实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测
一、实验目的与原理简介
质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等）。④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。二．实验试剂
1，SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I)，高压灭菌，4°保存。
2，SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。使用前将两种溶液混合。
3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。高压灭菌，4°保存。
4，TE 100ml：1M Tris-HCl（pH8.0）1ml， 0.5 M EDTA 0.2 ml, 加DDW 至100ml。高压灭菌！
5，70%乙醇
6，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
7，无菌水DDW
三、实验步骤
按1/100的比例接种保存的pPIC9K大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数生长期)。将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37℃、250rpm剧烈震荡培养过夜。
1、离心管（10mL）分装菌10ml，离心去上清（10000rpm，5min，4℃）；弃上
清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
2、重悬于800μl 冰冷的SolⅠ中；剧烈震荡重悬菌体。
3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min（SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
4、加入1.2mL冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min。
5、4℃，12000rpm离心10min。SolⅢ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,沉淀核酸，室温放置大于10min。12000rpm离心5min，小心移出上清于一新离心管中。
7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心 5 min。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于50μl DDW中，储于-20℃冰箱中。
实验二基因的PCR扩增技术
一、实验目的与原理简介
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：
1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA 酶的特异性活性约为80000单位/mg.
2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP 与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源
的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8
之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温
度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp
长度的DNA是有益的。
7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合
液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。
学习PCR反应的基本原理和基本技术。
了解引物设计的一般要求。
二、材料和试剂
10Х扩增缓冲液
4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0）
Tap DNA 聚合酶
5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）
模板DNA
琼脂糖凝胶
PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量
移液管
二、实验操作
1）将各成分加到微量离子管内混合：
10Х扩增缓冲液 2.5μl
M g2+ 1.5μl
5端引物1μl
3端引物1μl
D D W16.2μl
d N T P 2.5μl
T a q酶0.3μl
模板 1 μl 2）按照以下方法进行PCR扩增：
预变性： 95oC 5min
35个循环： 94 oC 1min,63 oC 1min, 72 oC 1min；
延伸： 72 oC 10min
注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来
的。
3）抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果，用DNA marker
来判断扩增片段的大小。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大
小。
从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的
效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。
三、
问
题
可能原因解决方法
无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度，调整模板用量
模板降解重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板
引物浓度不足调整引物浓度，特别是针对长片段PCR
引物存在二级结构重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度
引物降解引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融
Mg2+浓度偏低
适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递
