豌豆凝集素基因的克隆与转化烟草的研究
周小全，张兴国＊
（西南大学园艺园林学院蔬菜实验室重庆400716）
摘要：豆科植物凝集素在植物对其相应的根瘤菌识别中起重要作用。设计特异引物扩增出豌豆(Pisum sativum L.)凝集素基因(psl)，并亚克隆到植物表达载体pVCT2020中，经根癌农杆菌EHA105介导,采用叶盘法转化烟草（Nicotiana tobacum L.）。通过PCR分析鉴定Kan 阳性植株。鉴定过程中排除了农杆菌DNA干扰造成PCR假阳性的可能，证明psl基因已经整合到烟草基因组中。该转基因烟草可进一步用于与豌豆根瘤菌的相互作用分析。
关键词：豌豆凝集素；DNA克隆；转化；烟草；PCR；鉴定
Cloning of Pea Lectin Gene and Its Transformation into
Tobacco
Zhou Xiao-Quan ，Zhang Xing-Guo＊
（College of Horticulture and landscape Architecture,Southwest University Chongqing 400716 China）Abstract: The leguminous lectins play an important role in recognition of
host plants to their own rhizobia. The pea lectin gene was amplified by PCR, using specially designed primers. It was then subcloned into plant expression vector Pcvt2020. Tobacco was transformed by co-cultivating leaf disc via Agrobacterium mediation. The regenerated Kanamycin-resistant transformants were analyzed by PCR, eliminating interference from the Agrobacterium DNA. These results indicated the pea lectin gene integrated into the tobacco genomic DNA. This transgenic plants could be used in researches on the interaction with Rhizobia.
Key words:pea；lectin；DNA cloning； transformation；tobacc；PCR；
identification
氮素在农业生产中一直发挥着重要作用，全球每年可供利用的还原态氮中约有60％来自生物固氮，其中豆科植物固氮量占82%[1]。提高生物固氮的量不仅可以降低能源消耗还可以减少环境污染。人们试图通过分子生物学手段打破根瘤菌的宿主专一性障碍，从而扩大共生固氮的范围。Hamblin等1973年首次报道了根瘤菌与凝集素的相互作用，他们提出假说：与菜豆凝集素相结合的根瘤菌到达菜豆的根部，在适当的位点感染植物[2]。Boblool等1974年指出凝集素在宿主植物专一性识别根瘤菌的过程中起着特殊作用，豆科植物凝集素在豆科植物根表面与适当的根瘤菌表面的特异性多糖产生特异性的相互作用[3]。Dazzo等1985年提出：三叶草根瘤菌吸附到三叶草根表面时,以其凝集素作为中介，使三叶草根瘤菌选择性地在三叶草根毛上积累[4]。Díaz 等1989年报道：在豆科植物和根瘤菌共生作用中，宿主植物的凝集素起决定作用[5]；他在1995年用转豌豆凝集素基因（psl）的三叶草接种豌豆根瘤菌，获得结瘤固氮功能[5]。这些研究成果说明，凝集素基因的转化可以扩大根瘤菌的宿主范围。
在非豆科植物转化方面，Edwards GA等1991年将psl转入了马铃薯，但是未进行进一步的结瘤固氮方面的研究。张静娴、荆玉祥等利用CaMV 35S启动子将psl转化到烟草与水稻中，并获得了表达[7、8]。本研究是在克隆了包含启动子和终止序列的psl的基础上，进一步
把该基因导入烟草中，从而为深入研究转psl的非豆科植物与根瘤菌相互作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
豌豆(Pisum sativum L.)种子为重庆地区市售的食用豌豆，烟草(Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38)为本实验室提供。
1.2 菌株与质粒
大肠杆菌(XL1-blue)和农杆菌(EHA105)，植物表达载体pVCT2020(9.53kb)均由本实验室保存和提供；pMD18-T(2.7kb)质粒载体购自Takala公司。
1.3 PCR引物及扩增条件
PCR目的产物基因为包含启动子和终止序列的psl基因，设计上游引物P1序列为GTTAAG TTCTGATGATGTGGTGTG，下游引物P2序列为
CTAA TAGAACCCATTCTTGGCAA，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃2分30秒，循环28次，72℃10分钟。
设计特异引物P3、P4、P5。引物P3/P4的目的产物为一段包含NPT Ⅱ基因，长1.1kb的DNA片断，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分10秒，循环35次，72℃10分钟。引物P3/P5的目的产物为一段包含左边界LB和NPT Ⅱ基因，长约1.4kb的DNA片断，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，循环35次，72℃10分钟。
1.4 植物表达载体的构建
以豌豆幼叶中分离的基因组DNA为摸板，用P1/P2为引物进行扩增。将PCR扩增产物加上“A”尾巴后与pMD18-T载体连接，得到质粒pMD-PsL。用XbaⅠ+Hin d Ⅲ双酶切质粒pMD-PsL，回收小片段（2kb）亚克隆于pVCT2020相应位点，得到质粒pVCT-PsL。用Pma CⅠ单酶切质粒pVCT-PsL，回收大片段(11.1kb)自环化后得到质粒pVCT-PsL＊（如图1）。质粒的提取、酶切、连接及转化参照文献[9]进行。
Xba I Hin dIII Pma CI
LB RB
图1 表达载体pVCT-PsL＊的结构图
Fig. 1 The construction of expression vectors pVCT-PsL＊
1.5 烟草转化及转基因植株的培养
采用液氮冻融法将构建好的植物表达载体pVCT-PsL＊转化到农杆菌EHA105中。PCR检测克隆正确后，采用叶盘转化法，通过农杆菌介导将重组质粒pVCT-PsL＊转化到烟草(Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38)中，并按常规方法进行烟草的再生[10]。
1.6 转基因烟草的PCR鉴定
分别提取转基因烟草和未转基因烟草幼叶的基因组DNA[11]。取1μL作为模板，分别以P1/P2、P3/P4和P3/P5为引物于25μL体系中进行PCR扩增，PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳。
