首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO 溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.
让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。一般说不能超过20代，最好在10代以内。
诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。
诱导剂的配制
IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存
用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液
终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。
DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存
用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液
终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。可用2年。Insulin：分子量：6000 ,4度保存
原液为诺和灵R：400IU/10ml
终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。4度保存
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化
1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培
液在37℃、5％CO2培养;
2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是
长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）
3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液
再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
诱导操作注意事项：
1、一共需诱导3次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h，若
时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h。
2、诱导操作需注意：以6孔板为例，每孔3ml培液，一个6孔板需18ml培液，
则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul（储存液），DEX7.2ul储存液，胰岛素108ul（储存液）。第一遍诱导时用200ul的移液枪先每孔加200ul配制好的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细胞会飘起来，俗称卷边。每孔加5遍200ul培液，合计1ml，第二、三遍则每孔1000ul加培液，方法同上，操作要慢、轻。
3、第2次诱导时，诱导剂的配制为：18ml培液，加胰岛素108ul（储存液），混
匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第3次诱导诱导仅需换10%高糖DMEM培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培液看起来就黄了。
4、第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出
来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次1ml的培液换，一般换液2天后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。
细胞是否诱导成功细胞代数很重要，我们这边一般是13代以后的细胞就很难诱导出来了，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。
3T3-L1细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI诱导，DMEM高糖+胎牛血清），第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin诱导，DMEM 高糖+胎牛血清），细胞中就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定浓度的KOH溶解的，insulin是在一定浓度的HCL中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为3T3-L1细胞，但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入分化诱导的时候，一定不能用胎牛血清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小心被污染！祝各位实验顺利！共同学习！
因为3T3-L1加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管家的时候很难控制流速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的话，还是能用，没有什么大的影响，如果范围比较大的话最好重新诱导。
你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX大家一般都是用0.5mmol/L，胰岛素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性的吗？因为一般的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。
镜下观察细胞接触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起了，如果你的细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自己需要自己摸索一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1长得非常快，如果长满以后不换液，会有大批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在10*4数量级，这样让细胞长3天后铺满，再换液，再让细胞长2-3天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest状态。2，IBMX的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH溶液都可，针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，
3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的insulin，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化。
我用的方法是美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细),现发给各位战友共享,呵呵.
如果不能成功分化的话,只能质疑细胞的问题了.
3T3-L1 Differentiation Protocol
MATERIALS
Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)
Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)
Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEM
Isobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)
Dexamethasone (Sigma D-4902)
Insulin (Bovine; Sigma I-5500)
MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)
SOLUTIONS
10% Calf Serum/DMEM
60mL Calf Serum
6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate
6mL 100x P/S/G
500mL DMEM
10% FBS/DMEM
60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)
6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate
6mL 100x P/S/G
500mL DMEM
IBMX Solution (make fresh)
a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.
b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.
Insulin Stock Solution
167 uM (1mg/mL) in 0.02M HCl
Filter sterilized through 0.22 mm filter
Can store at -20C for long term, 4C short term.
Dexamethasone Stock Solutions
Freezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)
Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBS
Filter sterilize and store at 4C.
MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)
To required volume of 10% FBS/DMEM add:
1:100 IBMX
1:1000 Insulin
1:1000 Dexamethasone working stock
Insulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)
To required volume of 10% FBS/DMEM add:
1:1000 Insulin
METHOD
Preadipocyte maintenance and passage:
We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning
(Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.
Adipocyte Differentiation Protocol:
1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM
2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice
a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.
3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.
4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10% FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.