增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
dNTP降解-20℃保存，小量分装，避免反复冻融
酶纯度低，扩增效率差选用高质量DNA聚合酶
酶量不足适当增加酶量
用酶不当
针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选
择指南)
缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系
模板变性不充分
适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始
变性温度至98℃
退火温度偏高降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃
延伸时间不足增加延伸时间，特别是针对长片段PCR
循环数目不够增加循环数
PCR管污染
质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭
菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用
PCR仪故障检查程序和模块温度
其他使用PCR增强剂
非特异产物过多体系污染设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度
引物序列特异性差重新设计引物
Mg2+浓度过高
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，
针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
dNTP浓度过高降低dNTP浓度
酶量过多减少酶量，以0.5 U间隔递减
退火温度过低提高退火温度
延伸时间过短增加延伸时间，以1 min间隔递增
循环次数过多减少循环次数
模板结构过于复杂或目标片
段过长
特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增
强剂
其他
HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR
引物二聚体引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR
拖引物浓度过高调整引物浓度
引物序列特异性差或模板上
存在同源序列
重新设计引物
模板降解重新制备模板
模板浓度过高降低模板浓度
dNTP浓度过高减少dNTP用量
Mg2+浓度过高
降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，
针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度
实验三、酶切与连接
一、实验目的与原理简介
限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带：而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面：1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接方式；5）接头状态。
酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同一DNA片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因的克隆。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。
二、材料和试剂
限制性内切栈酶XhoI、EcoRI；10×Buffer PCR产物、pPIC9K质粒、10×T4连接Buffer、T4 Ligase、DDW、琼脂糖、电泳缓冲液、Goldview染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪
三、实验步骤
1）PCR产物双酶切（XhoI、EcoRI），pPI9K质粒双酶切(XhoI部分酶切、EcoRI 完全酶切)；PCR体系如下：
产物PCR体系产物PCR体系DDW 23μl DDW23μl
10×H Buffer 5μl 10×H Buffer5μl PCR产物20μl PCR产物20μl
XhoI 1μl XhoI1μl
EcoRI 1μl(37℃恒温4小时) EcoRI1μl(37℃恒温4小时)
以上两步酶切都要制备两管,酶产物置于-20℃,电泳检测酶切结果并回收一管做连接.由于pPI9K质粒有两个XhoI酶切位点(1193\5730),故采用部分酶切法,并电泳回收,酶切后9K大小的线性片段用于连接。PCR产物双酶切可用乙醇沉淀回收。
2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV，260nm）。
3）切胶回收（尽量更要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。4）回收产物电泳检测后进行连接：
连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl
目的基因 6μl
质粒载体 2μl
T4 Ligase 1μl
混合后16℃，过夜连接。完成后放入4℃冰箱可，备用。
四、注意事项
1、加样次序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶。
2、限制性内切酶的量不要过多，最多不超过部体积的1/10，否则易发生酶的星号反应。所谓酶的星号反应就是指改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降，导致酶切图谱混乱的现象。
3、内芭栈瓣选择和使用方案须根据具体的实验情况来精心设计。
4、限制性内切酶和连接酶都极易失活，须在冰盒上操作，同时防止污染。
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化
一、实验原理与目的
感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。用CaCl
处
2
理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；
学习CaCl
2
掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
二、材料与试剂
1.5ml EP管灭菌枪头移液枪冰盒低温离心机涂布
棒大肠杆菌Top10、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、