2 结果与讨论
2.1 豌豆凝集素基因的扩增
以豌豆gDNA为模板, P1/P2引物PCR扩增出的目的带大小约为2.0kb,与预期的相符。扩增产物与质粒pMD18-T经连接转化，PCR筛选后得到质粒pMD-PsL。pMD-PsL经XbaⅠ+Hin d Ⅲ双酶切鉴定，得到2.8kb和2.0kb两个片段，与预期结果相符，送于上海生工公司测序。
目的基因测序结果（图2）表明，核苷酸序列全长1948bp，其中外显子为828bp，共编码275个氨基酸。与de Pater等[12]所报道的已知序列相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为99.4%和100%。其中启动子区域核苷酸序列有9处差异；阅读框区域核苷酸
序列有2处差异，但其所编码的氨基酸序列并无不同。
分析差异产生的原因主要在于de Pater等所用的豌豆材料与我们所用的品种不同，但PCR扩增过程中碱基的错误配对及测序过程中的分析错误依然不能排除。
GTTAAGTTCTGATGA TGTGGTGTGATAGCTAGGTCATTGGTA TAAATTTAAGTCAACA TATGTAGTTAAA AATTGA TATACTATTTAAACTGCGAGAGTTTTGTTTCTGAAGGTTAAAAATAAATCCCCTTCAGTTTAAT GACGTGTAAGTTTTCAACTACATA TATTGACTCAGTGACATTTCTTTCATGTCA TGTCACAAGAACTTAA TA TTTTTCCTAGAAATTAACGGAAGAGAACAAATAAGATAAAGAAAGAAGTGAAATTAAAAGATTAAC ATA TAACA TTTTTTAATTAAAGAATTAAAACAAAATA TTAAATTAAACTAAAAATTTGGTGATTAATTGTG CCAAAAAAATATGATGCAGCTAGATCTTTTAGCTTAATTTTTAATTGGATGAGATGATACCTTAA TTTTTA ATTGGATGAGATACAAATTTTATCA TAAAATATATTAGTTATAACAATACGACCACCCTCTCCATAAGTTT TAAATAAATA TCAGCCCTAAAAAACTCTTTAAATAAATTGAAATTTAA TGAGTCA TATTTTTTTAACA TAT AAATTTTAATAGTTATCGTACCGAACAAAAACAGTAATCATGATCTAAACCGAACAACCTCGAAGAAAT ACAAGTTATTACATGCAAAAATA TATAGTAATAAATAAATAAACTAGTTAAACAAAATACAATA TTTTTTG TCTTCAAAGAAGATTCGATGGACGCGTAGAAAATGATGGGACATGGTGTTGTATATGTGTTTCA TTGTA ACGCACTATAAAGACACGTAGAATGAGTCATCACCACTATATAAACAAGTAGCATGCA TGCATGCATGC AATTA TAACCAATA ATG GCTTCTCTTCAAACCCAAATGATCTCGTTCTATGCGATATTTCTATCCATTCTC TTAACAACAATCCTTTTCTTCAAGGTGAACTCAACTGAAACCACTTCCTTCTTGATCACCAAGTTCAGC CCCGACCAACAAAACCTAATCTTCCAAGGAGATGGCTATACCACAAAAGAGAAGCTGACACTGACCA AGGCAGTAAAGAACACTGTTGGCAGAGCCCTCTATTCCTCACCTATCCA TATCTGGGATAGAGAAACA GGCAACGTTGCTAA TTTTGTAACTTCCTTCACTTTTGTCATAAATGCACCCAACAGTTACAACGTTGCC GACGGGTTTACGTTCTTCATCGCACCTGTAGATACTAAGCCGCAGACCGGCGGTGGATATCTCGGAGTT TTCAA TAGCGCAGAGTATGATAAAACCACTCAAACTGTTGCTGTGGAGTTTGACACTTTCTA TAATGCT GCATGGGATCCAAGCAACAGAGATAGACA TATTGGAATCGATGTGAACAGTATCAAATCCGTAAACAC TAAGTCGTGGAAGTTGCAGAATGGTGAAGAGGCTAATGTTGTGATAGCTTTTAATGCTGCTACTAATGT GTTAACTGTTAGTTTAACTTATCCTAATTCACTTGAGGAAGAGAATGTAACTAGTTATACTCTTAGCGAC GTTGTGTCTTTGAAGGATGTTGTTCCTGAGTGGGTAAGGATTGGTTTCTCAGCTACCACAGGAGCAGA ATA TGCAGCACATGAAGTTCTTTCATGGTCTTTTCATTCTGAGTTGAGTGGAACTTCAAGTTCTAAGCA AGCTGCAGATGCA TAG TTTTTTTGCTTTTCATCATCATGCATGTCAAGTCATGTGTGACAGATCCAGTTT CTATAAA TAAACTGCGCATATGCAGTACTTTTGTAATGTTGTTATGTATGTTACTTGA TGCGTTTATTAATC AATGTGTGTGATTAATTGTTTGAGTTATGTGTGTTAAATTAGATAGTTACTCTCTTTTTAAATA TTATTTGG CCAAATGCAAAAACTGTTAAGCATTAGTGATCACTAGTATAGGGCCTAATAGAACCCATTCTTGGCAA MASLQTQMISFYAIFLSILLTTILFFKVNSTETTSFLITKFSPDQQNLIFQGDGYTTKEKLTLTKA VKNTVGRA LYSSPIHIWDRETGNV ANFVTSFTFVINAPNSYNV ADGFTFFIAPVDTKPQTGGGYLGVFNSAEYDKTTQTV A VEFDTFYNAAWDPSNRDRHIGIDVNSIKSVNTKSWKLQNGEEANVVIAFNAATNVLTVSLTYPNSLEEEN VTSYTLSDVVSLKDVVPEWVRIGFSATTGAEYAAHEVLSWSFHSELSGTSSSKQAADA
图2 psl基因的碱基序列及氨基酸序列
Fig. 2 Nucletide and amino acid sequence of the pea iectin gene
注：下划线部分为引物序列，黑体为阅读框起始、终止密码子。
Note：The underline regions are primers；two bold-faces are initiation and terminating codon of ORF respectively.
2.2 植物表达载体的构建
分别用XbaⅠ+Hin d Ⅲ双酶切质粒pMD-PsL和pVCT2020,回收前者小片段（2Kb）与后者大片段(9.5Kb)，连接后得到质粒pVCT-PsL。pVCT-PsL经XbaⅠ+ Hin d Ⅲ双酶切鉴定，得到9.5kb和2kb的两个片段，说明psl基因已成功亚克隆到pVCT2020中。
