分子克隆技术:指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术
克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来
DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子
SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始
启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位
基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。
转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。
转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。
感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程
选择：转化子的初步筛选：通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。
筛选：进一步检测目的重组子：通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。
启动子：DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列
SD序列：核糖体结合位点
终止子：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3 ’ 端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子
融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA 的完整序列编码。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程
重组子：含有重组DNA分子的转化子
转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞
供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件
DNA体外重组的基本步骤1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记的载体分子上。3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
基因工程的基本操作步骤：1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2. 重组体的制备将目的基因的DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物
载体应具备的条件： 1.具有对受体细胞的可转移 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记。
限制性内切酶的命名原则前3个字母代表来源的生物,随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株,最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序
star activity高浓度的酶（>100U/g）、高浓度的甘油（>5%）、低离子强度（<25mM）、极端pH值(>pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的star activity现象.
抑制star activity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③提高离子强度到100～150mM ④降低反应pH至pH7.0 ⑤使用Mg2+作为二价阳离子
DNA连接酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA 链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。
体外连接DNA片段的方式黏性末端同种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端的连接。平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连杆（linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接，DNA接头(adapter)连接法。
平末端DNA片段的连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。
载体应具备的条件1. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 具有多种单一的酶切位点4. 具有合适的选择性标记自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力
质粒DNA的复制类型严谨型质粒松弛型质粒
天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想
构建质粒克隆载体的基本策略1能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。2含多克
隆位点3含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4 DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。5根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。
质粒克隆载体的构建1选择合适的出发质粒2正确获得构建质粒克隆载体的元件3组装合适的选择标记基因4选用合适的启动子5构建过程力求简单
DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
蓝白斑筛选Ampicillin 抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝
Ti质粒介导转化的过程①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化④vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中
TA克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
TA克隆注意事项1. 要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2. PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3. 在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
真核生物的启动子：真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。
1.RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。
2.RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂；
3.RNA聚合酶III转录tRNA和5S rRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称为下游启动子。
目的基因的获得:直接分离法;PCR扩增;构建基因组文库法;构建cDNA文库法;化学合成法直接分离法:限制酶酶切法(DNA分子已测序/目的基因已定位)
基因组文库的构建(DNA未测序或未定位)：
采用限制酶切割
构建基因组文库
筛选目的基因克隆
基因文库构建的一般步骤：
（1）染色体DNA大片段的制备
①酶切法
②物理切割法
（2）载体与基因组DNA大片段的连接
①粘性末端直接连接
②人工接头法
（3）转导受体
（4）筛选重组子
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。
cDNA文库的特点
优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建
缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的
序列
构建cDNA文库的一般步骤：
（1）总RNA（total RNA）提取
（2）mRNA的分离纯化
①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。
②mRNA的分离纯化Column（柱）
（3）cDNA的合成
①cDNA第一链合成
②降解mRNA模板
③cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）
（4）cDNA与载体连接：
（5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）
基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成
目的基因的分离：
目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因
目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法
基因克隆的方法：
一、目的基因的功能克隆
二、序列克隆法
三、差别杂交法
四、减法杂交技术
五、mRNA差别显示技术
功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因
表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等
无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆
目的基因的功能克隆：在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因
1、根据特异蛋白分离目的基因
分离、纯化目的蛋白
测定特异的氨基酸顺序
推测编码该蛋白的核苷酸序列
人工合成一段寡核苷酸探针
从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因
分离、纯化目的蛋白
目的蛋白免疫动物，制备抗体
从cDNA表达文库中筛选目的基因
根据特异蛋白分离目的基因局限性：
特异蛋白已鉴定并分离纯化
某些基因产物，难以分离纯化
非所有基因有蛋白质产物
遗传密码的简并性
2、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段与宿主细胞染色体DNA具有功能互补。筛选营养缺陷型互补基因
序列克隆法：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因；采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离
差别杂交法：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因；受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因
应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。
基本过程：制备两种细胞群体的的mRNA提取物；以两种总mRNA或cDNA为探针；以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库
局限性：
灵敏度比较低，不适于低丰度mRNA目的基因分离
需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑
差别杂交重复性较差
不同滤膜间DNA保有量不均一
杂交信号强度不一致
重新点杂交
减法杂交技术：又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交
本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性
mRNA减法杂交；基因组减法杂交
感受态细胞的制备：
1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜
2、按1％的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状)
3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干