C3H1O T1 2细胞向神经元诱导分化的方法研究 邓均 艾国平 王军平 徐辉 邹仲敏 闫国和 董世武 郝磊 冉新泽 粟永萍 【摘 要】 目的 探讨体外诱导间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)系C3H1O T1 2细胞分化为神经元细胞的方法。 方法 取3月龄SD大鼠1只,体重200g,进行神经元细胞的原代培养及诱导上清液的收集,用细胞免疫组织化学方法进行鉴定。将C3H1O T1 2细胞进行培养,分别用Β巯基乙醇(A组)和神经元原代细胞上清液(B组)作为诱导剂,对C3H1O T1 2细胞进行诱导分化;对照组(C组)不加诱导剂进行培养。采用细胞免疫组织化学方法对分化的细胞进行鉴定。 结果 细胞免疫化学检测原代培养细胞为神经元,表达特异标志物:神经丝蛋白(neu rofilam en t p ro tein, N F)和神经元特异性烯醇化酶(neu ron specific eno lase,N SE)。A组C3H1O T1 2细胞经Β巯基乙醇诱导2h即表达N F和N SE,5h表达强度增强。B组C3H1O T1 2细胞经原代神经元培养上清液诱导,1d有N F和N SE表达,但表达强度比A 组弱。各组N SE表达阳性率和强度均高于N F。 结论 化学分子和微环境体液因素均可诱导M SC s向神经元细胞分化;为M SC s通过神经分化参与脑创伤的修复提供了理论依据。 【关键词】 间充质干细胞 分化 神经元细胞 诱导 中图分类号:Q813111 R329.2 文献标识码:A EXPER I M ENTAL INVESTIGATI ON ON CHARACTER ISTI CSOF C3H1OT1 2CELL IND UCED D IFFERENTI ATI ON INT O NEUR ON-L IKE CELL S D EN G J un,A I Guop ing,W A N G J unp ing,et a l.Institu te of Co m bined Inju ry,Colleg e of P reven tive M ed icine,T h ird M ilita ry M ed ica l U n iversity,Chong qing,400038,P.R.Ch ina.E2m a il:dj t mm u@to m. co m Corresp ond ing au thor:SU Y ongp ing,E2m a il:suyp2003@y ahoo.co https://www.doczj.com/doc/9b2156998.html, 【Abstract】 Objective To exp lo re the m ethod that can induce the m esenchym al stem cells(M SC s)to differen tiate in to the neu ron2like cells in v itro.M ethods T he neu ron2like cells w ere iso lated from an SD rat(age, 3mon th s;w eigh t,200g).T hey underw en t a p ri m ary cu ltu re;the induced liqu id supernatan t w as co llected,and w as iden tified by the cell i m m unoh istochem istry.T he C3H1O T1 2cells w ere cu ltu red,as an M SC s model,and they w ere induced in to differen tiati on byΒ2m ercap toethano l(Group A)and by the liqu id supernatan t of the neu ron2like p ri m ary cells(Group B),respectively.T he cells w ere cu ltu red w ithou t any inducti on w ere u sed as a con tro l(Group C). I mm unoh istochem istry w as u sed to iden tify the type of the cells.Results T he resu lt of the i m m unochem istry show ed that the cells undergo ing the p ri m ary cu ltu re exp ressed the neu rofilam en t p ro tein(N F)and the neu ron specific eno lase (N SE),and they w ere neu ron2like cells.