广东海洋大学 2012 —— 2013 学年第 一 学期 《 生物显微技术与电镜技术 》课程试题 课程号： 11352124 □ 考试 □ A 卷 □ 闭卷 √ 考查 □ B 卷 √ 开卷
简答题（请从以下三个题目中任选两个作答） 1、 相差显微镜的制造成功，是近代显微镜技术中最为重要的成就，请查阅文献详述相差显微镜的工作原理和特点。 2、 目前，在常规生物显微技术的基础上已经发展出了染色体原位杂交技术、组织化学原位杂交技术、组织切片原位PCR 等研究手段，请查阅文献详述其中一种研究手段的原理和基本步骤。 3、 常规电子显微镜技术与免疫学方法结合形成了免疫电子显微术，其中胶体金标记抗体技术最为成熟，得到广泛应用。请查阅文献详述该技术的原理和基本步骤。 1、 答：相差显微镜的工作原理: 镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产
生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。$主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色
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姓名： 学号： 试题共 1
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GDOU-B-11-302
样品。
特点：光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
2、答：组织化学原位杂交技术的原理: 原位杂交技术是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
经特定标记的核苷酸链为探针，可与组织切片、细胞或染色体标本中的待检DNA 片段或mRNA进行杂交，然后显示标记物，从而分析待检核酸的分布和含量。利用此项技术可研究各种基因在染色体上的定位，编码某种蛋白质的mRNA在胞质中的表达。
基本步骤：原位杂交技术方法大致可分为：1.杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；2.杂交；3.杂交后处理；4.显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。
（一）固定
原位杂交组织化学技术在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。
因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，
在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。
（二）玻片和组织切片的处理
1．玻片的处理
玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾-明胶液，多聚赖氨酸液。
2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等。
这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存最和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。
3．减低背景染色
在原位杂交实验程序中，如何减低背景染色是一个重要的问题。ISHH中背景染色的形成是诸多因素造成的。杂交后的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。
预杂交是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。
4．防止RNA酶的污染
由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响
实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。
（三）杂交
在ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH 整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。
杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。为保证杂交所需的湿润环境，可将其放在盛有少量5×SSC或2×SSC溶液的硬塑料盒中进行孵育。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。
（四）杂交后处理
杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。
（五）显示
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。
（六）对照实验和ISHH结果的判断
和其它实验方法一样，必须同时设对照试验以证明其实验结果特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定。