因工程制药
蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性
临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学
真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响
基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH
基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性
基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t
)
1/2基因工程制药基本环节
?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞
?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装
基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞
酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端
1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量
影响限制性内切酶反应的因素：
?DNA样品的纯度：
?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。
?酶切反应的温度
?DNA的分子结构
?反应缓冲液组成
?反应时间、反应体积等
工具酶
?核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。
?同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端
?同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端
DNA甲基化酶：具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解
?DNA连接酶
?T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段
?大肠杆菌DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA 片段
?聚合酶：以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3’-OH末端，合成方向为5’→3’。DNA聚合
酶、RNA聚合酶
?大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’DNA外切酶活性；3’→5’DNA外切酶活性；RNA H酶活性
?Klenow酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性
?T4噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA
?T7噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性
?Taq DNA聚合酶
?反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性
?末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP沿5’→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；不需要模板 载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载
外源DNA导入宿主细胞的能力。
?质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA)；线状DNA(lDNA)?质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性
?用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点
?常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体
?λ噬菌体载体：插入型载体、臵换载体
?来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。
目的基因的常用制备方法
?化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
?PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
?基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离
?cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难
第一链：mRNA模板，引物(polyT) ，逆转录酶，dNTPs
第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；
S1内切酶)
引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，
dNTPs)
?基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln(1–f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小?双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性
?影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
重组DNA导入宿主细胞
?导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法
?导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法
?导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法
?重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
重组子的筛选与鉴定
?遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
?核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法
?限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆
?DNA序列测定法
?目的基因表达产物测定法
原核细胞表达的特点及选择
?大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产(成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等
?缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解
★外源基因表达的调控原件：复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序
列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号?用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列)
★外源基因在大肠杆菌中的表达方式
?胞内表达：
非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因
融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白?分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达
★外源蛋白表达效率的影响因素
?外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子
?mRNA的结构：改变一级结构；降低5’端二级结构稳定性；调控3’端非翻译区二级结构
?表达载体的选择：表达方式；强的复制子(拷贝数高)；强的启动子(转录效率高)；高效率的核糖体结合位点；强的终止子(提高mRNA稳定性)；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。
?外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株
真核细胞表达的特点及选择
常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较
大肠杆菌巴斯德毕赤酵母
载体原核载体穿梭载体
调控序列原核原核和真核
表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌
翻译后修饰基本无有
生产方式发酵，操作简单、经济发酵，操作较简单、较经济
★酵母表达体系的影响因素
?外源基因的结构
外源基因5’端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率
起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进行
富含A-T序列导致转录提前终止
密码子的偏好性
高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率
?表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达
?启动子：多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子
?转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高
?诱导条件：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择
?外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性。
哺乳动物细胞表达系统
?表达载体：病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等)；质粒载体
?表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达
基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取
基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱
选择分离纯化方法的依据
?根据表达形式选择
?分泌型：沉淀和超滤
?周质表达：溶菌酶处理＋渗透压休克
?胞内可溶表达：亲和层析或离子交换层析
?胞内不溶表达(包涵体)：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。
?根据分离单元之间的衔接选择
?先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。合理选择色谱分离次序
?根据分离纯化工艺的要求选择
?具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；尽量较少组成工艺步骤；所用时间尽可能短；工艺和技术必须高效
★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面
?Mr远大于小分子化学物质，致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。如质谱
?基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法
?两者杂质性质差别较大。小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；
基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。
?药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反应的方式
★基因工程药物的质量控制
1、蛋白质含量的测定
?紫外吸收光谱：在280nm有最大吸收值。快速，无破坏性。不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。
?BCA法：碱性条件与Cu2＋络合同时将Cu 2＋还原成Cu＋(双缩脲反应)，再与二辛可宁酸形成紫色复合物，在562nm有最大吸收值。需短时间10min内完成
?Lowry法：碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色。特点：灵敏，准确度高；操作步骤多，繁琐；影响因素多(盐酸胍、尿素、EDTA等)
?考马斯亮蓝法：灵敏，操作简单，重复性好；抗干扰能力弱
?SDS-凝胶染色与扫描分析法
2、蛋白质纯度的测定：电泳(SDS-PAGE)、质谱法、色谱法、末端氨基酸分析法
3、蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法
4、蛋白质等电点的测定
5、蛋白质序列分析
?N末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白质的种类；C末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工
6、蛋白质二硫键分析
7、蛋白质活性的测定
8、免疫测定法
9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析
基因工程药物的实例：干扰素(IFN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF)、人白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、人生长激素(hGH)
第三章动物细胞工程制药
动物细胞的体外培养
★体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞?贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型(主要来源于中胚层组织)；上皮样细胞型(主要来源于外胚层和内胚层组织)
?非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞
?兼性贴壁细胞：如CHO细胞、小鼠L929细胞
动物细胞的生理特点
1)细胞的分裂周期长，一般为12~48h(G1 →S→G2→M)
2)细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
4)动物细胞对周围环境十分敏感(如渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱)
5)动物细胞对培养基的要求高(需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为
主要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。)
6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
培养条件要求高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰
★动物细胞培养的条件
(一)环境条件：直接接触的器材、防止污染(显著地污染标志：pH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至
出现细胞集落)、水质、pH(大多是7.2-7.4)、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质
(二)营养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等
?碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖
?氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸
?在多数情况下，需要添加5％－20％的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。
培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基
?天然培养基：主要见于早期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清(最常用有效)、羊水、腹水等。分维持液(低或不含牛血清)和生长液(5%-20%牛血清)
?合成培养基：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等
?无血清培养基
①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；
②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；
③供应充足、稳定；
④细胞产品容易纯化；
⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；
⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析
血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，必须的脂肪酸和微量元素
★其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基pH调整液；细胞消化液(胰蛋白酶，EDTA)；抗生素溶液
?细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块→剪碎→分散处理(加胰蛋白酶或胶原蛋白和EDTA)→洗涤纯化→计数稀释→培养
?细胞的传代培养：离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中
?单克隆培养
动物细胞培养的基本技术：细胞分离(离心法；蛋白酶消化法)；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存(慢冻，液氮,－196度) 和复苏(快融，投入37℃水浴融化)
?冻存主要步骤：活性好的细胞，加保护剂(DMSO等)混合；做好标记(细胞种类、日期等)；逐渐降低温度，最后放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻
生产用动物细胞
原代细胞：费钱费力，少用
传代细胞系：安全，特点：2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50代)
转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养
工程细胞系：融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法)；基因工程细胞系?病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统
?基因工程细胞主要的筛选系统，
①HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞
②GPT(HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)选择系统，筛选gpt+的转化细胞
③G418(Geneticin)选择系统，筛选Neo r的转化细胞
④MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞
细胞库的建立：原始细胞库(MCR)→生产用细胞库(MWCR，又称工作细胞库，主细胞库→生产细胞库) 常用生产用动物细胞：BHK-21，C127细胞，CHO-K1，COS细胞，MDCK细胞，WI-38，MRC-5，Namalwa，Sf-9，Vero，SP2/0-Ag14
动物细胞大规模培养
★动物细胞的大规模培养方法
?悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞
优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。
缺点：细胞培养密度较低。
?微载体培养：用于培养贴壁细胞。充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当(1.030~ 1.045g/ml)、粒径均一，在60~250 m之间(溶胀后)、光
学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分
?多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内，能避免受到剪切力的损伤，因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件：具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性?微囊化培养：避免剪切力对细胞造成的损伤；获得较高细胞密度107－108个/ml；利于纯化；可采用多种生物反应器进行培养
?中空纤维培养：把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。
理想的动物生物反应器必须具备的基本要求：
①体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。
②生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。
③密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。
④培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。
⑤可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言。
⑥容器加工制造时要求内面光滑，无死角。
⑦拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。
⑧设备成本尽可能低。
★动物细胞生物反应器
?规模：实验室规模：<20L；中试规模：20－100L；生产规模：>100L
?类型：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养?主要操作方式：
?分批式操作：能够控制的参数只有PH、温度和通气量
?补料-分批(或流加式)操作：不断地向系统中补充新的营养成分
?半连续式操作
?连续式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。
转基因动物
基本原理及步骤：外源目的基因的制备→外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞→选择获得携有目的基因的细胞→选择合适的体外培养系统和宿主动物→转基因细胞胚胎发育及鉴定→筛选所得的转基因动物品系
转基因动物制作方法
?经典的技术路线：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低
?整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率?核移植(克隆)的技术路线：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。
?整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。
?具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法★
转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因表达水平低
转基因动物反应器：(bioreactor)目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。如乳腺、膀胱、血液等
动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗
第四章抗体工程制药
概述
抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体攻击病变細胞；
检验，以ELISA侦测特定病原体；
多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)简称多抗。如:免疫血清(含多种特异性抗体) 实际意义：预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清(抗破伤风)；胎盘球蛋白(抗病毒感染)。副作用：→超敏反应。临床诊断，如：肥达氏反应(伤寒、副伤寒)。缺点：特异性差
单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb )简称单抗★
优势：特异性高：只识别某一个特定的抗原决定簇。均一性好：其H链、L链及V区独特性其完全一致，所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。
杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能无限增殖
重链(H链)和轻链(L链)天然Ig分子中，重链同类，轻链同型。
重链可分为五类：μ、γ、α、δ、ε链——IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；轻链可分为κ、λ型。
可变区(V区)、恒定区(C区)和铰链区(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)
?VL 、VH区各有3个超变区(也称互补决定区，CDR1-3)，共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR)
?C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。
抗体分子的价位：指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2价分子。
单克隆抗体的制备
产生杂交瘤细胞的三个关键点：B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选
单克隆抗体制备的基本过程(理解)：抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的B淋巴细胞，B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体,最后进行纯化。
抗原和免疫：抗原的制备(通常和佐剂混合，增强免疫应答)、免疫动物(体内/体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)
细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选
细胞的融合：制备脾细胞悬液：最后一次免疫后三天，1×108个；制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细胞，(2～3)×107个；融合：40－50％PEG(MW4000)，37℃，5min
★HAT培养基筛选杂交瘤细胞
HAT培养基筛选原理：H(次黄嘌呤)；A(氨基蝶呤)；T(胸腺嘧啶)。骨髓瘤细胞不具备HGPRT和TK，B淋巴细胞寿命短。影响细胞DNA的合成：H促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)
途径；T促进了胸腺嘧啶激酶(TK)途径；内源性途径(谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸，二氢叶酸还
原酶途径)被A(叶酸的拮抗物)阻断
步骤：融合后细胞→HAT培养基→HT培养基→正常培养基
杂交瘤细胞的检测和克隆
抗体的检测：仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射免疫测定法、流式细胞仪法
杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。经过3－4轮克隆化，才能达到100％孔内均为阳性细胞克隆。耗时长(3－4月)
杂交瘤细胞的冻存：冻存原始细胞
单克隆抗体的大量制备：体内接种法(皮下接种、腹腔接种)；体外培养法
单克隆抗体的鉴定和检测
单克隆抗体的检测
?McAb特异性检测：检测有无抗原抗体结合；检测有无交叉反应。ELISA、间接免疫荧光法
?McAb类和亚类的鉴定：类的鉴定一般在杂交瘤的克隆化过程中可以确定(兔抗鼠IgG或IgM作为二抗用于ELISA)亚类的确定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心ELISA。
?其他鉴定：中和活性鉴定；识别抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价(滴度鉴定)；纯度鉴定 杂交瘤细胞的鉴定：主要是对杂交瘤细胞进行染色体分析
抗体治疗疾病的机制：中和作用、导向作用、拮抗作用、ADCC、CD、Aonist
抗体在疾病治疗中的应用
?作为诊断试剂：病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细胞因子的测定
?作为治疗药物：抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病
制约抗体药物迅速发展的主要障碍：免疫原性；分子量大
基因工程抗体
单克隆抗体的人源化
嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。特点：具备亲本鼠源单抗相同的特异性和亲和力；对人的免疫原性大大减少；可以接上不同亚类的人C区基因，改变抗体功能；半衰期长；工程细胞系比人－人杂交瘤细胞稳定；由于鼠VL和VH区的存在，仍有较强免疫原性
改形(型)抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，
小分子抗体
包括Fab、Fv、单链抗体及单域抗体等
?Fab片段：由重链V区及CH1功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3
?Fv片段：由VH与VL非共价结合而成。在VH与VL的适当区域个引入一个半胱氨酸，形成链内二硫键，成为二硫键稳定的Fv(disulfide-stablized Fv，dsFv)1/6
?单链抗体(ScFv)：在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，即单链抗体。常用的连接肽是(GGGGS)3
?单域抗体：即为VH或VL，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。
优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc，没有Fc带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免
疫毒素或酶标抗体等。
多功能化抗体
双功能抗体(bsAb)：又称双特异性抗体，两个针对不同抗原决定簇的ScFv以共价键或非共价键连接在一起。
融合抗体：Fc抗体融合蛋白；Fv抗体融合蛋白
细胞内抗体：指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，也称内抗体。在scFv的C端/N端插入其他靶向信号
最小识别单位：约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性噬菌体抗体工程
噬菌体抗体库技术的三个关键：RT-PCR技术；噬菌体展示技术；抗体原核表达技术。
★噬菌体抗菌库技术的筛选：。固相或液相纯化抗原的筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选
第五章疫苗及其制备技术
1.活疫苗(live vaccine)选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。活疫苗株进入机体后，
能继续生长繁殖，对机体呈长时间刺激，持续产生抗体。这类菌(疫)苗有卡介菌(预防结核病的菌苗)、炭疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰质炎疫苗以及麻疹苗等。
2.死疫苗(killed vaccine)包括灭活疫苗(由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，
丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性)和亚单位疫苗(将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗)
★活疫苗特点★★死疫苗特点★
?可在体内繁殖
?系统免疫反应和局部免疫反应?免疫力持久，产量高，成本低?有毒力增强和反祖危险
?抗原干扰现象
?保存条件苛刻?不能在体内繁殖，性质稳定，安全性高
?有利于制备多价或多联疫苗
?比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象?受外界影响小，有利于保存运输
?免疫剂量大，需多次免疫，成本高
?只能诱导机体产生体液免疫
?通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果
★活疫苗★死疫苗DNA疫苗
?可在宿主细胞中复制?毒力降低
?免疫反应比较全面?免疫剂量小
?免疫保护期长?不能在宿主细胞中复制
?无毒，不返强
?免疫反应不太全面
?不会传染给其它个体
?制备技术相对容易
?可刺接抗原在细胞内合成
?可诱导细胞免疫
?制备技术容易标准化
重组亚单位疫苗
?将病原的主要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗----亚单位疫苗?良好的安全性和稳定性。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物
?适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。
?不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE效应的疾病。
活载体疫苗
?利用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。
病毒活载体疫苗的缺点：使用同一载体的不同疫苗不能同时使用
疫苗制造流程
制造优良疫苗的关键：优良的菌种；适宜的培养方法；良好生产工艺；严格的检验和标准。
生产工艺流程：菌(毒)种→培养物(培养基、动物、禽胚或细胞等)→收获抗原(培养液、含毒组织、胚液或细胞液等)→配苗→分装→冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。
毒种的选择与减毒
★毒株须具备的条件：
1)持有特定的抗原性；
2)有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；
3)易在特定组织中大量繁殖；
4)不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；
5)如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；
6)未被其它病毒污染。
强毒种的选育：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准
弱毒种的选育：初选的依据：生物性状改变
细菌灭活疫苗制造：种子→培养→灭活和无菌检查→浓缩提高含菌量→配佐剂→分装→动物安全试验
细菌弱毒疫苗制造：菌种→培养→浓缩→配苗和冻干→动物安全试验
病毒性动物组织苗(自家组织灭活苗；病毒弱毒疫苗)、病毒禽胚疫苗、病毒细胞疫苗、寄生虫疫苗的制备
★疫苗产品的质量检定：外观检查、pH值检测、纯度、宿主细胞DNA和蛋白残留量、无菌检查、热原、抗生素检测、灭活效果的验证、异常毒性检查、稳定性试验、效力试验(生物效
价)、佐剂的质量评价、疫苗标准品或参考品的研究
甲型肝炎减毒活疫苗：生产用细胞(人二倍体细胞)、细胞库管理及检定、细胞制备、细胞培养液、毒种名称及来源、种子批的建立、对照细胞外源因子检查、病毒接种和培养、病毒提取(检定合格的病毒收获物经冻融和(或)超声波处理，并采用适宜浓度的三氯甲烷抽提以提纯病毒)、原液(同一细胞批生产的病毒收获物经提取病毒后合并为一批原液)
流行性乙型脑炎疫苗：收液作毒力滴定与无菌实验，加入福尔马林，22℃恒温灭活8d
灭活剂、保护剂和免疫佐剂
灭活剂种类