氨苄青霉素储存液 0.1M CaCl
2
三、实验方法
法）
1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl
2
1 ）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌Top10菌液 30μl （过夜菌液约16
小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过
夜；（OD=0.2—0.4）。
2 ）将过夜培养的菌液移入3ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至
OD=0.4—0.6（约2小时）；冰浴30分钟，使培养物冷却至0度。
3 ）取1ml菌液于1.5ml EP管中，4度时4000rpm离心10分钟，去上清。（倒
出培养液将管倒置 1 分钟，以使前后残留的培养液流尽。）沉淀用1ml
（抽滤灭菌）悬浮，混合均匀，置于冰浴上30min 。
冰上预泠的0.1M CaCl
2
4 ）4度4000rpm离心10min，去上清沉淀再加200μl的0.1M CaCl
重悬，冰
2上放置2-7h 后可用于转化；或者每管加20-30%的灭菌甘油，-70℃保存。
2、转化大肠杆菌感受态胞
1）取上述方法制备的感受态细胞，或者从-70℃超低温冰箱取出一管感受态细胞融化。
2）按每200μl菌液加100ng已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将5-10μlDNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30min。（同时作两个对照组即受体菌对照组（-）和质粒DNA对照组（+），检测感受态细胞的质量及有无污染情况）
3）42℃水浴中热激90sec，迅速取出立即放于冰上2min 。注意：在水浴中切勿乱晃动。
4）上述各管中分别加入800μl 37℃预热的LB培养基至总体积为1ml，混匀后37℃ 180rpm培养1-2小时左右复苏。
5）4000rpm离心10min，去800μl上清液，将剩余的200μl菌液混匀。
6）用烧烤过的涂布将100μl的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB 固体培养基，涂匀，置于超净台上1小时左右至菌液完全被培养基吸收。
7）37℃倒置培养12-24小时。从平板上挑选抗性菌落进行鉴定。
四、主意事项
值为0.4左右，
1、为了提高转化效率活细胞数务必少于108个/ml，即OD
600
为了确保生长浓度不会太高，可每隔15-20min进行一次OD值监测。
2、热激是一个非常重要的步骤，应准确的达到热激所需要的温度的时间。
3、如果加入太多的菌落裂解液，会改变了反应混合液的离子平衡，导致实验失败。
4、PCR扩增对DNA模板的要求量很低，因而在利用菌落裂解液作为模板时，应避免加入过量的模板DNA样品。
5、偶尔带入琼脂碎片于反应混合液中，会抑制的热稳定性DNA聚合酶的扩增。
实验五菌落PCR筛选阳性重组子及重组质粒的酶切鉴定
菌落PCR鉴定
1）反应体系： 10Х扩增缓冲液 2.5μl
Mg2+ 2.5μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
DDW 14.5μl
dNTP 2.5μl
taq 酶 0.3μl
模板为菌落
用灭菌的200μl的枪头挑选一个个细菌菌落，迅速的使挑取物溶于25μl 的主混合液中，30个克隆另加一个阳性对照。
2）完全混合后，将反应管放于PCR 仪上，按照变性、复性、延伸三种程序设定温度、时间、循环次数。进行反应。程序设定同实验一。
3）抽取每种扩增产物5-10μl，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小。
实验六、质粒酶切及电转化毕赤酵母
一、实验原理及目的
核酸不能自动进入细胞，需要协助才能穿过细胞壁的物理屏障进入能够进行表达或复制的胞内位点。电流可逆性的击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔，促使DNA分子进入胞内。电场强度为kV/ cm、持续时间为μs —ms 级的电脉冲刺激会使细胞膜发生电穿孔现象,即:细胞膜结构重组,出现微孔,电导率改变,暂时
丧失屏障功能等,从而引起离子的流出, 代谢物的排泄, 细胞对药剂及DNA 等大分子的吸收量增加。线性DNA分子与环状DNA分子均可用于转染，但线性DNA无论是瞬时表达还是稳定转染的水平高于环状分子。所以对于闭合环状的质粒DNA来说，要首先利用限制性内切酶切割使其变成线性分子，然后进行转染。
同时转染的效率还会以下因素影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、培养基的离子成分。
掌握电穿孔转染DNA技术。
二、材料和试剂（两组共配一次）
RDB培养基 1、取Sorbitol 18.6g 及琼脂 2 g 溶于70ml水中。
2、10ХD 10ml （8g葡萄糖，40mlDDW）
10 YNB 10ml （13.4gYNB 100mlDDW 过滤除菌） 500Х B 0.2ml ( 2mg 生物素，10ml水，过滤除菌) 100ХAA 1.0ml （过滤除菌）
DDW 8.8ml
将1、2 两种溶液混合，加热后倒平板，每个平板10ml.共10个平板。
MD培养基（100）：Yeast extract 1g
Peptone 2 g
10×D 10ml 加水至100ml，高压灭菌
三、实验步骤
I、线性化质粒的制备
SacI酶切质粒3小时
酶切体系（根据质粒浓度而定，保定质粒浓度DNA大于1μg/μl）
DDW 16.5μl
BufferI 2.5μl
质粒 5μl
SacI 1μl
和电泳检测酶切结果，回收质粒
II、酵母感受态细胞的制备：
1、按1：100将300μl保种菌接种于3mlYPD培养基中30℃揺菌过夜（约15h）
2、取活化的菌液50μl接入50mlYPD液体培养基30℃揺菌过夜，至OD600
=1.3-1.5（12-15h），收集菌体制备感受态细胞。
3、4℃ 3000g离心5分钟，弃上清，向沉淀加5ml无菌DDW重悬，补加冰预冷
的无菌水至100ml
4、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于15ml冰预冷的无菌水中
5、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于3ml冰预冷的山梨醇中
6、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于0.1ml冰预冷的山梨醇中