Β2m ercap toethano l cou ld induce the C3H1O T1 2cells to exp ress N F and N SE at2h,and the exp ressi on in ten sity increased at5h.T he liqu id supernatan t of the p ri m arily2cu ltu red neu ron2like cells cou ld induce the C3H1O T1 2cells to exp ress N F and N SE at1d,bu t the exp ressi on in ten sity induced by the liqu id supernatan t w as w eaker than that induced byΒ2m ercap toethano l.T he po sitivity rate and the in ten sity exp ressi on of N SE w ere h igher than tho se of N F.Conclusion M SC s can differen tiate in to the neu ron2like cells byΒ2m ercap toethano l and the m icroenvironm en t humo ral facto r,w h ich can pave the w ay fo r a fu rther study of the differen tiati on of M SC s and the effect of the differen tiati on on the b rain traum a repair. 【Key words】 M esenchym al stem cells D ifferen tiati on N eu ron2like cells Induce Founda tion ite m:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(2005CB522605) 近年来,干细胞由于其多向分化潜能成为研究热点,也成为细胞工程、再生医学研究中的主要选择细 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(2005CB522605) 作者单位:第三军医大学军事预防医学院复合伤研究所(重庆, 400038) 通讯作者:粟永萍,教授,博士导师,研究方向:干细胞参与创伤修复的机制研究,E2m ail:suyp2003@https://www.doczj.com/doc/9b2156998.html, 胞[1,2]。神经干细胞的发现为中枢神经细胞变性疾病和中枢神经系统损伤的移植治疗提供了有效的移植物,但由于目前很难获得足够的神经干细胞,因此寻找一种新的移植细胞来源,对神经科学领域基础与应用研究的发展至关重要[3,4]。研究证实,间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)具有可塑性,可跨胚层分化,诱导分化为外胚层的神经元细胞[5,6]。而且M SC s易获取,易生长,有较强的增殖能力,可成为神
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155 www. CRTER .org 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。 通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.doczj.com/doc/9b2156998.html, Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定 肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的 基金资助： 国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要 背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项 一、技术简介 干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 二、实验流程 1. 干细胞的分离、原代和传代培养。 2. 定向诱导干细胞分化。 3. 成长曲线测定。 4. 诱导分化后细胞鉴定。 5. 结果统计分析。
万方数据
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华西口腔医学杂志第篮卷第４期２００７年８月 ———— 一一里型！１１些地婴坐堂皇！型些！臣！！！堑盟型些ｇ：！婴！：塑！： 物经琼脂糖凝胶电泳分折，可见一条约３８０ｂｐ大小 的扩增产物条带，与ＧＦＡＰ预期片段大小基本一致。 内参对照ＧＡＰＤＨ也可见９００ｂｐ的清晰条带（图４）。 ２．２免疫细胞化学染色１＋Ｍａ妇２：Ｇ８Ａ９和诱导细胞，３：ｃＦＡ’耳口束诱导细胞４： 诱导细胞抗黑∑世氍ｅ鲞掣肌岬：、”冒：Ｉ鬻翟：詈：黧鬻：…。，。。呈 ３），对照组这两种抗体染色均呈阴性。一 阳性表选 囤２坤经诱导４ｄ盾牙髓干细胞抗ＧＦＡＰ的阳性表远ＡＢｃ×２００ ，培２ｈ椰ｖｅ８叩哪ｌ…ｍ曲ｔｌｂｏｄ）∞ｃＦＡＰ缸ｄｅⅡｋｌＦＬＩｌｐｓｔ…ｅⅡｓⅡｅａｔｅｄ诵ｔｈＩ）叫口ｌｊｎｄｕｃｂｖｅｒｒ?刚ｉｕｍＲⅡ４ｄＨＹｓ ＡＢＣＨ２００ 幽３砷经诱导４ｄ后，牙髓Ｔ细胞抗Ｎ虬的｜５Ｈ性表述ＡＢｃ×２００ Ｆ咱３Ｐｏｇｉｄ…砷…ｍ们【ｈａ埘ｂｏｄｙｔ０ＮｓＥ０ｆｄｅｎ词ｐＵ如“Ｌｅ…ｄｋｈ即Ｌ出ｗＪⅡＩＪ?