陕西中医学院
硕士学位论文
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
姓名：张敏
申请学位级别：硕士
专业：中药学
指导教师：卫培峰
2011-04
摘要
目的：本课题通过何首乌不同成分及制首乌对肝细胞凋亡及P450含量的影响，以及何首乌不同炮制品对肝脏CYP2E1基因mRNA表达及CYP2E1酶活性的影响，旨在探究何首乌致肝损害的物质基础及其作用机制。也为进一步探索何首乌炮制方法与导致肝损害之间的关系提供科学依据。
方法：用制首乌不同成分提取物大黄素、大黄酸、大黄酚，以及制首乌分别按不同剂量给予大鼠灌胃，每天一次，观察大鼠一般情况，连续给药3个月后，摘眼球采血检测ALT和AST指标，颈总动脉处死检测肝细胞凋亡指数及细胞色素P450含量。筛选出何首乌致肝损害的化学成分，制何首乌和此种物质按一定剂量给予小鼠灌胃，连续给药4周，摘眼球采血检测ALT和AST指标，颈总动脉处死检测肝细胞凋亡率。用何首乌的不同炮制品即清蒸首乌、黑豆汁制首乌A、B、C分别给予大鼠灌胃，观察大鼠一般情况，连续给药3个月后，摘眼球采血检测ALT和AST指标，颈总动脉处死检测肝脏CYP2E1基因mRNA表达水平、CYP2E1酶活性及肝脏的病理学变化。
结果：给药期间，与对照组比较，各给药组食、水摄入量没有差异。在何首乌不同成分致肝损害的实验研究中，各给药组大鼠血清中ALT均有不同程度的升高，与空白组比较，大黄酚组大鼠血清ALT升高具有显著的统计学意义（P<0.05），大黄素组大鼠血清AST升高具有显著的统计学意义（P<0.05）；制首乌及大黄酚组肝细胞凋亡指数明显增加有非常显著的统计学意义（P<0.01），而大黄素、大黄酸组肝细胞凋亡指数无明显变化（P>0.05）；各给药组肝脏细胞色素P450含量无明显变化（P>0.05）。在制首乌及大黄酚致小鼠肝细胞凋亡实验中，发现各给药组小鼠血清ALT、AST均有不同程度的升高，但与空白组比较无统计学意义（P>0.05）；制首乌组、大黄酚组肝细胞凋亡率均升高，与空白组比较，肝细胞凋亡率均有显著的统计学意义（P<0.05）。在何首乌不同炮制品致肝损害的实验研究中，清蒸组大鼠血清中AST升高具有非常显著的统计学意义（P<0.01），黑豆汁制首乌A、B、C组大鼠血清AST升高具有显著的统计学意义（P<0.05），各给药组大鼠血清ALT无明显变化（P>0.05）；与空白组比较，各给药组CYP2E1基因mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，各给药组间无明显差异(P>0.05)；与空白组比较，黑豆汁制首乌B组、黑豆汁制首乌C组对大鼠肝微粒体CYP2E1酶活性有
显著性诱导作用（P<0.05）；清蒸组、黑豆汁制首乌A组对大鼠肝微粒体CYP2E1酶活性均无显著性影响(P>0.05)；病理观察显示：与空白组比较，各给药组出现了明显的病理改变。
结论：何首乌中导致肝细胞凋亡的主要成分很有可能是大黄酚等某种成分，并且会对肝脏造成一定程度的损害。何首乌不同炮制品均能够显著抑制CYP2E1 mRNA的表达；黑豆汁制首乌B、C组能够诱导大鼠肝微粒体CYP2E1酶活性，清蒸及黑豆汁制首乌A组对其影响不显著；各给药组肝脏的病理结果主要表现为肝细胞脂肪变性，色素颗粒沉积，炎细胞浸润，由此得知何首乌不同炮制方法与导致肝损害之间存在一定的关系。
关键词：何首乌；肝脏损害；物质基础；作用机制
Study of Material Foundation and Mechanism of Polygonum multiflorum Thunb on liver injury
Abstract
Objective Through effect of different components of Polygonum multiflorum and Radix Polygoni Multiflori prepared on Hepatocyte Apoptosis
and effect of different Radix Polygoni multiflori and Liver Cytochrome P
450
Preparata on the enzyme activity and mRNA level of CYP2E1 in liver ,this subject were designed to explore the material base and mechanism of Polygonum multiflorum Thunb .Providing a scientific basis with further explore to relationship between processing methods of Polygonum multiflorum Thunb and the causing of hepatic damage.