4、加入1mL 预冷的无菌0.1mol·L-1 CaCl2溶液涡旋，4℃下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清
5、沉淀以50-100μL 预冷的0.1mol·L-1 CaCl2重悬，4℃保存备用，7d内可用。
大肠杆菌的转化方法：
1.Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法
CaCl2 的诱导原因：在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca 2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态
Ca 2＋能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。
对照试验：转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性
2.电穿孔转化法
基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。
影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度
3.三亲本杂交接合转化大肠杆菌
重组DNA分子导入植物细胞
（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
作用机制：将待转移的目的基因组入农杆菌中的Ti质粒载体；农杆菌识别敏感植物，将Ti 质粒的T-DNA转移到植物细胞内部
基本程序：选择合适的外植体；农杆菌的接种操作；洗菌并筛选培养
常用方法：
1.创伤植株感染法
2.共培养感染法：叶盘转化法；植物愈伤组织共培养转化法；植物悬浮细胞共培养转化法；原生质体共培养转化法
（2）DNA的直接转移法：多聚物介导法；电穿孔转化法；激光微束穿孔转化法；显微注射法；超声波介导转化法；基因枪法；脂质体介导法；花粉管通道法
重组DNA分子导入哺乳动物细胞
病毒介导的转染：病毒颗粒转导法
生化转染：磷酸钙转染法；DEAE－葡聚糖转染法；聚阳离子－DMSO转染法；脂质体介导法
物理转染：显微注射法；电穿孔法
常见的筛选重组子方法
1 遗传表型直接筛选：抗药性筛选；插入失活筛选法；插入表达筛选法；显色互补筛选法
2 PCR法鉴定
3 酶切法鉴定
4 杂交法鉴定：Southern blot；Northern blot；Western blot 等
5 测序
原核生物基因表达的特点
①只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。
②基因的表达是以操纵子为单位的。
③原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。
④原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。
⑥mRNA的核糖体结合位点上，含有一个S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
启动子的特性：列特异性；向性；置特异性；属特异性
几种类型的原核表达载体
非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白
优点：它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。
缺点：易被细菌蛋白酶破坏。
融合蛋白：由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起。
优点：大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；于分离纯化
影响基因表达效率的因素：启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等
提高基因表达效率的途径：
1.采用强启动子；35和-10区之间保持的距离（16～19bp）
2.确定合适的SD序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游的碱基成分
3.起始密码子和S-D序列之间的距离必须接近到一定程度（7个核苷酸时最合适）
4.在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基因的表达效率)控制在一个正常的水平上。
5.提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上）
6.轻细胞的代谢负荷：
（1）诱导表达：细菌的生长与外源基因的表达分开，是减轻宿主细胞代谢负荷的最为常用的一个方法
(2) 表达载体的诱导复制：将宿主菌的生长和质粒的复制分开
7.高表达蛋白的稳定性，防止其降解
(1)克隆一段原核序列，表达融合蛋白
(2)采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解
(3)表达分泌蛋白
基因工程的应用：
医药业：疾病的预防;病的诊断;病的治疗
农业及食品工业:提高作物抗性;良作物品质;长果实货架期;用农作物生产药物
畜牧业;工食品
环境:环境检测;环境净化
情感语录
1.爱情合适就好，不要委屈将就，只要随意，彼此之间不要太大压力
2.时间会把最正确的人带到你身边，在此之前，你要做的，是好好的照顾自己
3.女人的眼泪是最无用的液体，但你让女人流泪说明你很无用
4.总有一天，你会遇上那个人，陪你看日出，直到你的人生落幕
5.最美的感动是我以为人去楼空的时候你依然在
6.我莫名其妙的地笑了，原来只因为想到了你
7.会离开的都是废品，能抢走的都是垃圾
8.其实你不知道，如果可以，我愿意把整颗心都刻满你的名字
9.女人谁不愿意青春永驻，但我愿意用来换一个疼我的你
10.我们和好吧，我想和你拌嘴吵架，想闹小脾气，想为了你哭鼻子，我想你了
11.如此情深，却难以启齿。其实你若真爱一个人，内心酸涩，反而会说不出话来
12.生命中有一些人与我们擦肩了，却来不及遇见；遇见了，却
来不及相识；相识了，却来不及熟悉，却还要是再见
13.对自己好点，因为一辈子不长；对身边的人好点，因为下辈子不一定能遇见
14.世上总有一颗心在期待、呼唤着另一颗心
15.离开之后，我想你不要忘记一件事：不要忘记想念我。想念我的时候，不要忘记我也在想念你
16.有一种缘分叫钟情，有一种感觉叫曾经拥有，有一种结局叫命中注定，有一种心痛叫绵绵无期
17.冷战也好，委屈也罢，不管什么时候，只要你一句软话，一个微笑或者一个拥抱，我都能笑着原谅
18.不要等到秋天，才说春风曾经吹过;不要等到分别，才说彼此曾经爱过