用Pma C Ⅰ单酶切质粒pVCT-PsL ，得到11.1kb 和0.4kb 两个片段，回收大片段并自环化后
得到质粒pVCT-PsL ＊。这一步将表达载体中的荧光蛋白gfp 基因去掉，有利用今后进一步观
察分析转psl 基因烟草与豌豆根瘤菌的相互吸附作用。
2.3 农杆菌转化及转基因烟草的获得
采用液氮冻融法将植物表达载体pVCT-PsL ＊转化到根癌农杆菌EHA105中。以P1/P2为引
物PCR 鉴定农杆菌的转化子，电泳检测表明其PCR 产物为2 kb ，证明pVCT-PsL ＊已转入农杆菌
中。含有目的基因的农杆菌经过活化后,采用叶盘转化法对烟草叶片进行转化。经1～2次继代培养，外植体产生愈伤组织；经2～3次继代培养，愈伤组织分化出芽；待芽长至1～2cm ，转到生根培养基上生根，长成完整植株后移栽到花盆中。
2.4 转基因烟草的PCR 鉴定
Gheysen 等提出的T-DNA 整合模型[13]认为，T-DNA 在植物染色体中的整合过程中，T-DNA 左边界有较大变化，其部分片段会被切除掉。因此，在LB 左边设计引物P5，则用引物
P3/P5在质粒pVCT-PsL ＊中可扩增出一条包含LB 和NPT Ⅱ基因的长约1.4kb 的目的条带，而转
基因烟草gDNA 则不能扩增出此目的条带。通过此法可以排除转基因烟草gDNA 中农杆菌DNA 污染造成的PCR 鉴定假阳性。
提取十株Kan 阳性植株gDNA,以质粒pVCT-PsL ＊为模板作阳性对照，未转基因烟草gDNA 为
模板作阴性对照，分别用引物P1/P2、P3/P4和P3/P5对其进行PCR 检测。
PCR 产物电泳结果表明：以P3/P5为引物，阳性对照扩增产物为1.4kb ，全部Kan 阳性植株与未转基因烟草均没有扩增产物(图3A)，说明所提取的烟草gDNA 中无农杆菌DNA 污染；以P3/P4为引物，全部Kan 阳性植株gDNA 的扩增产物同阳性对照所扩增的产物大小一致,均为
1.1kb ，而未转基因烟草没有扩增产物(图3B)，说明Kan 阳性植株中成功导入了NPT Ⅱ基因；以P3/P4为引物，全部Kan 阳性植株gDNA 的扩增产物同阳性对照所扩增的产物大小一致,均为2kb ，而未转基因烟草没有扩增产物(图3C)，说明Kan 阳性植株中成功导入了psl 基因。
图2 转基因烟草的PCR 鉴定：采用引物P3/P5（A ）；采用引物P3/P4（B ）；采用引物P1/P2（C ）。
Fig. 2 PCR analysis of transformed tobacco plants:using primer P3/P5 (A) ; using primer P3/P4 (B) ; using primer
P1/P2 (C) .
注：M ，DL2000 marker ；1～10，转基因植株PCR 产物；P ，阳性对照；N ，阴性对照
Note ： M ，DL2000 marker ；1～10，PCR product of transformed plants ；P ，PCR product of pVCT-PsL ＊；N ，PCR product
bp 750 1000 500 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P N C
2000 250 bp 2000 A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P N
1000 500 100 750 2000 250 1400 1100 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P N 1000 500 250 100
750 2000 bp
of non-transformed control.
综上所述，本实验成功克隆出psl基因并构建成植物表达载体pVCT-PsL＊，通过农杆菌介导转化烟草，获得一批携带有psl基因的转基因烟草。在转基因植株PCR鉴定过程中，成功排除了农杆菌DNA污染造成假阳性的可能，表明psl基因已经整合到烟草的基因组染色体上。该转psl基因烟草可用于进行下一步与根瘤菌的相互作用分析。
参考文献：
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2．材料与方法 2.1实验材料 植物材料：K326烟草种子 药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等； MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0 预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml 分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml. 生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基 2.3实验方法 2.3.1浸染菌液制备 将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。 挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。 活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。 取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。 2.3.2烟草转化 按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html,
植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。但是，以往的工作重点多在容易做的模式植物上，从而使烟草、马铃薯、番茄、矮牵牛、拟南芥菜等植物的分子生物学和转基因技术发展很快。近年内以实用为目标的研究数目大大增加，在国外，主要的种子公司和一些小公司竞相开发重组 D NA技术，用于重要作物的商业应用，将研究机构和大学首创的原理和科技用于开发，导致植物基因工程向重要粮食和豆科作物遗传改良的实用化目标迈进。在1988年以前，重要谷类作物和豆科作物的转化十分困难，只是在一种生物技术的新工具——“基因枪”研制成功以后，才使得这些作物的转基因不但成为可能，而且常常可以做到不依赖于品种或基因型。基因枪是用火药爆炸、电容放电或高压气体作为加速的动力，发射直径仅1微米左右的金属颗粒。微粒表面用优选的基因包覆，高速射入植物细胞，并在细胞内表达产生有活性的基因产物，从而达到改良品种的目的。最初大豆基因工程的重点放在原生质体和胚性悬浮细胞的再生上，但进展很慢，获得转基因大豆是一个很大的难题。基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。在1988至1990年仅两年时，建立了可实用的大豆转化体系，这是目前唯一的不依赖于基因型的大豆转化方法。抗除草剂 B astar和Roundup的基因也已转入大豆，并在过去三年中连续进行了田间试验，预期不久将可商业化，这将是豆科作物基因工程商业化应用的一个里程碑。大豆基因工程今后的目标可包括蛋白质和油脂成分的修饰、抗虫、抗病毒及其他病害抗性等。水稻为世界第二大谷类作物，但在我国则为最大的粮食作物，年产18992万吨（中国农业年鉴1993）。我国和印度的水稻产量占世界总产量的60％，全球几乎一半人口以稻米为主要热量的来源。水稻和爪洼稻、籼稻占栽培水稻的80％，供世界20多亿人食用。水稻得到转基因植始于1988年，最初均以原生质体为受体，采用 D NA直接转移法，再生出了可育的转基因植株。但是，原生质体再生体系的限制很大，粳稻上只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可由原生质体再生植株的籼稻品种迄今尚未获得转基因植株。由于水稻未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。因此，一些科学家认为，原生质体转化在水稻上应用前景有限，最好是用基因枪转化水稻幼胚。最近