Methods The rats were infused with different component extract of Polygonum multiflorum Thunb such as emodin, rhein, chrysophanoland prepared Radix Polygoli Multiflori ,different dosages once a day.Watch the general situation of rats;It was successively administered for 3 months, collect blood from eye in order to detection of ALT and AST parameters,sacrificed rats from carotid
;After artery to testing Hepatocyte Apoptosis index and liver Cytochrome P
450 screening the chemical composition of Polygonum multiflorum Thunb which caused liver damage,the mice were infused with prepared Radix Polygoli Multiflori and this chemicals , certain dosages once a day, it was successively administered for 4 weeks, collect blood from eye in order to detection of ALT and AST parameters,sacrificed mice from carotid artery to testing Hepatocyte Apoptosis rate. The rats were infused with different Radix Polygoni Multiflori prepared such as the steamed and Polygonum multiflorum Thunb (A、B、C)，different dosages once a day.Watch the general situation of rats;It was successively administered for 3 months, collect blood from eye in order to detection of ALT and AST parameters，sacrificed rats from carotid artery to
testing on the enzyme activity and mRNA level of CYP2E1 in liver and the hepatocytes changing of rats in shape.
Results During the experiment,water and food took in by test team and the control ones had no differences.In the experiment of different components of Polygonum multiflorum causing Hepatic damage,each of the rats serum ALT of the administration droups elevated in different degree,compared with control group,the serum ALT of chrysophanol group elevated has a significant statistical significance（P<0.05），the serum AST of emodin group elevated has a significant statistical significance（P<0.05）; The hepatocyte apoptosis index of Radix Polygoni Multiflori prepared and chrysophanol group significant elevated,and it has a very significant statistical significance(P<0.01),but the hepatocyte apoptosis index of emodin group、rhein group has no significant difference(P>0.05),each of the liver of the administration droups has no significant Cytochrome P
450