19.从没想过，自己可以爱的这么卑微，卑微的只因为你的一句话就欣喜不已
20.当我为你掉眼泪时，你有没有心疼过
小学自然实验报告模板 教学模式是在一定的教学思想或教学理论的指导下建立起来的，较为稳定的教学活动结构框架和活动程序。“结构框架”意在从宏观把握教学活动整体各要素之间的内部关系；“活动程序”意在突出教学模式的有序性和可行性。 自然学科是人类在认识自然的过程中所积累的知识。它与人的认识过程有较高的一致性，最适用于发现式的学习方法。实验是传授自然科学知识和培养与发展学生各种能力的重要手段。我校的教研组推出的四环节实验课教学模式，以其较完美的操作性、开放性、优效性和灵活性形成了自然实验课的基本框架，较好地揭示课堂教学的一般程序、课堂教学诸因素的内在联系和课堂教学的普遍规律。现就模式谈一下我在教学中的实践与几点体会。 一、教学模式的四个环节在实践中的具体运用 （一）提出问题阶段 提出问题阶段是当研究一个问题时，为了激发学生的求知欲望，引导学生探索并调动他们积极性的阶段。教师可结合要研究的问题，用生动形象的语言恰如其分地提问，让学生在观察和思维中发现问题。 例如，《物体的热胀冷缩》一课，先进行演示实验，在铁架台上放一平底烧瓶，瓶中装满水，用酒精灯加热，水还没烧开，瓶中的水就往外溢。教师接着问大家，你们看了这个现象有什么想法？学生一下子提出许多问题：“为什么水加热后往上溢呢？”
“水难道会变多吗？” 教学时，为了激发学生探求知识的欲望，应千方百计创造性地运用各种方法，如：做游戏、讲故事、变魔术、猜谜语、出示挂图、运用幻灯等。引起学生要研究问题的兴趣，提出自己的想法。 (二)作出假设阶段 学生提出了问题，但在还没有学习有关的知识时，教师引导学生对自己的问题作出假设的回答。教师再从学生假设中引导学生逐渐进入要研究的问题中去。 例如，《水蒸气的凝结》，教师将还在冒白气的温水杯加盖，过一会儿再揭开盖，请同学们看盖上的水珠，水蒸气碰到什么样的物体在上面结成水珠呢？引导学生作出假设，发表不同意见。有的同学说：“水蒸气遇到热的物体结成水珠。”有的说：“水蒸气遇到冷的物体结成水珠。”教师接着说：“那么我们就一起研究一下，水蒸气在什么条件下能变成水呢？”这样就逐渐地把学生引入要研究的课题。 在这个阶段中，学生根据已有知识的经验，通过演绎、归纳、推理而提出的假设，不少带有猜测的性质。此时教师要引导学生积极作出假设，不应压抑学生的思维，不管是对是错，都不要忙于作出评价。 （三）设计实验阶段
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”
word基本操作实验报告 一、实验目的与要求 1．掌握word的基本操作； 2．掌握字符格式、段落格式和页面格式等排版技术； 3．掌握图文混排、表格处理和邮件合并技术； 4．熟悉个人名片或毕业论文的设计与制作； 5．学会自己提出问题，并得出解决问题的方法。 二、实验内容与方法 1．word的基本操作，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 2．word的字符格式，段落格式和页面格式等排版技术，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 3．word的图文混排、表格处理和邮件合并技术，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 4. 通过word进行个人名片或毕业论文的设计与制作，通过上机摸索，并查阅书籍网络了解。 三、实验步骤与过程 1.word的基本操作：①启动word软件 (1) 启动“开始”菜单中的microsoft word程序 (2) 双击资源管理器或“我的电脑”中的c:\program files\microsoft office\office11\winword.exe程序 (3) 双击word 文档文件（*.doc） (4) 双击桌面上的word图标 (5)开始-运行-输入“winword”②认识word2003窗口（1）标题栏位于屏幕最顶端的是标题栏，由控制菜单图标、文件名、最小化按钮、最大化（还原）按钮、关闭按钮组成。（2）菜单栏 菜单栏位于标题栏下面。使用菜单栏可以执行word的许多命令。菜单栏共有九个菜单：文件、编辑、视图、插入、格式、工具、表格、窗口、帮助。当鼠标指针移到菜单标题上时，菜单标题就会凸起，单击后弹出下拉菜单。在下拉菜单中移动鼠标指针时，被选中的菜单项就会高亮显示，再单击，就会执行该菜单所代表的命令。如“文件”—“打开”，就会弹出“打开”文件对话框。（3）工具栏 标题栏下面的是工具栏，使用它们可以很方便地进行工作。通常情况下，word会显示【常用】和【格式】两个工具栏。 “常用”工具栏：新建、打开、复制、粘贴、打印、撤消、恢复等“格式”工具栏：字体、字号、下划线、边框、对齐方式等 如果想了解工具栏上按钮的简单功能，只需将鼠标指针移到该按钮上，过一会儿旁边会出现一个小框，显示出按钮的名称或功能。 word窗口中可以有许多工具栏，可以根据需要在“视图”—“工具栏”中增加或减少工具栏。每一个工 具栏都可以用鼠标拖动到屏幕的任意位置，所以又称为浮动工具栏。工具栏内图标按钮体现了“菜单栏”中的一些主要功能。我们可以利用这些按钮进行相应操作。如我要打开一个文件，除了可以使用菜单栏外，还可以使用工具栏上的按钮。 （4）编辑窗口 再往下的空白区域就是word的编辑窗口，输入的文字就显示在这里。文档中闪烁的竖线称为光标，代表文字的当前输入位置。（5）标尺 在编辑窗口的上面和左面有一个标尺，分别为水平标尺和垂直标尺，用来查看正文的高度和宽度，以及图片、文本框、表格的宽度，还可以用来排版正文。（ 6）滚动条在编辑窗口的右面和下面有滚动条，分别为垂直滚动条和水平滚动条，用来滚动文档，显示在屏幕中看不到的内容。可以单击滚动条中的按钮或者拖动滚动框来浏览文档。（7）显示方式按钮
基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程及其应用 学习目标 1．简述基因工程的基本工具 2．简述基因工程的基本操作步骤 3．说出基因突变和基因重组的意义 基础知识 一、基因工程的原理 1. 基因工程的概念： 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，地改造生物的。 基因工程是在上进行的水平的设计施工，需要有专门的工具。 2.基因工程的工具 （1）基因的“剪刀”：__________（简称__________），作用： （2）基因的“针线”：__________，作用： （3）基因的：作用：，目前常用的运载体有________、________和______________等。 3. 基因工程操作的一般步骤为：__________________目的基因与___________结合将目的基因导入________________目的基因的________和________。 二、基因工程的应用 1、基因工程在作物育种方面的事例有：、、超级绵羊等； 抗虫基因作物的优点，不仅减少了__________，大大降低了生产成本，而且还减少了__________。 2、基因工程生产药品有__________、__________、__________等。 3、目前关于转基因生物和转基因产品的安全性，有两种观点，一种观点是转因生物和转基因食品不安全，____________________；另一种观点，应该大范围推广。
1.看课本P103图6-6，由图中过程怎么操作？用到什么工具？ ①从人的细胞中分离出DNA ； ②用限制酶切取胰岛素基因片断 ③分离大肠杆菌中的质粒并用同种限制酶切断 ④用DNA 连接酶将胰岛素基因与质粒DNA 重组 ⑤将重组质粒导入大肠杆菌进行转化 ⑥培养大肠杆菌，复制大量胰岛素基因并表达分泌出胰岛素； 过程属于基因工程的第一步：； 过程属于基因工程的第二步：； 过程属于基因工程的第三步：； 过程属于基因工程的第四步：； 2.此过程的目的基因是_____________，供体是，受体是_________； 3.细菌和人是差异非常大的两种生物，为什么通过基因重组后，细菌能够合成人的胰岛素呢？ 二、请模仿转基因大肠杆菌生产人胰岛素的过程，写出培育转基因抗虫棉的过程。 4.请写出过程 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
科技实验报告 一、定义与作用 实验报告，就是在某项科研活动或专业学习中，实验者把实验的目的、方法。步骤、结果等，用简洁的语言写成书面报告。 实验报告必须在科学实验的基础上进行。成功的或失败的实验结果的记载，有利于不断积累研究资料，总结研究成果，提高实验者的观察能力。分析问题和解决问题的能力，培养理论联系实际的学风和实事求是的科学态度。 二、写作要求 实验报告的种类繁多，其格式大同小异，比较固定。实验报告，一般根据实验的先后顺序来写，主要内容有： 1．实验名称名称，要用最简练的语言反映实验的内容。如验证某定律，可写成“验证×××”；如测量的实验报告，可写成 “×××的测定。” 2．实验目的实验目的要明确，要抓住重点，可以从理论和实践两个方面考虑。在理论上，验证定理定律，并使实验者获得深刻和系统的理解，在实践上，掌握使用仪器或器材的技能技巧。 3．实验用的仪器和材料如玻璃器皿。金属用具、溶液、颜料、粉剂、燃料等。 4．实验的步骤和方法这是实验报告极其重要的内容。这部分要写明依据何种原理。定律或操作方法进行实验，要写明经过哪儿个
步骤。还应该画出实验装置的结构示意图，再配以相应的文字说明，这样既可以节省许多文字说明，又能使实验报告简明扼要。清楚明白。 5．数据记录和计算指从实验中测到的数据以及计算结果。 6．结果即根据实验过程中所见到的现象和测得的数据，作出结论。 7．备注或说明可写上实验成功或失败的原因，实验后的心得体会、建议等。 有的实验报告采用事先设计好的表格，使用时只要逐项填写即可。 三、撰写时应注意事项 写实验报告是一件非常严肃。认真的工作，要讲究科学性、准确性。求实性。在撰写过程中，常见错误有以下几种情况：1．观察不细致，没有及时、准确、如实记录。 在实验时，由于观察不细致，不认真，没有及时记录，结果不能准确地写出所发生的各种现象，不能恰如其分。实事求是地分析各种现象发生的原因。故在记录中，一定要看到什么，就记录什么，不能弄虚作假。为了印证一些实验现象而修改数据，假造实验现象等做法，都是不允许的。 2．说明不准确，或层次不清晰。 比如，在化学实验中，出现了沉淀物，但没有准确他说明是“晶体沉淀”，还是“无定形沉淀”。说明步骤，有的说明没有按照操作顺序分条列出，结果出现层次不清晰。凌乱等问题。
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来 B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的 4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养
基上生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶 的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有 D.转基因牛的肌肉细胞中也有人白蛋白基因，但不发生转录、翻译，不能合成人白蛋白 6.下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
基因工程实验报告
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基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程： 片段胶 小麦幼苗小麦总RNA RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1 表达载体 表达菌株 目的蛋白 目的蛋白 Western
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
6-2 基因工程及其应用 【学习目标】 1、简述基因工程的基本原理。 2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。 3、关注转基因生物和转基因食品的安全性。 【新知预习】 一基因工程的原理 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种里，地改造生物的。 基因工程是在上进行的水平的设计施工，需要有专门的工具。基因工程最基本的工具有：“”、“”、“”。 二基因工程的工具 1、基因的“剪刀” (1)它指的是限制性内切酶，简称为，正是伴随它的发现，以人类定向改造生物遗传性状为目的的才应运而生。 (2) 限制性内切酶主要存在于中，限制性内切酶是不是就是一种？ (3) 限制性内切酶的特点是a: ；b： (4)不同的限制性内切酶切割DNA的切点相同吗？ 2、基因的“针线” 把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端黏合起来，问： (1)两者的黏性末端能黏合起来遵循的原则是。 (2)DNA连接酶的作用是。 3、基因的运载体 (1)要将一个外源基因，送入受体细胞内，还需要有运输工具，这就是 (2)通常使用的运载体有、和等。 (3)质粒它存在于及等生物中，是细胞染色体(有的细胞中没有染色体)外能的很小的环状分子。 三基因工程的操作步骤