1.甲醛溶液：最常用。①蛋白质②核酸烷基化(不加中断剂)作用于氨基、羧基、羟基、巯基
2.烷化剂：乙酰基乙烯亚胺(AEI)；二乙烯亚胺(BEI)；缩水甘油醛。(使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫
代硫酸钠中断灭活)。烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，妨碍RNA的合成。使病毒完全丧失感染力，而保留其保护性抗原。
3.苯酚(石炭酸)：用于防腐，很少用于疫苗研制
4.结晶紫：蛋白质变性(溶于有机溶剂)；用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原
5.β-丙酰内酯：病毒灭活剂，主要用于狂犬病灭活苗制备
！注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤粘膜有强烈刺激性如：甲醛、β-丙酰内酯
影响灭活作用的因素：灭活剂特异性；微生物种类和特性；灭活剂浓度；灭活温度；灭活时间；灭活PH值；
有机物存在
保护剂的用途
①菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂
②细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO，一种细胞的保护剂)
③疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳(或二甲基亚砜)和蔗糖等(不同国家有不同配方)
④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
保护剂分类：机理——渗透剂(DMSO、甘油和蔗糖)非渗透剂(聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质)；分子量大小——高分子物质、低分子物质；化学性质——复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
疫苗冻干保护剂组成：营养液；赋形剂；抗氧化剂
常用的冻干保护剂(稳定剂)
细菌的保护剂
①需氧或兼氧厌氧菌：５％蔗糖脱脂乳或５％蔗糖、1.5％明胶；
②厌氧性细菌：含1.5％谷氨酸钠的１％乳糖或10％脱脂乳或7.5％葡糖血清。
注：脱脂乳：20％脱脂奶粉溶于水配制而成。
病毒的保护剂
①5%蔗糖脱脂乳；
②马立克814活细胞疫苗：保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。
注: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。
常用的保护剂：5%蔗糖(乳糖)脱脂乳保护剂；明胶蔗糖保护剂；SPGA保护剂
免疫佐剂：
?氢氧化铝胶(铝胶) ?油乳佐剂?乳化剂?白油佐剂?蜂胶佐剂?脂质体佐剂
?细胞因子类免疫佐剂(IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ)
?CpG DNA(指含有非甲基化CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸)基序的脱氧核糖核酸DNA)
?CpG OND(含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸)
?基因工程减毒素(霍乱毒素，CT；大肠杆菌不耐热毒素，LT；破伤风类毒素，TT)
?免疫刺激复合物(ISCOM，抗原：糖苷Quil A：胆固醇=1:1:1)
作用机理：抗原递呈；抗原寻的；免疫调节
?CpGDNA对多种免疫细胞有激活作用：引起B细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，在IL-12协同下激活NK细胞，协同刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化
?CpGODN的体内效应与应用：对天然免疫系统的刺激活性(抗感染、抗肿瘤活性)；对特异性免疫反应的调节作用——疫苗佐剂(对蛋白质抗原的作用；对DNA疫苗的作用)；过敏性疾病治疗
第六章酶工程制药
概述
酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸
一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。
★酶的特点：高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。
酶的分类：六大类，氧化还原酶类(脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类)、转移酶类、水解酶类(淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶)、裂解酶类(醛缩酶、水化酶及脱氨酶)、异构酶类(消旋酶、顺
反异构酶)和合成酶类(又称为连接酶)
酶的来源和生产：直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯；化学合成方法；工业微生物发酵
发酵法产酶的优点：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。微生物繁殖快，生产周期短，酶的产量高，成本低。微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。
研究内容：酶的大量生产和分离纯化；新颖酶的发现、研究和应用；酶的固定化技术和固定化酶反应器；基因工程技术应用于酶制剂的生产；酶分子改造与化学修饰；有机介质中酶的反应；酶抑制剂、激活剂
的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；酶的定向进化研究
酶的分离纯化
分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：
?低温：一般1～4℃
?条件温和：避免极端条件(剧烈搅拌、pH、盐浓度等)
?加入保护剂：EDTA、2-巯基乙醇等
?对纯化过程进行监测：不断检测酶活力和蛋白浓度
★酶分离纯化的步骤：预处理→初步纯化→高度纯化→浓缩与干燥
酶的提取
?来源选择：含目的多的原料。同时考虑原料的来源、取材方便经济等方面因素
?细胞破碎：机械法、物理法、化学法(有机溶剂、表面活性剂)、生物法(酶解)
?保护措施：采用缓冲系统；添加保护剂；抑制水解酶的作用；其他：注意温度、搅拌、紫外光等的影响 酶的抽提：
?目标：将目的酶最大限度地溶解出来；保持生物活性。
?原则：相似相溶；使用远离等电点的pH值，溶解度增加。
?方法：盐溶液提取(常用NaCl溶液)；酸、碱溶液提取；有机溶剂提取
沉淀分离：等电点沉淀；盐析；有机溶剂沉淀
酶的纯化
?根据分子量大小分离：离心、膜分离、凝胶层析等
?根据电荷性质进行分离：离子交换、电泳等
?根据疏水作用进行分离：疏水层析、反相色谱等
?根据亲和作用分离：亲和层析
酶和细胞的固定化
游离酶的缺点：酶是蛋白质，稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影响)。酶不能回收，无法重复使用。产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。
★固定化酶：
?优点：(1)可提高酶的稳定性。(2)酶能回收，易与产物分离，可反复使用。
?缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。
固定化细胞：
?优越性：(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作：(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系完成部分代谢过程。
?局限性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。
固定化酶(细胞)的制备
★传统的酶固定化方法：载体结合法(物理吸附法、离子结合法、共价结合法)交联法(常用戊二醛试剂)、
包埋法(网格型、微囊型)
固定化方法
吸附法
包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法
制备难易易易较难难较难
结合程度弱中等强强强
活力回收高，酶易流失高高低中等
费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变
酶固定化的新方法：光偶联法；等离子体法；偶合固定化法；无载体固定化酶的新技术
★固定化酶(细胞)的性质和指标
固定化酶活力的改变：通常低于天然酶(有例外)
原因：酶的构象发生变化，影响活性中心的氨基酸；空间障碍：形成立体屏蔽；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时，大分子底物不能透过膜
固定化酶的稳定性：酶的耐热性提高，对变性剂、抑制剂、pH值、蛋白酶以及操作条件的抵抗力增加。
可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。
固定化酶的最适温度变化：最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升(有例外)
固定化酶的最适pH变化：带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。
固定化酶的表观米氏常数Km的变化：固定化酶的表观Km随载体的带电性能变化。
固定化载体与酶的底物电荷相反时，固定化酶的表观Km值降低；相同时，表观Km值显著增加。 固定化酶的作用专一性改变：与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变
固定化细胞的性质：有活性升高的现象；稳定性的增加；最适温度和最适pH常保持不变
★固定化酶(细胞)的评价指标：活力、偶联率及相对活力、半衰期、热稳定性
?活力回收=(加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力)/加入酶蛋白活力×100%
?偶联率=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%
偶联率＝1，表明固定化对酶活性影响不明显；
偶联率＜1，表明固定化对降低酶活性；
偶联率＞1，可能有细胞分裂，或从载体中排除影响酶活性的抑制剂
酶传感器：主要由固定化酶膜和变换器组成
?生物传感器：酶传感器(酶电极，热敏电阻酶传感器，离子敏场效应晶体管酶传感器，光纤酶传感器)、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器
?酶传感器的应用：水质监测；葡萄糖传感器和血糖测定仪；肉鲜度传感器
?按结构区分：搅拌罐式反应器(STR)；鼓泡式反应器(BCR )；填充床式反应器(PCR )；流化床式反应器(FBR)；膜反应器(MR)
?按操作方式区分：分批式反应；连续式反应；流加分批式反应
?混合形式：连续搅拌罐反应器(CSTR)分批搅拌罐反应器(BSTR)
间歇式酶反应器
?又称为批量反应器(Batch Reactor，BSTR)、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶(细胞)用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。
?优点是：装臵较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。
?缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶
连续式酶反应器
?又称为连续搅拌釜式反应器(Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR)、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液(含产物)。
?优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。
?缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。
填充床酶反应器
?填充床反应器(Packed Reactor,PBR),又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液(含产物)。
?优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。