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
烟草转基因操作细则 烟草无菌苗准备: 将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。 转基因步骤： 1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）； 2 离心收集菌液； 3 用25 mL激活培养基(液)悬浮； 4 在28o C摇3- 5 h； 5 转入到培养皿； 6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）； 7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方； 8 在激活培养基中浸泡10 min 左右； 9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液； 10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）； 11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养； 12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。 培养基配方 激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)； 共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8); 筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L； 潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**； 生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。 注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
烟草转基因 准备工具：EP管灭菌 无菌水 Ms培养基 75%的酒精（蓝口小瓶） 升汞(要回收) 1ml枪枪头 EP管架 计时器 一、转基因 (1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次； (2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec； (3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次； (4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实 验室组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天。 MS培养基pH5.8 (5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使 其快速成长）培养基上，继代培养。 (6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶 片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。 (7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上， 摇菌农杆菌2瓶。 将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs） 不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；
(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切 口周围有微菌斑形成； (9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5 次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌； (10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8； 过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。 (11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的 小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8； (12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。 (13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥 炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。 农杆菌侵染液的制备 (1) 取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加 入50mg/L Kan和50mg/L Rif； (2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入 摇床中28℃、200rpm培养过夜（12h-16h）； (3) 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。 (4) 摇菌，LB液体培养基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）10ul、Rif（所需浓 度50mg/L）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养（12h-16h）。 (5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