difference(P>0.05). In the experiment of Radix Polygoni Multiflori prepared and chrysophanol causing hepatocyte apoptosis of the mouse, it is found that each of the mice serum ALT、AST of the administration droups elevated in different degree, but there is no statistical significance compared with control group（P>0.05）;the hepatocyte apoptosis rate of Radix Polygoni Multiflori prepared and emodin group are https://www.doczj.com/doc/8c15578365.html,pared with control group,the hepatocyte apoptosis rate has significant statistical significance （P<0.05）. In the experiment of different Radix Polygoni Multiflori prepared causing liver damdge,the serum AST of the steamed group elevated has a very significant statistical significance（P<0.01）, The serum AST of polygonum multiflorum Thunb.(A, B, C) group elevated has a significant statistical significance（P<0.05）; each of the serum ALT of the administration droups has no significant different(P>0.05);compared with control group, Each of the CYP2E1 mRNA level of the administration groups was significantly lower
(P<0.01),and there was no marked difference for each of administration
group(P>0.05); compared with control group, Polygonum multiflorum Thunb.( B,
C) group showed significantly inducing effect on the enzyme activity of
CYP2E1(P<0.05);the steamed group and Polygonum multiflorum Thunb.A group
showed no significantly inducing effect on the enzyme activity of
CYP2E1(P>0.05);Pathological observations indicate that each of the administration droups there is a clear pathological changes compared with
control group.
Conclusions The main composition of Polygonum multiflorum whitch causing Hepatocyte Apoptosis is very likely chrysophanol and some ingredients,and it
will cause a certain degree of liver damage.The different Radix Polygoni
multiflori preparata can significantly inhibit the expression of CYP2E1 mRNA. Polygonum multiflorum Thunb.( B, C) group can significantly induce effect on
the enzyme activity of CYP2E1, the steamed group andPolygonum multiflorum
Thunb.A group showed no significantly inducing effect on the enzyme activity
of CYP2E1. Pathological results of each of administration group mainly showed
hepatocyte steatosis、pigment particle deposition、inflammatory cell infiltration, it is learned that there is a certain relationship between
different Radix Polygoni multiflori Preparata and causing liver injury. KeyWords:Radix polygonum multiflorum; Hepatic Damage ; material Foundation ; mechanism
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何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
引言
目前中医药在国际市场上的影响与日俱增，国内外对中草药的研究水平也在不断提高。随着近几年中药应用市场的不断扩大，中药的疗效在国际市场上也得到越来越多的肯定，但是随着中药毒副作用的报道频频出现，以往被认为无毒甚至作为保健品的中药，也表现出毒性反应，使得中药的安全性成为关注的焦点，补益类中药的毒性也开始渐渐受到重视。