1、提取 2、与结合 将与结合的过程，实际上就是不同来源的DNA 的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的切割质粒，使质粒出现一个切口，露出黏性末端。然后用限制酶切断，使其产生相同的。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，质粒的黏性末端与目的基因的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，再加入适量的，这样就形成了一个重组DNA分子。 3、将导入 4、目的基因的表达和检测 基因的表达是指通过和合成的过程。 四基因工程的应用（见书） 1.获得高产、稳产和具有优良品质的农作物和具有抗逆性的作物新品种。 2.高效率的生产出高质量、低成本的药品，如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等 3.利用转基因细菌降解有毒有害的化合物，保护环境。 五转基因生物和转基因食品的安全性 【知识细目表】 1.概念 2.原理基因重组 3.基因工程的基本工具 （1）基因的“剪刀”（限制性内切酶） 限制性内切酶能够对DNA分子进行切割，它具有专一性和特异性。即一种内切酶只对DNA 分子内特定的碱基序列中的特定位点发生作用，把它切开。 （2）基因的“针线”（DNA连接酶） 能够将限制酶切开的黏性末端连接起来，从而使两个DNA片段连接起来。 注：限制酶与连接酶作用的位点都是磷酸二酯键 （3）.基因的运载体作用：将外源基因送入受体细胞 种类：质粒、噬菌体和动物病毒。其中质粒是基因工程中最常用的运载体，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。 特点：是细胞染色体外能自主复制的很小的环状DNA 分子，存在于许多细菌及酵母菌等生物中。
2. 第一个作为重组DNA载体的质粒是() (a) pBR322 (b)ColEI (c)pSCI01 (d)pUCI8 3. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有()不太恰当 (a) 由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b) 这一系统中的核酸酶都是U类限制性内切核酸酶 (c) 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (d) 不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 4. H型限制性内切核酸酶：() (a) 有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b) 仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c) 限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e) 仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 5?下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?() (a) 限制酶是外切酶而不是内切酶 (b) 限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割 (c) 同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 (d) 一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端 (e) 一些限制酶在识别位点内相同的位臵切割双链DNA，产生平末端
6 .第一个被分离的U类酶是：() (a) EcoK (b)Hind 川(c)Hind U(d)EcoB 7?在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?() (a) 反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度 8. 在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子?() (a) EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA 9. 在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?() (a) S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31核酸酶 10 .限制性内切核酸酶可以特异性地识别：() (a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列 (c)特定的三联密码(d)以上都正确 11.下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是()。 (a) Sau3A I (b)E . coRI (c)hind III (d)Sau 3A1 12 .限制性内切核酸酶的星号活性是指：() (a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。(b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同 13 .下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?() (a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂 (c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低 14. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有()不太恰当
基因工程综合实验报告 A型产气荚膜梭菌α毒素基因克隆及表达 班级生物工程081班 姓名盖雪 学号08771029 指导教师高凤山 实验时间2011.10.10-10.14 成绩
一、实验原理 二、主要试剂 DNA Ligation Kit Ver.2.0; Eco RI、Bam HI限制性内切酶；含15%甘油的 0.1mol/L CaCl2，20-30mL。无菌;0.1mol/L CaCl2 , 20-30mL ；50%甘油（无菌，保存菌种用，50mL）4×25mL LB液体培养基(现配现用)，卡那霉素（Kan）100mg/mL配2mL（过滤），X-gal 二甲基甲酰胺配成20mg/mL 配2mL; IPTG 24mg/mL, 配2mL（需过滤）;蛋白Marker; 0.5M EDTA,pH8.0; 溴化乙锭溶液(EB) （贮存浓度：10mg/mL，使用浓度0.5μg／mL）
三、仪器设备 紫外成像系统，高速冷冻离心机，恒温震荡培养箱，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，微波炉，电炉子，试管架，tube 架，试管，瓶塞，锥形瓶，胶板，电泳槽（包括琼脂糖凝胶和SDS-PAGE），电泳仪，培养皿，移液枪，枪头（各种规格），玻璃涂棒，记号笔，标签纸，卫生纸，水漂（水浴用），试纸，称量纸，一次性手套，酒精灯，火柴，药勺，搅拌子，量筒，烧杯，镊子，tip, tube(1.5mL, 2mL) 五、实验步骤 (一)准备工作 LB培养基配制；LB固体培养基配置；接菌（制备感受态用） 1）LB固体配制 配制固体培养基100mL 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4，121℃灭菌20min。 灭菌结束后，待温度降至80℃以下时，方能取出，在超净台上，当培养基凉至50-60℃时，迅速加入Kan 30μL（若氨苄，加100ul），摇匀，倒板(4个)。凝固后放入4℃冰箱。 2）LB液体配制 配制100mL液体LB培养基 加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4。 然后分装，每管5mL，每人分装2管，一共12管；另外分装30mL LB与三角瓶中，余下的LB在原三角瓶中与试管等一起高压，121℃，20min。高压后，将剩余三角瓶中的LB分装至1.5mL tube中，每管800μL LB (共10个)。在时间允许的情况下，将高压后的LB试管加入卡那，每管1.5μL。 总结：需要灭菌的东西-液体培养基（试管、30mL三角瓶及剩余液体LB的三角瓶）-固体培养基、离心管（至少30个）、各种规格的枪头。 3）接菌 下午，接种BL21感受态于1管5mL培养基中，37℃震荡培养。 （二）感受态细胞制备、转化、重组菌接种 1）感受态细胞的制备 1.从大肠杆菌DE3平板上挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基的试管
基因工程及其应用文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
第2节基因工程及其应用（第1课时）知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA 重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究
传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的 水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是 指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？ 七、基因重组与基因工程比较
课型：新授主备：同备审批: 7/13/2013 第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程 【学习目标】1.简述基因工程的基本原理 2.举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 3.关注转基因生物和转基因食品的安全性 【学习重点】1. 基因工程的基本原理 【学习难点】基因工程的基本原理 【学习过程】 一、基因工程的基本原理 （一）、基因工程的概念 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的。 【思考】 为什么不同生物的基因可以相互转移？转基因生物是否产生了新基因和新型蛋白质？ （二）、基因工程的工具 基因的“剪刀”—— 一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在的切点上切割DNA分子。【思考】 要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 【练一练】试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端 基因的“针线”—— “缝合”__________和_________交替连接而构成的DNA骨架上的缺口。 【思考】DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部位？
基因的运载体目前常用的运载体有________、________和______________等。 质粒存在于中,是拟核或细胞核外能够________的______________分子。 （三）、基因工程的操作步骤 目的基因、目的基因与结合、将目的基因、目的基因的和 【思考】 目的基因和质粒为什么要用同一种限制酶切割？限制酶和DNA连接酶作用的位点相同吗？用DNA连接酶讲目的基因与运载体结合时，有其他不同的结合情况吗（两两结合时）？ 二、基因工程的应用 1、基因工程与作物育种 人们培育出的转基因作物和转基因动物主要有 ___________________________ ___ _____ ____ ____________________________________ __ 2、基因工程与药物研制 转基因药物有：________、________、________、________、________、________、________、________、________。 三、转基因生物和转基因食品的安全性 两种观点：__________________________________和_______________________________ ［课堂小结］ 【自我检测】 1．不属于基因工程方法生产的药物是（） A.干扰素 B.白细胞介素 C.青霉素 D.乙肝疫苗 2．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是（） ①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA分子 ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居”