它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。
?缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。
流化床反应器
?流化床反应器(Fluidized Bed Reactor, FBR)。
?特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应(即固、液、气三相反应)。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。
膜反应器
?膜反应器(membrane reactor, MR)是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。
?用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。
?膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。
★酶反应器的性能评价：固定化酶的性状；底物的物理性质；固定化酶稳定性；酶反应动力学特性
测定的主要参数：空时(稀释率)、空速(空时的倒数)、转化率、生产强度。
酶反应器的操作：操作条件的确定；底物浓度；酶浓度；反应温度的确定与调节控制；pH值的确定与
调控；搅拌速度；流动速度
★酶反应器应用的注意事项：保持酶反应器的操作稳定性；保持反应器中流体的流动方式和状态；防止
酶的失活变性；防止微生物的污染
酶反应器生产能力的下降：酶本身失活；酶从载体上脱落；载体的破碎或溶解
酶的化学修饰
目的：提高酶的生物活性(酶活力)；增强酶的稳定性(热稳定性、体内半衰期)；消除抗原性(针对特异性反应降低生物识别能力)；产生新的催化能力。
方法：交联修饰(交联法)；定点突变与化学修饰相结合；小分子修饰(酶蛋白侧链基团修饰)；大分子修饰(大分子结合修饰)；辅因子的引入
应用：如：PEG－超氧化物歧化酶(SOD)、PEG－溶血类蛋白质(链激酶、尿激酶等)、PEG－天门冬酰胺酶(ASNase)——消除了抗原性，延长了酶在体内的半衰期。又如：用Dextran修饰α-淀粉酶，β－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶——提高了酶的热稳定性
第七章发酵工程制药
概述
★发酵的定义：
发酵：(fermentation)现代发酵工业上泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，或更确切地说，发酵是用生物催化剂(biocatalyst)使培养物质转化成产品的生物化学反应
发酵工程技术：主要包括提供高性能生产菌种的菌种选育技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分离提取技术。
1897年，毕希纳(德国)，酶(enzyme)
发酵类型：微生物菌体发酵(苏云金杆菌是一种G+芽孢杆菌，在形成芽孢的过程中产生伴孢晶体)、微生物的酶、微生物的代谢产物发酵、微生物转化发酵、生物工程菌发酵
★微生物发酵所生产的药物
?抗生素类：抗微生物、抗肿瘤、免疫调节剂等
?氨基酸类：精氨酸、鸟氨酸及氨基酸复方制剂等
?核苷酸类：肌苷酸、肌酐、辅酶A、辅酶Q10等
?维生素类：麦角甾醇、维生素B2、维生素B12等
?甾体类激素：在甾体类激素的合成过程中进行特殊的转化反应
?多糖类：透明质酸、右旋糖酐
?治疗酶及酶抑制剂：链激酶、尿激酶、淀粉酶抑制剂、克拉维酸、普伐他汀等
发酵工程制药的特点
?菌种的选择：决定发酵的关键因素
?存在“生物学变量”：理论产量难以从物料平衡中计算，存在10％误差
?条件温和：常温常压，反应安全，条件简单
?必须纯种培养：发酵过程中严防污染杂菌
?反应专一性强：能够对复杂化合物的特定部位进行反应，得到较为单一的产物
?可在分子水平控制发酵：通过定向发酵、突变生物合成等生成特定结构产物
?投资小、见效快，经济效益显著
发酵过程中的微生物
常见的药用微生物：原核：细菌、放线菌(链霉素菌属)；真核：酵母、真菌；非细胞型：噬菌体、病毒对微生物的要求
1、遗传性状稳定，不易退化
2、生长速度快，不易污染
3、产量高，目标产物产量尽可能接近理论转化率
4、目标产物最好分泌到胞外
5、尽可能减少类似物的产量
6、其所利用的培养基成分简单，价格低廉
7、不是病原菌
★生产菌种的选育方式：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因重组?自然选育(natural screening)：自发突变
?定向培育(directive breeding)：筛选抗性菌株
?诱变育种(mutation breeding)：营养缺陷型菌株
机制：微小损伤突变(碱基臵换<点突变>、码组移动突变)；染色体畸变(易位、倒位、缺失、重复)；染色体组突变
诱变方法：物理诱变：紫外线、X射线、γ射线、中子等；化学诱变：氮芥、亚硝基胍、亚硝酸、5-Fu等；生物诱变“噬菌体
?杂交育种：比诱变育种具有更强的方向性和目的性
?原生质融合：又称细胞融合
?基因工程育种：预先设计和控制
菌种保藏
1、斜面低温法：4℃，1-6m。简便易行，成活率高；保藏期短，传代次数多，易变异和污染
2、石蜡油封存法：4℃、阻氧、灭菌，1-2y，适用各大类菌种，不适于分解烃类菌种。
3、沙土管保藏法：4℃、无氧、干燥、低温和无营养条件保藏，1-10y。较适用于产孢子以及形成芽孢的微
生物
4、麸皮保藏法：又称曲法保藏，低温干燥，>1y，适于产孢子的霉菌及放线菌，工厂采用较多。
5、甘油悬液保藏法：甘油终浓度为10%--15%，-20 ℃----1y；-70 ℃----10y。常用于保藏基因工程菌。
6、冷冻真空干燥保藏法：5-15y，适于各类微生物
7、液氮超低温保藏法：-196℃，>15y，适于各类微生物
8、宿主保藏法：被感染的宿主一同低温保藏。适于专性活细胞寄生微生物(病毒、立克次体)。
发酵设备及消毒灭菌
★发酵设备：种子制备设备(种子罐)、主发酵设备(发酵罐)、辅助设备(制备无菌空气和培养基)、发酵液预处理设备、粗产品提取设备、产品精制干燥设备、流出物回收利用及处理设备
★发酵罐的基本类型
要求：结构严密、良好的液体混合功能、高的传质和传热率、灵敏可靠的检测和控制仪表
类型：用不同的手段使发酵罐内的气、固、液三相充分混合，从而满足微生物生长和产物形成对氧的需求?搅拌釜反应器
优点：传质速率、混合速率、气体运输率较高；操作灵活；适用性广泛
缺点：搅拌功率消耗大；因罐内结构复杂，不易清洗干净，易被杂菌污染；培养丝状菌时，常因搅拌桨叶的剪切力致使菌丝易被切断，细胞易受损伤
主要部件：罐体、搅拌器(叶式、弯叶式、箭叶式)、挡板、冷却装臵、轴封、消泡器等
?鼓泡式反应器：通过液体中空气上升的动力带动液体，进行混合
?气升式反应器：通过液体中空气上升的动力，带动液体形成环流，进行混合
发酵辅助设备：无菌空气系统、灭菌系统、发酵车间的管道和阀门等
好气性培养对空气的要求：无菌、无尘、无杂质、正压
培养基的成分：碳源(速效、迟效)、氮源(有机、无机)、无机盐及微量元素、生长因子、前体、促进剂、抑制剂等
培养基的类型：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基
培养基的灭菌：高压蒸汽湿热灭菌(常用121～138℃，30 min～50min )空罐、实灌、连续灭菌
发酵工程制药的过程与控制
★发酵工程的基本过程：上游工程：菌种选育、中试；发酵生产：中心环节；下游工程：产物分离纯
化鉴定、副产物回收、废物处理
种子的扩大培养
种子要求：生长活力强、生理状态稳定、菌体总量及浓度能满足下一步发酵要求、无杂菌、能保持稳定的生产能力
发酵级数：指制备种子需逐级扩大培养的次数。级数越大，越易染菌和变异，管理越困难；一般控制在2-4级
种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常到对数期生长，菌体量未达最高峰时。种龄过短则菌体太少，过长则菌体易老化。
接种量：种子液体积与接种后发酵罐培养液总体积之比。5%-15%
★发酵方式：分批发酵、补料-分批发酵、半连续发酵、连续发酵(与动物细胞工程相比)
分批发酵：是将发酵培养基组分一次性投入发酵罐，经灭菌、接种和发酵后，再一次性加工发酵液放出，是在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式。常采用单罐深层培养法。细菌的生长周期：延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期
特点：操作简单，周期短，不易染菌，生产过程和产品质量容易掌握；由于生产过程中养分容易耗尽，积累有害产物，不适合于对基质浓度敏感的产物或次级代谢产物。
补料-分批发酵：发酵过程中间歇或连续补加新鲜料液，以克服由于养份不足，发酵提前终止的问题。不是封闭体系；培养液“只进不出”；适用于培养液某营养组份明显影响产量时
半连续培养：发酵过程中间歇或连续补加新鲜料液；间歇放掉部分培养液进入下游工艺；既补充养料，又稀释有害物质。缺陷：损失菌体和营养物质；造成发酵液稀释，不利于下游工艺；造成前体丢失，影响产量；染杂菌
连续培养：在发酵过程中某一时段，一边连续补充培养液，一边以相同流速放出发酵液，维持原有发酵体积。有利于维持微生物生长环境的稳定。
优点：使产率和产品质量保持稳定；反应器容积小，容易对发酵过程进行控制；更易实现机械化和自动化控制；减少非生产占用时间
缺点：易染菌；微生物容易发生变异；对仪器设备要求高；对粘性丝状菌效果不好；对营养物的利用低于单批发酵，一般只能维持数月至一年
★发酵过程中的中间分析项目：产物产量；pH值；糖(间接推测产物生物合成效率)；氨基酸；菌丝形态?产物产量：通过监测产物产量判断发酵结果，化学测定法。
?PH值：代谢产物影响培养液pH值，通过培养基中的组分维持合适的pH值，或通过人工方法进行调节
?糖：糖的消耗反应菌体代谢活力的变化。通过糖量测定，间接推测产物生物合成效率。
?氨基氮：通过测定游离氨基酸的数值，侧面反应微生物含氮物质的代谢，推测发酵情况。
?菌丝形态：通过检测菌丝形态，监测微生物生长状态，及时调整发酵策略。
★发酵过程的影响及控制：菌体浓度(600nm处OD值)、营养物质、温度、pH值、溶氧、泡沫、染菌 菌体浓度——通过控制培养液中营养基质的浓度(基础培养基各成分要有适当配比；通过中间补料调整培养基成分)
营养物质：碳源、氮源——用含有两种碳/氮源的培养基进行控制；磷酸盐——对初级代谢产物及次级代谢产物的控制；补料的控制
温度——在发酵不同阶段，采用不同温度；针对不同条件，采用不同温度
pH值——调节培养基组分，增加缓冲体系；补料；补加酸碱
溶氧——调节搅拌转速和通气率；控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值
CO2——控制通气量；控制搅拌速度；控制补料工艺
泡沫——机械消沫；消泡剂消沫
染菌——设备无渗漏；管道系统无渗漏；空气净化系统正常
发酵终点的确定
?指标：生产率、得率和发酵系数。原则：上述指标高，成本低
?生产率＝kg产物/[发酵液体积(L)〃h]；得率=kg产物/kg基质；发酵系数=kg产物/罐容积m3〃h
基因工程菌的发酵
特点：基因工程菌培养过程中具有不稳定性。常分为两阶段发酵------菌体生长阶段(高密度发酵)；表达外源产物阶段。
基因工程菌的不稳定性
?质粒不稳定：分离不稳定(产生一定比例不含质粒的子代菌)；结构不稳定(DNA重排或缺失致使工程菌性能改变)
?产物不稳定：被宿主细胞的降解、产物变性等
基因工程菌的发酵控制：培养基——分批补料；溶氧——增加搅拌速度和通气量；温度——前高后低；pH ——及时控制产生的大量乳酸和CO2
发酵罐的要求
发酵工程中的代谢调控和代谢工程
初级代谢和次级代谢的主要区别
初级代谢过程自始至终都存在于一切生活细胞之中,并与机体的生长过程呈平行关系;而次级代谢则仅在机体生长的某一个时期产生,与微生物的生长不呈平行关系。
初级代谢产物在不同的微生物中基本相同,而次级代谢产物的种类在不同微生物中是非常不同的。
初级代谢对环境变化的敏感性比较小,即遗传稳定性强，而次级代谢对环境条件的变化很敏感, 其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。
催化初级代谢产物合成的酶专一性强，而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。
代谢产物合成的调控
改变微生物代谢调节的方式
?控制微生物发酵条件：使用诱导物、改变细胞通透性、添加生物合成前体、解除末端产物反馈调节、解除分解代谢物阻遏(解除分解代谢物阻遏的方法：葡萄糖效应-----控制发酵的培养基成分和浓度)?诱变育种：营养缺陷型突变株、抗反馈突变株、抗阻遏突变株、抗生素突变株