近年来，在关于中草药不良反应的报道中，像药物肝毒性就是一种重要的并且所占比例较高的特异质药物反应，它是指在药物治疗期间，在一小部分病人中间发生的一种与药物的药理作用不相关的不良反应[1]。作为传统补益药，并且堪称延年益寿之佳品的何首乌，也出现了肝脏不良反应的报道。何首乌为蓼科多年缠绕草本植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb）的块根，经过炮制后具有补益精血，固肾乌须之功。现代药理研究证实，何首乌生品具有一定的毒性，经过炮制后的制品一直未发现具有明显毒性，且具有多方面的补益作用。但是近年来国内外关于何首乌不良反应的报道逐渐增加, 而且主要是集中在肝脏不良反应上[2]。张力等对国内1978-2008年间何首乌不良事件回顾中发现38例不良事件中肝损伤的有24例，国外何首乌制剂不良事件12例中均为肝损害表现[3，4]。孙震晓等回顾1996-2009年间何首乌及其制剂相关药物性肝损害病例共35例，总结出生首乌与制首乌及其制剂可引起肝损害[5]。由此，我们可以看出何首乌的安全性使用问题已成为大家关注的焦点，这将势必会影响到这一传统中药在临床中所起到的不可估量的作用。所以要让何首乌得到放心而广泛地使用，解决何首乌的安全性问题显得尤为重要，而何首乌的肝毒性问题无疑是其中的核心问题。
何首乌的现代研究也是最早开始于化学成分的研究，其主要化学成分为二苯乙烯苷类、蒽醌类、聚合原花青素以及磷脂类化合物。导致何首乌肝损害的毒性成分目前还不是十分清楚，但是从何首乌中所含有的化学成分分析，一方面基于所占比例的大小，并且大量研究证实,何首乌中各种化学成分的量与炮制方法,炮制时间直接相关[6,7]，炮制方法及炮制时间的不同将会导致化学成分的不同；另一方面考虑到多数研究何首乌的毒性成分主要集中在蒽醌类化合物，但是从现有的研究实验结果中确实很难判定
陕西中医学院2011届硕士学位论文
蒽醌类就是何首乌的肝毒性成分。以往对于何首乌的肝毒性研究还只是停留在较浅的毒理学研究层面上，未进行更深入的研究，因此应用细胞分子生物学开展何首乌的肝毒性研究是应该重视的一部分。
结合前期的研究工作，本课题选择以何首乌中的大黄蒽醌类来探索何首乌致肝损害的物质基础为出发点，观察与肝细胞凋亡之间的关系，同时分析炮制方法与物质基础之间的相关性，通过测定肝脏CYP2E1基因mRNA表达以及CYP2E1酶活性的变化，进一步探测何首乌导致肝损害的机制。
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
正文
1 文献研究
1.1何首乌
何首乌, 始载于《开宝本草》，又名地精、红内消、首乌、何相公、铁秤砣，为蓼科蓼属植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb）的块根。该植物为多年生缠绕性草本，块根多呈纺锤形，表面红棕色至暗褐色，断面紫红色，故又称赤首乌。在我国大部分地区均有种植，如河南、陕西、湖北、广东、广西、四川等地。秋、冬二季枝叶枯萎时采挖，削去两端，洗净，切厚片，干燥后称为生首乌；再用黑豆汁拌蒸（炖）或清蒸（炖）至内外均呈黑棕褐色，晒干，称为制首乌。何首乌临床使用中有生品和制品之分，其生品的功效为解毒、消痈、润肠通便。主要用于治疗瘰疬疮痈、风疹瘙痒、肠燥便秘病证。制品的功效为补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨。主要用于治疗血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、久疟体虚病证。
1.2何首乌的化学成分及其药理作用的影响
1.2.1二苯乙烯苷类化合物
何首乌的现代研究最早开始于化学成分的研究，在这方面国内外学者进行了广泛而深入的探索。何首乌含有的主要有效成分为二苯乙烯苷类化合物，其中包括2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-silbene-2,3-O-β-D-glucoside）；首乌中还分离得到了新的二苯乙烯类化合物2，3，4′，5-四羟基二苯乙烯-2，3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，4′，5-tetrahydroxy-silbene-2,3-O-β-D-glucoside）；2，3，5，4′-四羟基反式二苯乙烯-2，3-二-O-β-D吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahy-droxysilbene-2,3-O-β-D-glucopyranoside）；2,3,5,4′-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-silbene-2-O-β-D-glucopyranoside）等。因2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量高，活性明显，在2010版《中国药典》中规定其该类指标性成分不得少于1.0％［8］。现代药理研究表明此类化合物在脑保护，保肝作用上有着明显的活性。其脑保护作用的机制可能是多靶点、多环节、多途径，可以体现在改善东莨菪碱所致小鼠记忆障碍[9]，改善胆碱能损伤拟老年性痴呆大鼠学
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习记忆功能[10]，改善脑缺血-再灌注所致的学习记忆障碍[11]，提高实验动物的学习记忆能力等方面[12]；还发现有降低血清胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平，改善血流变学的作用[13]。由此可以预测，何首乌在治疗老年痴呆、帕金森氏病、血管性痴呆等老年神经系统疾病以及高脂血症方面将有很高的临床应用价值。其保肝的作用机制是二苯乙烯苷成分因过氧化玉米油所导致大鼠的肝脏过氧化脂质含量上升、血清谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶(AST)升高、脂肪肝和肝功能损伤等均有显著的对抗作用,还能使肝脏过氧化脂质及血清游离脂肪酸显著下降。在体外实验中,也能抑制由还原型辅酶Ⅱ(NADPH)及二磷酸腺苷(ADP)所致大鼠肝微粒体脂质的过氧化,以减轻肝细胞损害【14】。
1.2.2蒽醌类化合物
蒽醌类是何首乌中另一种重要的化学成分，总含量约为1.1%，其中含有大黄素（Emodin）、大黄素甲醚(Physcion)以及少量的大黄酚(Chrysophanol)和大黄酸(Rhein)等。《中国药典》2010年版增加何首乌中结合蒽醌作为何首乌鉴定的第2个指标性成分，结合蒽醌以大黄素和大黄素甲醚的总量计，不得少于0.10%［8］。研究表明，该类成分在保护肝脏和降低血清胆固醇方面有一定作用【15】；此外，还有一定的免疫抑制作用【16】、心肌保护作用【17】、抗衰老及促进学习记忆能力的作用【18】以及抗菌、润肠通便等药理作用。同时它也是其毒性成分，大黄素对小鼠的LD
为0. 56 g/kg,大黄素甲醚为
50
1.15 g/kg,大黄酚为10. 0 g/kg[19]。有报道称大黄素、大黄酸是何首乌引发肝毒性不良反应的主要成分，是在高浓度、长时间作用下产生的细胞毒作用[20]。
1.2.3磷脂类化合物
磷脂类成分是何首乌中又一类丰富的有效化合物，是首乌补益作用的物质基础，含量约为0.15%～0.30%，包括卵磷脂、肌醇磷脂、乙醇胺磷脂(Phosphatidylethanolamine)、磷脂酸（Phosphatidic acid）、心磷脂等，其中以卵磷脂含量较高，约占30%～40%。
1.2.4鞣质类化合物
鞣质为何首乌中一类含量较低的化合物，研究表明，该类成分除具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤和抗癌、抗心脑血管疾病方面的药理作用外，同时国内外研究比较统一的结果认为两大类鞣质中，其中水解鞣质毒性较大，对肝脏造成损害，甚至可引起动物死亡；而缩合鞣质基本无毒，或对肝脏有轻微影响。而由鞣质单体引起的毒性反应，
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
临床文献报道很少，鞣质的毒性反应与鞣质的纯度等因素有关，所以在探讨鞣质的毒副作用时，要从多方面综合考虑，进行深入的实验研究。
1.2.5其它成分
何首乌含有其它成分，如黄酮类成分能够调节血糖浓度，改善心血管系统的病理状态；多糖类成分具有免疫调节、抗氧化、抗衰老和抗老年痴呆等药理作用［21］；多酚类成分具有抗氧化作用；以及微量元素与矿物质可以补充机体所需的营养成分。此外，还有没食子酸（Gallic acid）,儿茶精，表儿茶精，3-O-没食子酰儿茶精，3-O-没食子酰原失车菊苷元B（3-O-Galloyl-procyanidin B）,3,3′-O-没食子酰原失车菊苷
元B
2（3，3′- O-Galloyl-procyanidin B
2
）,槲皮素-3-O-半乳糖苷
（Quercetin-3-O-galactoside）,阿拉伯糖苷（Arabinoside）,淀粉，脂肪等。
1.3何首乌的炮制研究
根据历代炮制方法记载，何首乌有20多种炮制方法。古代的李时珍在《本草纲目》中对何首乌的制作记载得十分详细，提到了“九蒸九晒”之法；还有近代制用法中的净选、分离、水制、改切法；以及运用加热处理使得外界物质变成体内物质，来保证药物质量，如与黑豆汁蒸制或煮制；也有运用化学原理，以黄酒与药物的有效成分结合而相互转化，如酒蒸或酒煮。炮制方法的不同，其药物的作用目的也是有所改变的，分析其原因，由于其中的某一化学成分含量或结构的改变而使其药效物质含量减少而影响疗效甚至作用机制发生改变及降低毒性，现代药物分析技术对于这一方面的研究起着非常重要的作用。周庆华［22］等研究表明生品中二苯乙烯苷的含量最高，而炮制品中二苯乙烯苷含量随炮制时间的延长而逐渐减少，但其消耗速率常数很小，在最佳炮制时间内，二苯乙烯苷的含量并没有很大的损耗。王建科［23］等测得了不同炮制品中二苯乙烯苷的含量，结果清蒸品最高，酒制品、姜制品和黑豆炮制品依次降低。廖海民［24］等考察研究了不同产地何首乌的二苯乙烯苷含量，发现差异较大，最高的为4.48%，最低的仅为0.30%。由于该成分在临床中所体现的药用价值，因此对于指标成分限量标准的制定是必须遵循的法定依据。影响其有效成分含量的因素很多，如产地、炮制工艺操作、温度、时间等，各种条件的选择、控制是保证药材质量的根本。周燕华［25］等的研究中探讨了何首乌12h煮制品及32h蒸制品对其质量的影响，结果表明，12h 煮制品各项指标均不如32h蒸制品，其中12h煮制品不仅没有免疫增强作用，反而有
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免疫抑制作用，对记忆障碍亦有增强的趋势。推测可能在于炮制时间不够而影响了何首乌的质量，是否还有其它因素还需要进一步探究。
何首乌中含有的总蒽醌由结合型蒽醌和游离型蒽醌构成，其中生品中的结合型蒽醌的含量最高，何首乌中的游离蒽醌在清蒸过程中随时间的变化规律，不仅与温度有关，还与何首乌的块状大小有关，块状大小与变化速率成反比。冯立彬［26］等认为将样品过40目筛，在清蒸时选用10～12小时之间，此时游离蒽醌含量为极值含量的90%以上。另据报道［27］何首乌经蒸制32h后，其中游离蒽醌衍生物的含量最高。何首乌经黑豆汁蒸制后，其中大黄素、大黄素甲醚含量下降，炮制时间越长降低越多［28］。马长华［29］等对生首乌及其清蒸、酒制、豆制、豆加酒制四种炮制品中磷脂类成分的定性定量分析，结果表明，首乌炮制前后所含磷脂类化合物种类基本相同，但是制首乌的磷脂含量明显减少，按卵磷脂计其含量依次为：生品>酒制品>豆制品>清蒸品>豆加酒制品。首乌经炮制后其还原糖量由1.96%增至4.02%，非还原糖量由3.84%增至6.82%，总糖量由5.80%增至10.84%［30］。
清代《修事指南》载有“炮制不明，药性不确，则汤方无准，而病证不验也。”可见中药炮制乃是祖国医学中的重要组成部分，它是在医疗实践中长期同疾病作斗争的经验总结。历代文献记载制首乌比生首乌有更强的滋补强壮功能，而其炮制质量对制首乌的药效影响显著。因此随着现代科学技术的发展，科技工作者在何首乌炮制方面进行了大量的研究，挖掘古代炮制方法，去粗取精，研究了从唐代到清代记载的大量有关何首乌的炮制法，其中宋代记载的“水浸一日切厚半寸，黑豆水拌匀令湿，何首乌重重相间蒸豆烂，去豆，阴干。”《苏沈良方》。明代记载的“去皮，黑豆拌，九蒸九晒、忌铁器。”《入门》、《保元》；“酒浸软，切大片，黑豆一层，何首乌一层，蒸晒各七遍，听用，忌铁器。”《仁术便览》；“砂锅内煮去黑皮。”《奇效》；“打碎面包蒸一柱香，去皮”。《禁方》；“单用米泔浸透，蒸之极熟”《景岳全书》；清代记载的“豆制酒蒸。”《便读》法至今仍在沿用。唐代记载的“黑豆….同蒸熟。”《理伤续断方》。宋代记载的“九蒸九曝，捣罗为末”《圣惠方》；“以苦竹刀切，米泔浸经宿暴干，木杵臼捣之，忌铁。”《证类》；“去黑皮酒炒。”《总录》；“用生姜汁同炮了，甘草……浸两宿，焙，再浸焙。”《朱氏》。金代有“米泔水浸软，竹刀子刮去皮，切作片子，用瓦甑蒸，先铺黑豆三升，干枣二升上放何首乌，上更铺枣二升，黑
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
豆三升，用饮单复著上，用盆合定，侯豆枣香熟，取出不用枣豆。”《儒门》。明代有“以好酒同浸两宿，取出净洗。”《普济方》；“酒浸蒸极熟焙。”《景岳全书》；“用何首乌…..竹刀刮去粗皮，米泔浸一夜切片，用黑豆三斗，每次用三升三合三勺，以水泡过，砂锅内铺豆一层，首乌一层，重重铺尽蒸之，豆熟取出去豆，将何首乌晒干，再以豆蒸，如此九蒸九晒乃用。”《本草纲目》；“米泔水浸三宿，竹刀刮去粗皮，切片，黑豆五升同首乌滚水浸一时，蒸熟去豆。”《禁方》。清代有“酒煮。”《本草纲目拾遗》何首乌炮制法是在挖掘之后发现的，作为现在新增之法。现行的各种炮制方法的制定追其历史依据，都是源于古代的文献记载，常见的方法有清蒸，黑豆制，酒制，黑豆、黄酒制等，现时所遵循的法规（地方炮制规范）仍是沿用历史的习惯与经验，但是由于认识不一，遵循不一，差别很大，需要进一步地明确在炮制过程中影响首乌质量的因素。探索首乌炮制的最佳工艺是保证饮片质量，从而提高临床疗效的重要途径。赵声兰等［31］通过对何首乌炮制过程中的润制工艺研究，认为适宜的室温润制工艺为：何首乌：润制用水量=1:1，润制时间12h；适宜的润制加热工艺为：何首乌：润制用水量=1:1，润制时间131min,润制温度71℃。此时何首乌饮片吸水率达51以上，饮片完全润透，减少了用水量和缩短了润制时间，从而降低有效成分的损失和微生物的影响。该工序可以为何首乌在蒸制之前的润制方法和程序提供依据。沈道修等[32]采用高压法炮制何首乌，结果表明，与药典规定的炮制法相比，二者在补血和升高肝糖元积累等方面的药效基本相同，但是首乌高压法在对血虚小鼠Rbc增加值方面优于药典法，并且高压法有省时、省料、操作简便、降低成本等优点。吴明侠等[33]通过对何首乌不同炮制品进行二苯乙烯苷含量测定，结果发现生品含量最高，而清蒸和黑豆汁炖次之，黑豆汁拌蒸含量最低，提示二苯乙烯苷含量与炮制方法和所受温度有关。解奉江等[34]比较了清蒸何首乌和黑豆汁蒸何首乌中主要有效成分的含量，蒽醌类成分和二苯乙烯苷，二者区别不大，但传统的黑豆汁制法费时费力，从节约成本提高工作效率的方面来看，有必要对传统工艺进行改革。
何首乌生品与制品，中医文献记载具明显差异，生品：性平，味苦涩，微甘。功能：解毒散结，用于痈肿疮毒，滑润大肠。宜于虚人，老人便秘之症。熟品：其性变温，味转甘，入肝胃经而增强补肝肾之功效。临床使用时要因症选择药物，并且采用适宜的制法以提高疗效，现代研究认为，生首乌中具有泻下作用的结合型蒽醌衍生物能促
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进肠管蠕动而导便，故可治疗便秘之症，因此在制备时，入水时间不宜过长，以免有效物质浸失，以水淋滋润法为佳。生何首乌经炮制后，具泻下作用的结合蒽醌受热部分或全部水解为游离蒽醌衍生物，同时还原糖含量逐渐增多，因而无致泻作用，并使毒性明显减弱，而呈现滋补作用。何首乌中的蒽醌类遇铁容易被氧化成为棕红色的蒽酮类，因此，何首乌制作与煎煮时要忌铁器。何首乌经酒制后，可提高具有生理活性的卵磷脂的溶解性，从而提高了制首乌在治疗神经衰弱，促进血液新生及发育方面的作用。制何首乌的醇提取物能预防鹌鹑实验性高脂血症及动脉粥样硬化，另外，制首乌可以减少发霉，便于贮藏。
1.4 何首乌临床应用中出现肝损害的报道
自20世纪末期开始,国内外不断出现由于服用何首乌或含何首乌的制剂而导致肝损伤的不良反应报道,并引起了一些国家药监部门的高度关注。1993年便开始有关于何首乌肝损害不良反应的报告[35]，个案报告为20篇29例，多案例分析报告5篇，占总案例的78.51%。其中，用药剂型明确的是127例，口服煎剂占30.7%，中成药占69.3%，是导致肝损害的主要用药来源。统计发现，发生肝损害最小的年龄为10岁，最大的70岁；潜伏期一般为2周左右，最长的有达24周，最快的有6-7d，但是此类大多是服用煎剂或者是复发的患者。痊愈的时间一般在1-3个月。
国内学者有关何首乌不良反应的报道最早出现于1996年[36-38]，例如，一名中国香港妇女怀孕期间按推荐剂量服用了首乌片，数周后患上了急性肝炎,实验室检查排除了病毒性肝炎，经过3周治疗后痊愈,而该患者在2年前曾使用首乌汁后也出现过类似症状,在停药后自愈[39]。
截止2008年12月，国外期刊有关何首乌及其制剂导致肝脏损伤的公开报道有6篇[40-45]，如澳大利亚有1例因服用首乌片而引起急性肝炎的病例，该例患者因白发服用推荐剂量的首乌片，服药2周后出现恶心、呕吐、小便黄赤、黄疸以及肝功能异常等症候。患者自述未服用其它药物，实验室检查排除了病毒性肝炎，肝活检结果支持急性中毒性肝炎的诊断,停药并对症治疗1个月后，症状消失，肝功能恢复正常[41]。2004年,一名意大利男子因患上了慢性前列腺炎而服用了推荐剂量的首乌片，在1个月后便出现了黄疸、腹痛、肤黄、小便黄赤以及肝功能异常等症候，超声、核磁共振检查显示肝脏和胆道未见异常，排除其它原因引起的肝炎。经薄层色谱、分光光度测定、微