7、按照80μl每管分装于1.5mlEP管中，立即使用或于-20℃存放
III、电转化
1、将感受态细胞80μl加入10μl（5-20μg）线性化质粒，混匀，加入到冰
预冷的电转杯中，冰上放置5分钟。
2、设置电转仪于真核细胞程序，电转条件：1.5KV 25μF 200ΩIV、阳性克隆筛选
1、电转成功后，将菌液涂于RDB板上，30℃恒温培养箱培养2-3天，观察克隆生长状况。
2、长出克隆后挑选单菌落作PCR，鉴定其是否为阳性克隆。若获得阳性克
隆则揺菌保种，划线鉴定，小量表达，电泳检测目的基因。
实验七重组蛋白的表达及western blot 鉴定
表达试剂：10×D 10×YNB 500×B（实验六中已配）
10×GY： 10ml甘油，90ml水，高压灭菌。
10×M：5ml 甲醇加水至100ml，过滤除菌。
1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）:13.2 ml1M K2HPO4,86.8ml 1M KH2PO4,调至PH6.0。
（1M K2HPO4：22.822g，80ml水溶，定容至100ml；1M KH2PO4：6.8g，40ml水溶，定容至50ml）
BMGY培养基：4gYE，8gTryptone，280mlDDW，高压灭菌后，超净台中加10×GY，10×YNB，1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）各40ml，0.8ml 500×B
BMMY培养基：1gYE，2gTryptone，70mlDDW，高压灭菌后，超净台中加10×M，10×YNB，1M磷酸钾缓冲液（ph6.0）各10ml，0.2ml 500×B
挑酵母重组子接种于3ml YPD，摇菌过夜（16h），转接于400ml BMGY培养基摇培24h，静置4h左右，倒掉上清，加入100mlBMMY，摇培30h左右，添加1ml
甲醇，24h后再添加1ml甲醇，24h后收菌，12000rpm 离心15min，留上清。western blot 鉴定
样品准备
不同发酵时间的发酵液（900ul），TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。
1加脱氧胆酸钠至0.02％终浓度，混匀室温放置至少15min
2加100％TCA至10％终浓度，混匀，室温至少放置1h
3 4度14000转离心10分钟，弃上清，倒置干燥
3 加冰预冷的丙酮，混合，低温放置至少20分钟
5 4度最高转速离心10分钟，倒上清，倒置干燥丙酮
30ul一乘上样缓冲液溶解沉淀，沸水煮5分钟
总体时间3小时
所用试剂：
转膜缓冲液：（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多
使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
TBS缓冲液：（10mM Tris-Hcl pH7.5, 150mmol/L NaCl）
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
10×TBS: Tris 12.11g ，NaCl 88g
蒸馏水至 900ml，调节pH至7.5，定容1000ml
Tris 4.844g ，NaCl 35.2g 。蒸馏水至 350ml，调节pH至7.5，定容400ml
TBST缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液：脱脂奶粉 5g
TBST 100ml
最好现用现配。
或者用含5%BSA的TBST
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
一．制备凝胶
样品制备过程中，制备凝胶
5％浓缩胶12％分离胶
配制凝固时间：分离胶30分钟，浓缩胶50分钟
电泳时间：80V二十分钟，100V 100分钟左右。
可以降低电压，60V 80V
滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-10分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
转膜
1.准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
2.甲醇活性化PVDF膜：一般活化5-10min，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。
3.转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。
4.半干法转膜：在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；膜盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将分离胶盖于膜上，并除气泡。在分离胶上盖3张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。
5.盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪15V 45-60min
6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min（平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。将膜晾干备用。
封闭：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。用TBS将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)。
孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA的TBST）稀释至适当浓度（在1.5ml 离心管中）；将PVDF膜放入PE手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液
加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h后，
用TBST在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST），每次10min；
再用TBS洗一次， 5min。
孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗一次，5min。
一抗推荐稀释比例：1:200-1:2000
二抗推荐稀释比例：1:5000-1:100,0000