与末端代谢产物结构类似的化合物会干扰正常菌体的代谢, 甚至引起菌体死亡
定向发酵：突变生物合成、杂合成物合成、外源微生物药物的转化
代谢工程：改变代谢流、扩展代谢途径、转移或构建新的代谢途径
发酵工程制药的实例：抗生素、氨基酸、多糖、维生素
补充：
利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌
细胞膜透性的改变，可解除代谢产物对酶活性的抑制
微生物在生长代谢过程中分泌的代谢产物有初级代谢产物、次级代谢产物前者是微生物所产生的产物，如氨基酸、核酸、类脂糖类。后者是在微生物生长到一定时期，以初级代谢产物为前提物质而合成对微生物生命活动无明确功能性质的过程中所产生的产物。如抗生素、生物碱、植物生长因子等。
第八章微生物转化
微生物转化，microbial transformation就是利用微生物的一种或几种酶的专一催化功能，对某个有机化合物的分子结构的特定位臵，实现一种或几种化学反应，使其转化成结构相似的更有价值的新化合物。应用：有机化合物的合成、药物前体化合物的转化、活性成分筛选、新药的看法、药物代谢模型预测…类型及实例
氧化反应：生产葡萄糖酸；将氨基氧化为硝基(氯霉素的转化)
还原反应：还原醛到醇(组胺醛)
水解反应：酯的水解、苷的水解、硫醚开裂
缩合反应：制备麻黄碱中间体1-苯基-1-羟基丙酮
其他反应：胺化反应(间型霉素B的转化)、脱羧反应、酰基化反应、脱水反应
微生物转化反应的特点
?可以用静止细胞进行，也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细胞进行生产等。
?它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点：
反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快
可以减少反应步骤
对立体结构具有高度的专一选择性
回收率高、成本低
甾体微生物转化
?反应类型：
羟化(C9α羟化，一个关键中间步骤；C11 α羟化是微生物特有的反应，菌株以黑霉素最好)；
ββ
脱氢(A环的C1,2和C4,5位之间，B环C5,6之间)；
芳香化(A环)；羟基转化为酮基(C3α、C3β)；酮基还原为羟基(C3、C17、C20)；
边链降解(始于C17位羟化，经β氧化，生成C17酮化合物)
例：可的松的生产：化学合成法：难以在11位导入氧原子。
Sarret：用576kg脱氧酸，2年，30余步反应，得到938mg醋酸可的松
Petterson和Murry：1952年，黄体酮，用霉菌进行11α羟化，再经10步化学法得到可的松
?两个阶段：生长阶段、转化阶段
?生物技术控制途径：通过甾醇结构的修饰；在微生物降解过程中加酶抑制剂(9α羟化酶和C1,2脱氢酶)；
通过诱变技术或利用基因工程技术改造菌种，造成相关酶的缺损，使得微生物只能选择性降解边链，而不降解母核。
甙类物质的生物转化
萜类分子的生物转化
组合生物合成(Combinatorial Biosynthesis)
几种天然药物的微生物转化：雷公藤内酯(雷公藤甲素(短刺小克银汉酶)；雷公藤内酯酮(黑曲霉))；鬼臼毒素；大黄蒽醌类；麻黄碱
第九章蛋白质药物的化学修饰
–第一个蛋白质类抗体——1891年，德Behring发现白喉外毒素免疫动物产生的抗血清能治疗白喉患者
–第一个重组蛋白质药物——1982年，美国Eli Lilly公司重组人胰岛素Humulin(优泌林)上市
蛋白质药物分类
?替代缺乏或异常蛋白质药物：蛋白质激素(胰岛素、生长激素、促性腺激素)；血浆蛋白类(血浆白蛋白、
丙种球蛋白及促红细胞生成素、凝血因子)
?增强蛋白质生物活性通路药物：细胞生长调节因子(IFN、IL)
?提供新功能或新活性：胶原蛋白(明胶、冻干猪皮)
?直接干扰靶分子或靶组织：各种受体分子、抗体及单克隆抗体；蛋白酶抑制剂(胰蛋白酶抑制剂)；碱性
蛋白质(硫酸鱼精蛋白)
优点(高活性；特异性强；较低毒性；生物功能明确
缺点：抗原-抗体反应强(免疫原性强)；血浆半衰期短，迅速被体内酶降解；易被肾小球过滤清除；溶解度及稳定性差，导致沉淀
–第一个化学修饰蛋白质药物PEG修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)，用于小儿先天ADA缺乏症
–应用：纯度鉴定与分析；结构与作用机制研究；固定化(不溶于水)；改性
★蛋白质药物化学修饰意义
?循环半衰期延长
?增大分子量，避免肾小球滤过
?免疫原性降低或消失，毒副作用减少
?物理、化学和生物稳定性增强
?增加药物溶解度，延长体内水解时间
修饰剂(Modifier)
★选取的一般原则：1.修饰剂毒性、抗原性、稳定性；2.修饰剂反应活性及对修饰位点的选择性；3.
修饰剂与蛋白质连接键的稳定性；4.修饰剂对蛋白构象及生物活性的影响；5.是否适于建立快速、方便的分析、分离纯化方法；6.修饰剂是否价廉易得
★主要类型：水溶性高分子聚合物：常用聚乙二醇(PEG)；小分子修饰剂。修饰剂需活化
★修饰策略
?随机修饰(random modification)氨基(游离赖氨酸残基ε-NH2)
?定点修饰(site specific modification)针对特定基团或专一位点进行修饰，有利于保持蛋白质药物活性，质量易控。氨基修饰(N-末端α-NH2)；巯基修饰(-SH高亲和性)；羧基修饰(-COOH)
聚乙二醇化修饰★
PEG优势：
?无毒性、两亲性、无抗原性、强生物相容性
?为避免在修饰过程中发生交联和团聚，常采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG) 衍生物作为修饰剂选择PEG需考虑因素
?PEG的Mr：Mr越大，蛋白活性、免疫原性越低，稳定性越高、半衰期越长
?选择非活性部位氨基酸残基作为修饰位点：定点修饰优于随机修饰
?水解稳定性及反应活性：pH控制
经PEG修饰的蛋白质
?稳定性提高
?在人体的保留时间延长，肾小球滤过减少
?免疫原性降低，减少抗体产生
?蛋白溶解度增加
?被PEG掩盖后，酶解机会减少，药物半衰期延长，注射次数减少，使蛋白类药物变成长效制剂随机修饰
– 1.经活化后方可用；2.修饰靶点多为游离赖氨酸残基ε-NH2和N末端的α-NH2；3.同分异构体数量多，质量难控，选择性不高等
第二章生物药物概论 一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。 主要原则:有效成分含量高,原料新鲜;来源丰富,易得;原料产地较近;杂质含量少;原料成本低;易提取。 特性:(1)药理学特性:治疗的针对性强;药理学活性高;毒副作用小,营养价值高;生理副作用常有发生。 (2)生产、制备中的特殊性:原料中的有效物质含量低;稳定性差;易腐败;注射用药有特殊要求。 (3)检验上的特殊性:要有理化检验指标,与生物活性检验指标。 分类: 按药物化学本质与化学特性分类:(1)氨基酸及基衍生物类(2)多肽与蛋白质类(3)酶与辅酶类(4)核酸及其降解物与衍生物类(5)糖类(6)脂类(7)细胞生长因子类(8)生物制品类(9)小动物制剂(10)动物器官或组织制剂。 按原料来源分类:(1)人体组织(2)动物组织(3)植物组织(4)微生物(5)海洋生物来源的药物。按生理功能与用途分类:(1)治疗药物(2)预防药物(3)诊断药物(4)其她。 二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时,选择提取试剂需注意的问题。 工艺流程:1、生物药物原料的选择、预处理与保存(保存方法: 冷冻法,-40℃;②有机溶剂脱水法;③防腐剂保鲜,多用于液体)。 2、生物药物的提取:(1)生物组织与细胞破碎:磨切法,压力法,反复冻融法,超声波震荡破碎法,自溶法,酶溶法(2)选择合适的溶剂进行提取(考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数,注意温度、变性剂等因素)。 3、生物药物的分离纯化:(1)蛋白质类药物的分离纯化:沉淀法,亲与层析法,疏水层析法(2)核酸类药物的分离纯化:提取法,发酵法(3)糖类:沉淀法,离子交换层析法(4)脂类:沉淀法,吸附层析法,离子交换层析法(5)氨基酸类:沉淀法,吸附法,离子交换法。 试剂的选择:1、对所需要提取的活性成分溶出度较高,对杂质较低。2、不破坏活性成分。3、利于后续预处理。4、对环境影响较小,有利于回收与处理。5、对设备要求不高。6、成本较低。7、最好对人体无害。 第三章基因工程制药 一、基因工程制药的主要工艺过程。 获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌(或细胞)→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装 二、什么就是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？ 目的基因既就是人们所需要的特定基因,一般也就是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。 获取方法:(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库,从中调用目的基因;(2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段;(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需要的目的基因片段(4)化学合成法;⑸逆转录(RT)-PCR法合成cDNA。 基本要求:不含多余干扰成分,纯度高;片段大小适合重组操作;结构、序列正确,达到一定数量。 三、基因工程克隆细胞与表达细胞、克隆载体与表达载体其各自特点。 克隆载体:1、具备复制原点,在宿主细胞内必须能够自主复制。2、有一个或多个用于筛选的
第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。
第一章绪论 1、生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是（）、（）、（) 2、生物技术制药发展历程经历了飞速发展的四个十年，分别是（）、（）、（）、（）。 3、生物技术所含的主要技术范畴有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）。 4、下列哪个产品不是用生物技术生产的（） A 青霉素 B 淀粉酶 C 乙醇 D 氯化钠 5、我国科学家承担了人类基因组计划（）的测序工作 A 10% B 5% C 1% D 7% 6、生物技术 7、生物技术药物 8、生物技术制药 第二章基因工程制药 1、基因工程药物制造的主要步骤是：（）、（）、（）、（）、（）、（）。 2、目的基因获得的主要方法是（）、（）、（）、（）。 3、基因表达的微生物宿主细胞分为2大类。第一类为（），目前常用的主要有（）；第二类 为（），常用的主要有（）。 4、基因工程药物的分离纯化一般不应超过5个步骤，包括（）、（）、（）、（）和（）。 5、在基因工程药物分离纯化过程中，基因重组蛋白的分离比较困难，可用（）、（）、（）、 （）的方法，达到初步分离的目的。 6、人工化学合成DNA新形成的核苷酸链的合成方向是（），合成的DNA 5’末端是（），3’ 末端是（）。 7、凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分 A、分子大小 B、带电状态 C、分子质量 D、解离状态 8、可用于医药目的的蛋白质和多肽药物都是由相应的（）合成的 A RNA B 基因 C 氨基酸 D 激素 9、用反转录法获得目的基因，首先必须获得（） P13cDNA文库法 A tRNA B cDNA C rRNA D mRNA 10、那一类细菌不属于原核细胞（） A 大肠杆菌 B 枯草芽孢杆菌 C 酵母 D 链霉菌 11、基因工程菌的生长代谢与（）无关 A 碳源 B RNA聚合酶 C 核糖体 D产物的分子量 12、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源 A 葡萄糖 B 蔗糖 C 甘油 D甘露醇 13、下列那种色谱方法是依据分子筛作用来纯化基因工程药物（） A 离子交换色谱 B 亲和色谱 C 凝胶色谱 D气相色谱 简答: 1、基因工程制药的概念？ 2、什么是载体？载体主要有哪几种？ 3、质粒载体的三种构型是什么？质粒载体的性质？用于克隆表达质粒载体的三个要素是 什么？ 4、目的基因常用的制备方法有哪四种？这四种方法的基本步骤是什么？
生物技术制药考试题复 习 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