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
生物学检测等检查结果显示，何首乌片中无污染及次品，提示导致肝中毒的原因与药物的化学成分和使用方法有关[43]。另有，2006年哥伦比亚的1名白人妇女因白发服用了推荐量的首乌制剂，8周后出现了急性肝炎症状。同时还出现了斑丘疹以及轻度嗜酸性粒细胞增多,提示何首乌特异反应的可能性[46]。有关何首乌药材引发的肝脏不良反应的报道不断出现，在加拿大、英国和澳大利亚等国家的药品监督管理部门已经相继出台了相关的监管政策。2006年4月英国药物和保健品产品监管署（MHRA）连续发布两条新闻提示大众服用何首乌有可能会导致肝损害，所以建议在服用含首乌的制剂时应该先咨询医师，如果服用时出现了类似肝损伤的症状应该及时就医进行详细检查。2008年4月澳大利亚医疗用品监管局（TGA）要求含有何首乌的制剂必须标明“服用该制剂可能会导致肝损伤”的字样，并详细分析了何首乌及其相应肝损伤的问题。
从现有的报道看，引发肝损伤的何首乌制剂包括何首乌，含何首乌的复方制剂或中成药，含何首乌的民间偏方，其中服用首乌片而引发肝脏不良反应的比例最大，生首乌与制首乌单独用药中低剂量致肝损伤均不明显，高剂量长期给药会出现一定程度可逆的肝损伤，经对症治疗后多可恢复,或停药后即可自行恢复,即使偶有少数重症病例的报道[47,48]，经对症治疗后也可恢复,尚未出现肝移植、肝衰竭等严重不良反应。然而考虑到何首乌在临床中所起到的广泛的作用，深入调查和研究何首乌的药用安全性问题已经迫在眉睫。
1.5本课题的研究目的和研究思路
中药一向被认为毒副作用少而受到人们的亲睐，然而随着中草药以及中成药在临床或是日常生活中的广泛使用，某些中药的毒副作用时有发生。其中中草药所致肝损害的现象呈逐年上升的趋势。药物性肝损害（drug induced liver injury,DILI）这一名词也开始在中药领域频繁出现，它是指药物在使用过程中，由于药物或其代谢产物引起的肝脏损害，包括细胞毒性损害或对药物及代谢产物的过敏性反应所导致的疾病。它可以发生在健康者或着带有肝病史的病人，在使用此类药物后发生不同程度的肝脏损害。
何首乌是一味平补缓补的中药，该药历来为古今医家、饮食家所推崇，成为滋补肝肾延年益寿的佳品，所以从未因其毒性引起人们的关注。但是近些年来，国内外有关何首乌不良反应的报道逐渐增加,且主要集中在肝脏不良反应上[49]。张力等对国内
陕西中医学院2011届硕士学位论文
1978-2008年间何首乌不良事件回顾中发现38例不良事件中肝损伤的有24例，国外何首乌制剂不良事件12例中均为肝损害表现[3，4]。因此，关于何首乌临床使用的安全性问题引起了医药学界的高度重视。于是对于何首乌的肝毒性的研究便相继展开，首要应该解决的问题是确定致肝损害的物质基础，然而在这方面的研究还是相当匮乏，并且研究过程中所选择的检测指标不够全面深入，不能准确的反应作用靶点。所以，在通过研究大量的文献资料和前期实验结果的基础上，我们选择何首乌中的大黄蒽醌类作为探索肝损害物质基础的切入点，展开何首乌对肝损害的物质基础及其机制的研究。
因此，本课题从分子水平来探究何首乌致肝损害的成分及其机制，同时分析成分与炮制方法的关系，制定了何首乌的不同炮制品在肝损害作用机制方面的实验研究，为进一步探寻何首乌的物质基础致肝损害的机制提供科学依据，也为下一步研究何首乌炮制方法的不同与导致肝损害的关系上提供科研思路。
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
2 实验研究
2.1 何首乌不同成分对肝损害的实验研究
何首乌含有的化学物质极其丰富，在服用何首乌后，是否是其中的某种化学成分对肝脏具有毒性，以及是否是此种物质在体内代谢产生导致肝脏损害的有关毒性成分；同时鉴于研究发现[50]，何首乌毒性与蒽醌类物质有关，蒽醌类物质具有类似肾上腺皮质激素样作用，对肝脏有一定毒性作用。还有人推测[51]，蒽酚衍生物在结肠内形成高活性的蒽酮，被吸收后可引起肝损伤。因此，我们选取了何首乌中的蒽醌类成分作为致肝损害物质基础的研究对象，同时初步探索致肝损害的作用机制。
2.1.1实验材料
2.1.1.1实验用药 制首乌购自西安市药材公司，并经陕西中医学院中药教研室鉴定。大黄酸、大黄素、大黄酚均购买提取物，大黄酸、大黄素纯度达到95%，大黄酚纯度达到98%。
2.1.1.2主要试剂
0.2mol/L 磷酸缓冲液(PH7.4)；谷氨酸氨基转移酶（ALT ）批号 110308010；天门冬氨酸氨基转移酶（AST ）批号 110708008，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；细胞凋亡AnnexinV-FITC 检测试剂盒，批号081125,南京凯基生物科技发展有限公司；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris ）,批号F20080116；低亚硫酸钠（Na 2S 2O 4），批号80116718，
国药集团化学试剂有限公司；无水氯化钙，批号070528，天津市天达净化材料精细化工厂；氯化镁，批号20020104，天津博迪化工有限公司；氯化钾，批号20080805，天津博迪化工有限公司；甲酸，批号20041002，成都科龙化工试剂厂。其他化学试剂均为国产分析纯。
2.1.1.3主要仪器
723分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；精密PH 计；CRANT XB100制冰机；HITACHI (Himac) CR22G Ⅱ高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（SCIENTZ ） (宁波新芝生物科技股份有限公司)；GB-204电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Nikon TS100-F 倒置荧光数码显微镜(日本日立公司)；生化分析仪XD-811（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；CO 气体生成装置(陕西中医学院药学院中药化学实验室自制)。