先前做过两次实验：一抗1:500，二抗1:2000，背景较重，出现非特异条带。
这次做可以先把二抗浓度改为1:20000，一抗：1:500 1:1000
DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
ECL灵敏度比DAB高不少
实验八重组蛋白的纯化
上步所得上清，进行65%硫酸铵沉淀，每100ml上清加39.8硫酸铵（冰上操作，手动搅拌，不要剧烈），4°放置2h（可过夜）。12000rpm 离心15min，2ml Tris 缓冲液溶解，将溶解的液体放入透析袋，透析约16h，每隔6h换一次透析液，透析完毕后过离子交换层析柱（Q柱）。
5×Tris缓冲液： Tris 12.114g/L PH调至8.0
1×Tris缓冲液：5×Tris缓冲液稀释4倍
300mM NaCl洗脱液： 3.5064g NaCl，200ml 1×Tris缓冲液
500mM NaCl洗脱液：5.844g NaCl，200ml 1×Tris缓冲液
1M NaCl洗脱液：11.688g NaCl，200ml 1×Tris缓冲液
孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料小麦面粉(1000 g) 2．主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2； 10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。 （5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年月日
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
一.选择题 1.唾液淀粉酶应属于下列那一类酶( D ); A 蛋白酶类 B 合成酶类 C 裂解酶类 D 水解酶类 2.酶活性部位上的基团一定是( A ); A 必需基团 B 结合基团 C 催化基团 D 非必需基团 3.实验上,丙二酸能抑制琥珀酸脱氢酶的活性,但可用增加底物浓度的方法来消除其抑制,这种抑制称为( C ); A 不可逆抑制 B 非竟争性抑制 C 竟争性抑制 D 非竟争性抑制的特殊形式 4.动物体肝脏内,若葡萄糖经糖酵解反应进行到3-磷酸甘油酸即停止了,则此过程可净生成( A )ATP; A 0 B －１ C 2 D 3 5.磷酸戊糖途径中,氢受体为( B ); A NAD+ B NADP+ C FA D D FMN 6.高等动物体内NADH呼吸链中,下列那一种化合物不是其电子传递体( D ); A 辅酶Q B 细胞色素b C 铁硫蛋白 D FAD 7.根据化学渗透假说理论,电子沿呼吸链传递时,在线粒体内产生了膜电势,其中下列正确的是( A ); A 内膜外侧为正,内侧为负 B 内膜外侧为负,内侧为正 C 外膜外侧为正,内侧为负 D 外膜外侧为负,内侧为正 8.动物体内,脂酰CoA经β-氧化作用脱氢,则这对氢原子可生成( B )分子ATP; A 3 B 2 C 4 D 1 9.高等动物体内,游离脂肪酸可通过下列那一种形式转运( C ); A 血浆脂蛋白 B 高密度脂蛋白 C 可溶性复合体 D 乳糜微粒 10.对于高等动物,下列属于必需氨基酸的是(B ); A 丙氨酸 B 苏氨酸 C 谷氨酰胺 D 脯氨酸 11.高等动物体内,谷丙转氨酶(GPT)最可能催化丙酮酸与下列那一种化合物反应( D );
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗
入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
2015年中考生物、化学实验操作试题 一、观察根尖的结构 实验要求 1、熟练正确使用光学显微镜，在低倍镜下观察根尖 纵切的永久切片。 2、识别根尖的基本结构，正确指出成熟区。 材料器具 显微镜、植物根尖纵切永久切片、擦镜纸、纱布。 注：出现评分细则外的错误操作扣1分，造成严重后果扣2分
二、制作并观察洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片 1、熟练正确制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片。 2、正确使用显微镜，在低倍镜下对装片进行观察。 材料用具 显微镜、胶头滴管、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、解剖针、白瓷盘、碘液、吸水纸、擦镜 纸、清水、干净纱布、洋葱鳞片叶
注：出现评分细则外的错误操作扣1分，造成严重后果扣2分 三、用显微镜观察番茄果肉细胞 实验要求 1、熟练正确制作番茄果肉细胞临时装片。 2、正确使用显微镜，在低倍镜下对装片进行观察。 材料用具 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、白瓷盘、胶头滴管、清水、纱布、擦镜纸、吸水纸、番茄 实验操作规则及评分标准 注：出现评分细则外的错误操作扣1分，造成严重后果扣2分
四、观察种子的结构 实验要求 1、观察大豆、玉米种子外形，识别种子的基本结构，指出大豆种子的种脐。 2、熟练处理、和解剖大豆和玉米种子，按照正确的程序观察种子的结构。依据观察绘出大豆种子胚示意图并标出各部分名称。指出玉米种子纵剖面的胚和胚乳。 材料用具
五、制作叶片的临时切片 1、熟练正确制作叶片临时切片。 2、正确使用显微镜，在低倍镜下对装片进行观察。 材料用具 显微镜、白瓷盘、滴管、载玻片、盖玻片、双面刀片（每组2片；两片并齐，一侧用胶布粘 牢）、镊子、盛有清水的培养皿、纱布、清水、吸水纸、擦镜纸、新鲜植物（菠菜、油菜等） 的叶片 实验操作规则及评分标准
生化实验讲义思考题参考答案 实验一淀粉的提取和水解 1、实验材料的选择依据是什么？ 答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。从科研工作的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。 2、材料的破碎方法有哪些？ 答：(1) 机械的方法：包括研磨法、组织捣碎法； (2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等； (3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。 实验二总糖与还原糖的测定 1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？ 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反应产物的过程中容易引入误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。 实验五粗脂肪的定量测定─索氏提取法 （1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ 答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热? 答：防止脂质被氧化。 实验六蛋白质等电点测定 1、在分离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？ 答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋
白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质分离。 实验七氨基酸的分离鉴定－纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定？ 答: 将标准的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析，显色后根据斑点的Rf值，就可以对氨基酸进行初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有相同的Rf 值；将点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。 3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ 答: 实验八蛋白质含量的测定 (1) 简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。 答：原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
1.氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 ?了解层析技术的一般原理 ?掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分 二、实验原理 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用R f来表示 分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用R f值表示： 在一定条件下，某种物质的R f值是常数。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理： 质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质 一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质
生物化学实验（2）理论习题 一、名词解释题 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略，当蛋白质的分子量在15KD到200KD时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 2、电泳：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。 3 4、吸附色谱法：，利用同一吸附剂对混合物中各组份的吸附能力的差异，从而使各组分达到分离的目的。 5 6、分配层析：是根据一种或者多种化合物，在两种不相混合的溶剂间的分配来分离物质的方法，相当于一种连续液一液猝取法。 8、：凝胶层析（凝胶色谱）：混合物随着流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的方法。 9 10 态均匀地分布在其表面。 11、死时间：死时间（dead time）,从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间. （所谓惰气指的是与色谱固定相无相互作用的组分，也就是说它能与进样瞬间的载气同时进入检测器。所以惰气出峰时间反映载气流过系统的时间。载气流速一定，此时间不变，故称死时间。）12、保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用RT表示，常以分（min）为时间单 13 二、填空题
1、蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（离子交换色谱），（高效液相色谱）和（亲和色 谱法）。 2、离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有（离子强度梯度）和（pH梯度）。 3、根据分离机理的不同，色谱法可分为（吸附色谱），（离子交换色谱），（凝胶色谱），（分配色谱）和（亲和色谱）。 4、聚丙烯酰胺凝胶由（单体丙烯酰胺）和（甲叉（或亚甲基）双丙烯酰胺）聚合而成，聚合时以（过硫酸铵）为催化剂，以（四甲基乙二胺）为加速剂。 5、离子交换树脂主要分为（阳离子交换树脂）和（阴离子交换树脂）两类 6、气相色谱仪的核心部件是（色谱柱）。 7、SDS-PAGE电泳中，SDS的作用是（使蛋白质变性），β-巯基乙醇的作用是（破坏蛋白质的二硫键）。 8、不连续体系的SDS-PAGE电泳分离蛋白质时，具有（电荷效应）、（分子筛效应）、（浓缩效应）三种效应。 9、食品中亚硝酸盐含量测定中，硼砂主要起到（提取亚硝酸盐）和（沉淀蛋白质）的作用。 10、亚硝酸盐提取过程中，加入的亚铁氰化钾及硫酸锌的作用是（沉淀蛋白质）。 11、亚硝酸盐作为食品添加剂允许在食品加工中限量使用，具有（防腐或抑菌）、（增色）、和产生风味的作用。 12、亚硝酸盐提取过程中，制作标准曲线时，先在弱酸条件下在亚硝酸盐中加入（对氨基苯磺酸），然后再加入（盐酸萘乙二胺），偶合形成（紫红色）染料后，用分光光度法进行测定。13、凝胶层析中，先被洗脱下来的是相对分子质量（大）的分子，而SDS-PAGE中跑的快的是相对分子质量（小）的分子。 三、选择题 1、下面关于SDS的说法正确的是：（ A ） A、常用的变性剂 B、常用的提取试剂 C、常用的盐析剂 D、常用的萃取剂 2、琼脂糖凝胶孔径由（ B ）决定的 A、交联度 B、琼脂糖浓度 C、琼脂糖密度 D、颗粒大小 3、HPLC是哪种色谱的简称：（ C ）： A、离子交换色谱 B、气相色谱 C、高效液相色谱 D、凝胶色谱 4、针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是：（ C ） A、凝胶过滤 B、离子交换层析 C、亲和层析 D、纸层析 5、盐析法沉淀蛋白质的原理是：（ B ）