一：选择题 1、酶的主要来源是（C） A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植物细胞与组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指 (A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：（E） A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用? B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定? C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒? B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：（D） A、Poly?A B、PolyC C、PolyG D、PolyT E、发夹结构
7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达? C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达? D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易? 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和（安全性鉴定）。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D、表达产物为天然产物? 13、人类第一个基因工程药物是：(A)
生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：
生物技术制药试题及答案 1.论述生物技术在食品工业中的作用？ 答：（1）开辟新的食品资源：利用微生物菌体发酵生产单细胞蛋白；应用微生物酶工程生产高果糖浆、饴糖、麦芽糖、高麦芽糖浆、麦芽糊精、偶联糖等淀粉糖产品。 （2）提高食品品质：利用发酵工程、酶工程技术生产酸味剂、甜味剂和鲜味剂等食品添加剂。在肉类和鱼类加工中应用酶来改善组织，嫩化肉类和转化废弃蛋白质。在乳品加工中应用酶进行干酪生产、分解乳糖和黄油增香。在果蔬加工中应用酶进行柑橘脱苦、果汁澄清和果蔬保藏等。在饮料、酿酒工业中应用酶发酵生产各种饮料。在焙烤食品生产中应用淀粉酶和蛋白酶来提高焙烤品质和增加香味。 （3）食品卫生检测：酶免疫分析法、放射免疫分析法、单克隆抗体法和DNA 探针法用于检测食品中的沙门氏杆菌等。 （4）食品脱毒：利用发酵法、酶解法等对食品中的有毒糖苷类物质（硫代葡萄糖苷）、寡糖（β-半乳糖苷）和棉酚等进行处理，以脱除有毒物质。 2.试论述生物技术与医药卫生的关系？ 答：（1）疫苗生产：病原体减毒或弱化疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。病原体减毒和弱化疫苗是利用微生物的纯种培养技术以及减毒疫苗的制备技术来生产的，是以减毒或弱化的病原体作为疫苗。基因工程疫苗是将病原体的抗原基因克隆在细菌或真核细胞内，利用细菌或细胞生产病原体的抗原，利用抗原作为疫苗。而核酸疫苗则是将含有编码蛋白质基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白质，诱导宿主产生对抗该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。 （2）疾病诊断：单克隆抗体与ELISA技术用于诊断传染性疾病、检测肿瘤相关基因、确定激素水平、检验血液中的药物含量及鉴定微生物病原体。DNA诊断技术可用于诊断遗传性疾病、肿瘤和传染性疾病。 （3）生物制药与基因工程药物：利用微生物发酵可生产各种抗生素。利用植物细胞大规模培养技术可生产天然药物，如紫草宁、紫杉醇、人参皂苷、强心苷、胡萝卜素等。利用单克隆抗体制备技术可制备用于肿瘤治疗的“生物导弹”。利
《生物技术制药》教案 生物技术制药教案 使用专业:生物技术专业 一教学方案 1. 本课程总学时 72 学时(四年制本科生)，其中理论课讲授 54 学时，实验 课 18 学时 2. 本课程注重教学的基础性、先进性和实践性，坚持不懈地进行教学研究和改革，除课堂 教学衔接了其他的相关课程，同时还建立了实验教学体系，努力培养学生分析 问题、解 决问题和科研动手能力，使学生能够适应现代生命科学对高素质人才的需要 3. 本课程采用启发式教学并以多媒体课件辅助教学，通过学生自学、课堂教学及课后辅导 相结合的教学方式开展教学 4. 本课程实践性教学详见实验教学大纲 二课程作业与考核评价 1. 作业 1.1 预习作业:每堂课后布置课后预习作业，并要求做好预习笔记，以培养学 生的自学能力 1.2 课后作业:每堂课后布置书面作业，教师批阅后并给出参考答案，供学生进一步学习思考 1.3 课堂作业:根据需要在课堂安排一定的练习，并当堂讲评，以培养学生解 决问题与分析 问题的能力 2 考核形式与成绩评定
2.1 期末考试采用闭卷考试，占总成绩的70% 2.2 平时小测与作业以书面为主，口试为辅，占总成绩的10% 2.3 实验成绩占总成绩的20% 三教材和学习参考书 1. 教材 夏焕章,熊宗贵.生物技术制药(第2版).高等教育出版社,2006 2. 学习参考书郭勇.生物制药技术(第2版).中国轻工业出版社,2007 G 沃尔什.生物制药学(原著第2版).化学工业出版社,2006 宋航.制药工程专业实验.化学工业出版社, 2005 天津大学.制药工程专业实验指导.化学工业出版社,2005 四本课程考核方式 本课程采用百分制进行考核，其中期末考试成绩占考核分的70%;平时成绩占10%，平时成绩包括课后作业、课堂提问、考勤等;实验占20%。 生物技术教案(章节备课) 学时:2 章节第一章绪论第一讲 教学目的 1. 掌握生物技术制药的基本概念和发展简史和要求 2. 熟悉生物技术的现状和发展趋势 重点重点:生物技术制药、生物技术药物的概念和特征难点难点:生物技术药物的分类、特征 第一节生物技术的发展史,1学时, 1. 生物技术的概念 2. 生物技术的发展简史 第二节生物技术药物,1学时,
第一章、绪论 1. 生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。 3. 生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 4. 现代生物药物四大类型：⑴应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂； ⑵基因药物 ⑶来自动物、植物和微生物的天然药物； ⑷合成与部分合成的生物药物。 5. 生物药物功能用途分类：⑴治疗药物，⑵预防药物⑶诊断药物。 6. 生物技术制药的特征：⑴高技术⑵高投入⑶长周期⑷高风险⑸高收益 7. 生物技术在制药中的应用：⑴基因工程制药：①基因工程药物品种的开发、②基因工程疫苗、③基因工程抗体、④基因诊断与基因治疗、⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型、⑥应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物、⑦基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用、⑧利用转基因动、⑨植物生产蛋白质类药物 ⑵细胞工程制药：①单克隆抗体技术、②动物细胞培养 ⑶酶工程制药 ⑷发酵工程制药 8. 我国生物技术制药现状和发展前景（自己阐述观点）
第二章基因工程制药 1．基因工程生产哪些药：⑴免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。⑵细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。⑶激素，如胰岛素、生长激素、心钠素⑷酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2. 利用基因工程技术生产药品的优点在于： ⑴利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 ⑵可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 ⑶利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 ⑷内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程读起进行改造。 ⑸利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 3. 上游阶段：是研究开发比不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。上游阶段的工作主要咋实验室内完成。 4. 下游阶段：是从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化。 5. 制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 6. 宿主菌应该满足以下要求：⑴具有高浓度、高产量、高产率；⑵能利用易得廉价原料； ⑶不致病、不产生内毒素；⑷发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑸容易进行代谢调控；⑹容易进行重组DNA技术；⑺产物容易提取纯化 7. 宿主细胞分为两大类：⑴原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；⑵真核细胞：酵母、丝状真菌 8. 表达载体必须具备以下条件（特点）： ⑴载体能够独立地复制 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子收到控制，只有当诱导时候才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有反义的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。 ⒐密码子的偏爱性：在基因组中把使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。此现象被称为密码子偏爱性 ⒑融合蛋白：由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，称为融合蛋白。 ⒒酵母的复制序列的几种不同载体：⑴YEp类（酵母附加体质粒） ⑵YRp类（酵母复制型质粒） ⑶YCp类(酵母着丝粒质粒) ⑷Yip类（酵母整合型质粒） ⒓基因工程菌的不稳定性：基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。
一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与 组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产 物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相 对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物 为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)
生物技术制药 第一章绪论 药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性 临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响 基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性 基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等