陕西中医学院2011届硕士学位论文
2.1.1.4实验动物
SD大鼠50只,体重180～220g,雌雄各半，由第四军医大学实验动物中心提供,动物合格证号: SCXK军0708012。SD大鼠颗粒饲料，由第四军医大学实验动物中心按标准配制。
2.1.2实验方法
2.1.2.1药物制备：关于何首乌临床用量的记载并不统一，我们参考《中药学》新世纪教材（中国中医药出版社）的用量10-30g,根据何首乌临床报道用量12-100g不等，以及文献资料的统计分析，本实验选择何首乌的临床剂量成人每日40g为实验用量依据，以相关文献资料结果为参考用量确定实验用药各成分含量。分别称取大黄素,大黄酸，大黄酚，用蒸馏水溶解，浓度依次为1.89mg/ml,15.6ug/ml,8.8ug/ml。称取制首乌,加6倍量的水，煎煮60min，两次，将药液合并，浓缩至0.667g/ml。密封后放于4℃冰箱储存备用。
2.1.2.2动物分组及给药
50只SD大鼠，先适应性饲养1周，普饲，自由饮水，动物室内温度为23±2℃，相对湿度为50%±5%，经常换气，普通照明。一周后，对每只动物称重编号，根据随机化原则将大鼠分为5组，雌雄分笼喂养。即制首乌组10只、大黄素组10只、大黄酸组10只、大黄酚组10只、对照组10只。给药组均按1ml/(100g?d)分别灌服相应药物,每日1次。各组给药浓度为：制首乌(6.67g/kg,相当于人常规用量10倍）、大黄素(18.9mg/kg,相当于6.67g/kg何首乌提取量)、大黄酸(156μg/kg,相当于6.67g/kg 何首乌提取量)、大黄酚(88μg/kg,相当于6.67g/kg何首乌提取量)。连续灌胃给药90d，对照组给予等体积的蒸馏水。各组动物每周称重一次，根据体重调整给药体积[52]。末次灌胃给药后，禁食12-16小时。
2.1.2.3一般情况观察
实验期间每天观察动物给药后的一般状况，包括：生长情况、毛色、食欲行动、精神状态、大小便、呼吸及其他异常情况等。记录饲料、水的每日消耗量，每周称大鼠体重1次，并做记录。
2.1.2.4血液生化指标检测
末次灌胃给药后禁食12-16小时，摘眼球取血，分离血清，用XD-811生化分析仪
何首乌对肝脏损害的物质基础及其机制研究
进行血液生化项目检测。
检测指标：谷氨酸氨基转移酶（ALT）,天门冬氨酸氨基转移酶（AST）。
2.1.2.5肝细胞凋亡的检测
（1）原理：Annexin-V荧光素探针标记法是判断早期细胞凋亡的指标[53]。活细胞膜脂质双层内侧的磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）在细胞凋亡早期翻转至细胞外侧，抗凝剂annexin-V与PS有较高亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。碘化丙啶（propidium iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但是对于凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，由于胞膜完整性被破坏，PI可透过细胞膜使细胞核染红，因此将荧光标记的annexin-V与DNA染料PI匹配使用，以区分活细胞（annexin-V和PI双阴性）、凋亡早期（annexin-V阳性、PI阴性）、坏死细胞（annexin-V和PI双阳性）。利用荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞凋亡的发生[54]。光镜下观察到凋亡细胞核致密深染、胞体变小、有时核裂解成碎片。光镜辨认较为特异、客观，以确定细胞凋亡指数。流式细胞仪进行双参数检测，能够很好的区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞，同时测定细胞凋亡率。
（2）肝细胞悬液的制备：颈总动脉处死大鼠，立即取出2mm×2mm×1mm左右的小块肝左叶组织，用PBS浸泡，悬空于200目筛网上，用注射器针芯轻轻研磨肝组织过滤，制成单细胞悬液［55］。
（3）肝细胞凋亡检测：取制备好的肝细胞悬液1ml，2000rpm/min 4℃离心5min，弃去上清液；加入1ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；2000 rpm/min 4℃离心5min，弃去上清液；反复洗涤2次；将细胞重悬于500ul的Binding Buffer；加入
5ulAnnexinV-FITC和5ulPropidium Iodide，混匀，室温避光反应15min，滴一滴染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞，将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察，AnnexinV-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。观察时不少于5个高倍视野(×400),以平均每100个细胞核中含有的凋亡细胞个数作为凋亡指数。
2.1.2.6肝脏细胞色素P450的检测
（1）原理：细胞色素P450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原和与一氧化碳形成复合物时出现一特异性吸收峰，在波长大约450nm处呈现最大的吸收峰，细胞色素P-450即由此得名，450～490nm波长的消光系数经精确测定为91NM-1cm-1。因此，