ｅｍ“１ｎｄｌｍｄ…ｌ。出Ｉｌｒｔ＿ｈ４ｄａｖｓ ＡＢＣ×Ⅻ ２＿３１ｗ—Ｐｃｌ｛检测 咀未诱导细胞为对照，诱导细胞的ＲＴ—ＰｃＲ产３讨论 成体干细胞的横向分化潜能或称为可塑性是指其不仅能分化为来源组织的各种细胞类型，而且具有分化为其他胚层来源的成熟细胞的潜能Ｈ。自从１９９７年有关成体干细胞可塑性的系列研究＝ｌ挂道后，可塑性研究引起生命科学领域的极大关注，对干细胞的研究产生重要影响。而这其中研究最多、可塑性最强的是骨髓基质干细胞（ｂｏｎｃｍｃｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ－ＢＭｓｃｓ），可以诱导分化为骨髂肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、肺上皮细胞、肠上皮细胞、皮肤上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等，其中最引八注目的是其神经方向的分化潜能。 Ｅｄｉｔｉｓ等”研究表明小胶质细胞、星形胶质细胞是来源于骨髓的一种前体细胞。而Ｂｒａｚｅｌｔｏｎ等‘啦过绿色荧光蛋白基因转染示踪研究发现，在脑内微环境下，ＢＭｓｃｓ能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞，除表达相应神经细胞表型特点外，尚有神经元样功能。而在体外，削ＤＭｓＯ、ＢＨＡ、Ｂ—ＭＥ等作为主要诱导剂，可诱导成年大鼠和人的ＢＭＳＣｓ分化为神经元和神经胶质细胞，诱导后细胞在形态上出现类似于神经元样突起，表达ＮｓＥ、ｎｅｓｔｉｎ等神经细胞特异性标志㈣。此外，表皮生长｜盘｜子或脑源性神经生长因子与维甲酸或胎鼠的中脑、纹状体的悬液也可体外诱导ＢＭｓｃｓ分化为幼稚的神经兀和神经胶 质细胞口。可见体外不同培养条件下都可诱导ＢＭｓｃｓ 万方数据
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法 碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。1 Gomori钙钴法 【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 （1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 （3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 （4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 （5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 （六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】 （1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 （2）蒸馏水冲洗。 （3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 （4）流水冲洗，晾干。 （5）甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。 【步骤】 （1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。 （2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。 （3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。 【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。 1 茜素红法 【步骤】
癌的分化诱导治疗和分化诱导剂 作者：闫晓光(A1435)综述周训银1 吴军正2审校一般认为，癌细胞的分化程度较正常低，主要有以下几种观点：⑴癌细胞来源于未能完全分化的正常干细胞的异常分化；⑵癌细胞是已完全分化的正常细胞的反分化形成的；⑶癌变是细胞发育的阻抑，即细胞在早期分化阶段被致癌物转化为低分化、高增殖的癌细胞；而在细胞接近于分化完成时，被致癌物转化为高度分化的、低增殖的癌细胞。不管癌细胞是来自成熟细胞的反分化，或来自未成熟细胞的异常分化，还是阻抑正常细胞的分化，都可以看作是一种细胞分化的疾病，目前已经有许多把恶性细胞再分化成高分化不(或低)增殖正常细胞的例子：⑴Mckinell等人将蛙肾肿瘤细胞核注入受精的去核卵，结果发现肿瘤细胞核改变了基因的表达，经过正常分化，成长为正常的蝌蚪，及至成年蛙，都没有一点恶性肿瘤的迹象。⑵Mintz由含特异标志的小黑鼠分离畸胎瘤细胞，直接注入另一种含不同基因标志的小白鼠胚胎，然后将胚胎移植到假孕的寄养母鼠的子宫内，结果胚胎长成了正常鼠。从上面的实验中可以得出下面的启示：⑴至少有部分癌是由于基因的表达及功能改变所致，而基因的结构并未改变。如果癌都是由于基因的永久性突变，那么畸胎瘤就不可能再分化为正常细胞。⑵如果癌细胞可以向正常逆转，就有可能设计出一种治疗癌瘤的药物，促使癌细胞再分化成正常细胞。很多生成因子或化学物质在体内或体外可促进癌细胞分化而降低肿瘤恶性程度的事实，为发展抗癌治疗开辟了一条新途径──分化诱导治疗[1]。 1 分化诱导疗法特点 肿瘤细胞分化诱导疗法的基本特点为不杀伤肿瘤细胞，而诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞，即在一些化学制剂的作用下，有的肿瘤细胞出现类似正常细胞的表型，有的恢复了正常细胞的某些功能，这些制剂被称为分化诱导剂，运用分化诱导剂促进体内肿瘤细胞分化来治疗癌症，被称为分化诱导疗法。目前国内外文献资料对癌细胞分化的叫法有所不同，如：逆转、表型逆转、逆向转化、正常化、脱癌、去恶性及去恶化等，总之，均表达出肿瘤细胞向正常细胞方向发展。分化诱导疗法的提出，打破了50年代曾流行的“一旦成了癌细胞，便永远是癌细胞”的观点，癌细胞的分化诱导疗法，作为肿瘤治疗的一条新途径，近年
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
牙髓干细胞向神经细胞方向的诱导分化实验 贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【期刊名称】《华西口腔医学杂志》 【年(卷),期】2007(025)004 【摘要】目的探讨克隆化培养分离的人牙髓干细胞是否具有向神经细胞方向分化的潜能,并确定其诱导条件.方法克隆化培养的人牙髓干细胞预诱导24 h,然后换含一定浓度二甲基亚砜(DMSO)、丁羟基茴香醚(BHA)、forskolin、β-巯基乙醇(β-ME)和氢化可的松(hydrocortisone)的联合诱导液连续诱导4 d,对诱导细胞进行形态学观察,神经胶质酸性蛋白(GFAP)、非特异性酯酶(NSE)免疫组化染色和GFAP mRNA RT-PCR检测.同时,以未诱导细胞为对照.结果诱导12 h 时细胞形态开始改变,24 h时分化为较为典型的神经细胞样细胞,继续诱导分化细胞数量增多;诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE和GFAP蛋白;RT-PCR 检测诱导细胞表达GFAP mRNA,而未诱导细胞均无上述改变和表达.结论人牙髓干细胞在一定的诱导条件下可横向分化为神经元样细胞. 【总页数】4页(331-334) 【关键词】牙髓干细胞;诱导;分化 【作者】贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【作者单位】第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医院,牙体牙髓科,陕西,西安,710032;兰州军区临潼疗养院三区,门诊部,陕西,西安,710600;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分 化的潜能等特点，已经成为干细胞研究领域的热点，是最好的组织工程种子细胞之一，还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。 [Abstract] Bone marrow stromal cells has derived simple，fast growth，the training process remains much to differentiate and other characteristics，has been become the hot spot in the study of stem cells，is one of the best seed cells of tissue engineering.It can also differentiate into neural cells.The article reviewes the progress of induction of bone marrow stromal cells to neural cells and its mechanisms. [Key words] Bone marrow stromal cells；Neural cells；Bone marrow 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）位于骨髓中，是具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞[1]。由于BMSCs具有取材容易、培养简单、增殖能力强、可以传代并且不改变生物学特性以及没有伦理学及免疫排斥等优点而备受瞩目[2-3]，BMSCs为治疗中枢神经系统疾病的一种理想供体细胞[4-6]。本文将BMSCs诱导分化为神经细胞的研究现状作一综述。 1 BMSCs定向分化为神经细胞的研究现状 1.1 体内定向分化 大量研究表明，BMSCs在体内可以分化为神经细胞。有学者将来源于人的BMSCs注入小鼠纹状体内，5～72 d后发现，在脑组织切片上有供体细胞存在，同时无明显炎症反应和排斥反应[7]。Mezey等[8]进行了雄性和雌性小鼠BMSCs 移植实验，将雄性小鼠的BMSCs植入雌性小鼠体内，一段时间后进行检测发现有携带Y染色体的神经细胞出现在雌性小鼠体内，提示雄性小鼠的BMSCs在雌性小鼠的体内分化成神经细胞。Guillermo等[9]将BrdU标记的大鼠BMSCs注入胎龄为15 d的大鼠胚胎的侧脑室内，在胎龄18、20 d时检测发现移植的细胞形成细胞团，2个月时检测仍有少量的移植细胞存活，表明BMSCs可以在脑的微环境中分化为神经细胞并存活较长时间。Chen等[10]将BMSCs应用于脑外伤动物，发现其能分化为神经细胞，并对神经功能的恢复有明显的促进作用。上述实验表明，BMSCs在体内可以迁移、存活、在相应部位的微环境影响下可分化为神经细胞，并能发挥一定的神经修复功能。 1.2 体外定向分化 能在体外分化为有较完整功能的神经细胞，是BMSCs作为神经细胞移植的来源细胞应用于临床的基础，很多学者在如何诱导BMSCs分化为神经细胞方面做了大量有益的探索，取得了较大进展，截止目前，诱导方法大致可归纳为以下
碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 以ALP为目标物的检测方法： 1 Gomori钙钴法 【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 (1)将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 (2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 (3)入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 (4)2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 (5)1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2) 50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 (六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合) 【步骤】 (1)细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 (2)蒸馏水冲洗。 (3)将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 (4)流水冲洗，晾干。 (5)甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/9b2156998.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然
《细胞分化和细胞全能性》课例分析 一教学背景 克隆生物和干细胞治疗疾病，这些都是当今生物科学的热点，学生在媒体中经常看到相关的报道，但干细胞为什么能治疗疾病？克隆生物怎样制造出来的？等等，这些都是学生感到困惑的问题。依据新的课程理念，生物教学应注重与现实生活相联系，确定本节课的教学目标是“说明细胞的分化”和“举例说明细胞的全能性”，这都是“理解水平”的要求；为增强学生理论联系实际，关注生命科学的热点问题，培养学生资料搜集和分析能力，以及表达与交流的能力，也确定开展“搜集有关克隆技术的相关资料”为教学目标。 二教材分析 多细胞生物体的生长发育与细胞的分化密切相关，细胞的分化是个体发育中重要的生理过程和生理现象，细胞分化是一种持久的、稳定的变化。分化的细胞在一定条件下又具有全能性，动物细胞核全能性的具体应用——克隆技术又是当今生命科学的热点。本节内容既是对细胞结构、功能、分裂等知识的拓展和延伸，又为学习遗传、变异打下基础。同时，本节知识与当今许多科技新进展热点问题都有紧密地联系，因此能联系实际了解或解决一些实际问题就显得很重要，也会激发学生了解科学的积极性，也是激发学生社会责任感的良好契机。三学情分析 学生在初中对“细胞分化”的知识有初步的了解，在学完“细胞的增殖”后学习本节，使学生对生物的个体发育有一个系统的理解，对于本节涉及到克隆技术、植物组织培养等知识，学生既无直观印象，也少有相关的信息储备。因此，收集与处理信息的能力、联系实际的能力是学好本节的基础。 四教学思路 细胞分化是多细胞生物体发育的基础和核心，为提高学生的学习兴趣，联系校园网上“青浦青年造血干细胞捐献志愿者”活动的通知，引导学生思考，为什么要捐献骨髓干细胞？只要平时关注媒体报道的学生，大多数能说出“是因为骨髓中有造血干细胞，能治疗白血病。”就此引入细胞分化的学习。 细胞分化的概念，内涵较深刻，也是学生较难理解的，可通过提供充分的感性材料如：图像信息，多媒体课件演示动物个体发育过程，层层设问，帮助学生理解，并且将有丝分裂与细胞分化联系起来，构建合理的知识网络。 细胞的全能性是教学的难点，引导学生从细胞有丝分裂的结果来分析。对植物细胞的全能性，用试验过程介绍，让学生了解植物组织培养的过程。最后让学生交流搜集到的有关克隆技术的知识，并对克隆技术的应用就利弊两方面展开辩论，培养他们交流表达能力以及对生物理论知识的理解、应用能力。 五教学设计方案 教学目标 1.知识和技能 1)理解细胞分化的概念、特点和意义 2)理解细胞全能性的概念 2.过程能力和方法 1)通过介绍胡萝卜根韧皮部组织培养实验，使学生理解植物细胞的全能性。 2)详细介绍“多利”羊的诞生过程，使学生了解细胞生物学实验方法； 3)通过搜集资料，课堂讨论理解克隆技术的两面性。