生物技术制药试卷A 一、名词解释：（本题共10小题，每小题5分，共计50分） 1、生物药物：是指利用各种生物材料，综合采用各种生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2、抗生素：由微生物产生，在低浓度下能杀灭和抑制病原体，但对宿主不会产生严重的副作用的物质，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。广义的抗生素还包括一些抗肿瘤药、杀虫剂和除草剂。 3、补料分批发酵：是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 4、限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶。 5、载体：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 6、转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。 7、微载体培养：将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。 8、毛状根：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。 9、气升式反应器：没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小，主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养。 10. 酶固定化：指经物理或化学方法处理，使酶（细胞）限制或固定于特定空间位置，使之不但能连续发挥催化作用，而且反应后酶又可以反复利用的技术。 二、简答题（本题共5小题，每小题8分，共40分） 1. 简述生物药物新药的研发流程。 答：新药研究和开发的主要过程：
第一章绪论 1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 2生物技术的主要内容：P1 基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程 蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。 染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。 生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。 3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为 5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题 第二章基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P16 2、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行 3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定 ）①核酸探针杂交法 用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白， ②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测） 4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。 ①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难； ②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂； ③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制； ④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应； ⑤细菌的内毒素不容易清除； ⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化； 5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？ 蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞 ①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。 ②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到； ③外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化； ④可以直接食用，等于直接口服药物 6、结合pBG-2说明选择用于E. coli 细胞宿主中的载体的6项原则。 P23 与pBV220优点类似，原则P22 7、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32如何计算质粒的稳定性？P33质粒稳定
《生物技术制药》复习资料（Biotech nological Pharmaceutics ） 第一章绪论 一、概述 1.概念：生物药物（生物制药）是泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。|采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，叫做生物技术制药。 2.技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。 3.相关学科：有生物学（含微生物学、分子生物学、遗传学等）、化学、工程学（化学工程、电子工程等）、医学、药学、农学等。但从基础学科来讲，生物学、化学和工程学是其主要的学科。 4.应用范围：（1）医药；（2）农业；（3）食品；（4）工业；（5）环境净化；（6）能源。 二、生物技术的发展简史 1.传统生物技术阶段 主要产品：乳酸、酒精、丙酮、丁酸、柠檬酸、淀粉酶。 生产的特点：过程简单，大多属兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构简单，属初级代谢产物。 2.近代生物技术阶段 主要产品：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染。生物技术的特点：（1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）、次级（抗生素）、生物转化（甾体）；（2）生物技术要求高， 纯种、无菌、通气，产品质量要求也高；（3）生产设备规模大；（4）技术发展速度快。 3.现代生物技术 主要产品：胰岛素、干扰素、生长激素等。 生物技术的内容包括：（1）重组DNA技术及其它转基因技术（基因工程）；（2）细胞和原生质体融合技术（细胞工程）；（3）酶或细胞的固定化技术（酶工程）；（4）植物脱毒和快速繁殖技术；（5）动物细胞大量培养技术；（6）动物胚胎工程技术；（7）现代发酵技术；（8）现代生物反应工程和分离工程技术；（9）蛋白质工程技术；（10）海洋生物技术。 三、医药生物技术的新进展 1.基础研究不断深入
生物技术制药知识点纲要 生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。 生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。 生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术； 细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件； 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。 生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。 第三代生物技术是海洋生物技术 我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术 现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。
生物技术制药期末复习提 纲 Jenny was compiled in January 2021
生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程？ 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定？ 质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种？ 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种？ 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类？ 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而 c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种？ 网格型微囊型 发酵工业的生产水平取决于哪三个要素？ 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类？ 治疗药物、预防药物、诊断药物
基因工程药物制造的主要步骤如何？ 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种？ 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源？ 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种？ 自然选育、诱变育种和原生质体融合 . 在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。微生物的发酵方式有哪几种？ 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵 目的基因的获得方法有哪几种用反转录法获得目的基因，首先必须获得什么cDNA法获得目的基因的优点是什么将构建好载体导入动物细胞最常用的方法是什么 反转录法、反转录-聚合酶链反应法和化学合成法 目的基因的mRNA 获得的目的基因编码序列无内含子，目的基因的筛选较容易
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。
2018年生物技术制药习题及答案 一、选择填空题 1. 酶的主要来源是什么? 微生物生产。 2. 第三代生物技术是什么? 基因组时代。 3. 基因治疗最常用的载体是什么? 质粒载体和λ噬菌体载体。 4. 促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么? 因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化, 人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。 5. 菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸?
菌体生长所需能量 (大于) 菌体有氧代谢所能提供的能量时, 菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 6.cDNA 第一链所合成所需的引物是什么? cDNA 第一条链合成所需引物为 PolyT 。 7. 基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么? 表达产物的功能。 8. 为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施? 将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。 9. 根据中国生物制品规定要求,疫苗出厂需要经过哪些检验? 理化检定、安全检定、效力检定。 10. 基因工程药物化学本质是什么? 蛋白质。
11.PEG 诱导细胞融合? PEG 可能与可能与临近膜的水分相结合, 使细胞之间只有微笑空间的水分被 PEG 取代, 从而降低了细胞表面的极性,导致双脂层的不稳定,使细胞膜发生融合。 12. 以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物,产物位置是什么? 胞内、周质、胞外。 13. 人类第一个基因工程药物是什么? 重组胰岛素。 14. 动物细胞培养的条件是什么? 温度 :哺乳类 37昆虫 25~28, ph7.2~7.4,通氧量:使 co2培养箱,不同动物比例不同。防止污染, 基本营养物质:三大营养物质维生素, 激素, 促细胞生长因子, 渗透压:大多数 260~320。 15. 不属于加工改造抗体的是什么? 单域抗体。 16. 第三代抗体是什么?