生物技术 TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能 刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张 朝1,2,赵昌平2,陈学平1 1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026; 2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097 摘 要:NAC(NAM ATAF CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因 T a NAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达Ta NAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明Ta NAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,T a NAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。 关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草 doi:10 3969/j.issn.1004 5708 2010 06 016 中图分类号:S572 032 文献标识码:A 文章编号:1004 5708(2010)06 0082 07 Effects of Ta NAC on drought resistance in transgenic tobaccos LIU Mei ying1,2,YE Xiao fang2,TANG Yi miao2,GAO Shi qing2,Z HANG Zhao1,2, Z HAO Chang ping2,C HEN Xue ping1 1Department of Chemistry,Graduate School of University of Science and Technology of China,Hefei230026,China; 2Beijing Engineering and Technique Research Center of Hybrid Wheat,Beijing Acade my of Agricultural and Forestry Science,Beijing100097,C hina Abstract:NAC(NAM ATAF C UC)transcription factors play important roles in various stress response.In this study,one NAC gene named TaNAC encoding a NAC protein in wheat(Triticum aestivum L.)was identified.The putative TaNAC pro tein structure was special.The N terminal DNA binding domain consisted of only three subdomains(A,B,D),while the C terminal was similar to the DREB protein,sharing several motifs.Real time PCR confirmed that TaNAC was strongly induced after24h under drought treatment.Ta NAC was constructed into PBI121by c onnection with35S promoter;transgenic seedlings were obtained by Agrobacterium mediated genetic transformation https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html,paring to wild types,overexpression of TaNAC gene showed significant drought resistance in transgenic tobaccos.It also indicated that TaNAC was excellent candi date for plant drought breeding. Key words:NAC;transcription factor;phylogenetic tree;drought;transgenic tobacco 作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E mail: liumy@mai https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html, 陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物 遗传育种,E mail:chenxp08@us https://www.doczj.com/doc/9b7074182.html, 基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002 002, 2008ZX08002 003,2008ZX08002 004) 收稿日期:2010 06 02 NAC(NAM ATAF C UC)转录因子是近十几年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因子。Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM 基因和拟南芥ATAF1/2和C UC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为NAC[1]。第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中
RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 二、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 三、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。 2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 （1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。 （2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10×PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl