启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被RNA 聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。完全的启动子称为规范序列。
启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。关于其结构特点，Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNase l水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41～44个核苷酸对。他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子、h 噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。
许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox），这个框的中
央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列（-10 sequence），后来在-35 bp处又找到另一个共同序列（TTGACA）。Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATAbox）。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE）或上游激活序列(uptreamactivatingsequence，UAS）。另外在-70～-78 bp处还有一段共同序列CCAAT，称为CAAT框（CAAT box）。
在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游-25~-30 bp处的共同序列似TAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游-70～-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列．称为CAAT区（CAAT hox）。
2.4 -10位的TATA区和-35位的TTGACA区
提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。果然，科学家不久就从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SY40启动子的-35 bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。经过数年的努力，分析了46个人肠杆菌启动子的序列以后．确证绝大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于-10bp处（……T89A89T50A65A100……）的TATA区和-35 bp处（……T85T83G81A61C69A52……）的TTGACA区。现已查明，-10位的TATA 区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ
因子相互识别而具有很高的亲和力。
原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，强启动子一般为17±1 bp，当间距小于15 bp或大于20 bp时都会降低启动子的活性。
在真核基因中，有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。GC 框位于-80～-110bp处的GCCACACCC或GGGCGGG序列。
TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。如在TATA框同相邻的UPE之间插入核苷酸，也会影响转录使之减弱。
-10序列又称为Pribnow盒（原核生物）。在真核生物中相应的序列位于-35bp处，称为TATA盒，又称为Goldberg-Hognessbox，是RNA 聚合酶Ⅱ的结合部位。-10和-35这两个部位都很重要：【1】RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主链中的磷酸基相接触；【2】离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱；【3】最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能"感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。"
原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列（-35和-10）之一。在这种情况下，RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅
助蛋白质的帮助。可能是这些蛋白质因子与邻近序列的反应可以弥补启动子的这个缺陷。
在真核生物中，在转录起始位点上游70-80bp处有CAAT顺序，也称为CAAT盒。这一顺序也是比较保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别一顺序。近年来在对家兔β珠蛋白基因CAAT 顺序的研究中发现，用人工方法诱导CAAT顺序发生突变使家兔β珠蛋白基因的转录水平降低。
启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如，在核糖体RNA合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代（例如克隆在质粒DNA中的rRNA基因），则转录起始的频率将降低10倍。同样，在其他情况下，远隔部位的富有AT的DNA 顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的"激活蛋白"的结合部位。但是，上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。
怎样找启动区？
基因启动子位于基因转录起始位点的上游几kb的区域内，一般来说启动子区域具有一定的保守序列特征，另外，启动子区域一般还具
有比较高比例的GC含量，这些高GC含量的区域组成一些GC岛；如果一个新的基因在不能确定其启动子的情况下，最好在设计PCR引物时，多设计几对，最大限度地将新基因的启动子区域囊括在这些PCR 里面。。如：你可以分析一下，得到高GC含量的区域，然后在涵盖这个区域设计一系列的引物，然后PCR。顺式调控元件
有顺式调控元件(cis-regulatory element)，或顺式作用元件是调节位于相同的DNA分子(通常是一个染色体)的基因的表达的DNA 或RNA的区域。这个词是从拉丁词顺，这意味着“在同一侧的”构建。可能有顺式元件位于控制(或什至更上游的启动子区域)的基因的编码序列的上游，在一个内含子，或该基因的编码序列的下游，无论是在非翻译或未转录区域。
就是位于基因上下游的调控基因表达时间、强度、位置等的蛋白或DNA序列。
上游控制元件从-180bp至-107bp，
II型启动子有核心元件和上游启动子元件组成，
上游启动子元件通常位于-70bp附近的CAAT盒GGCCAATCT和-90bp附近的GC盒GGGCGG、以及距转录起点更远是上游元件。
上游启动子有3个上游元件：TATA框，近端序列元件（PSE）h 和八聚体元件（OCT）。
启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度，主要方法是用却是实验来确定启动子上游的边界，当缺失影响转录起始时，说明该处就是启动子上游区的边界，
Smart Race技术是近年来开发的一种快速、方便的定位基因转录起始位点的方法。
启动子克隆方法：利用启动子探针质粒载体筛选启动子；启动子探针型载体是一种经济、有效、快速分离基因启动子的工具型载体，包括两个部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。
利用启动子探针筛选启动子过程：先选用一种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计要求是克隆片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组或何物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。利用PCR技术克隆启动子：1环状PCR：包括I-PCR（Inverse-PCR）和P-PCR （Panhandle-PCR）2.TAIL PCR3.利用载体接头的染色体步移技术克隆基因的启动子。当插入段同时满足（1）具有基因启动子序列（2）具有翻译起始区（3）具有起始密码子（4）插入方向正确（5）插入片段3’端编码区序列抗性基因融合基因，从而启动抗性基因表达。
启动子区域的确定——染色体定位，根据基因图谱对序列进行染色体定位浏览其基因组上游基因，具体方法（1），进行Genomic BLAST 搜索；（2）通过Genome view观察基因组结构；（3）点击相应染色体区域上游的基因进行精确定位
基因上游调控序列的分析:
(1)启动子预测，用FIRSTEF程序进行启动子预测，用PT-PCR等
实验方法，获得的mRNA往往缺少完整的5’端，采用FirstEF 程序可以对第一外显子和CPG相关启动子进行预测。(2)转录因子结合位点分析：TFSEARCH程序和MATCH程序。
报告基因是一种编码可检测的蛋白质或酶的基因，可以通过对其表达产物的鉴定及定量分析等进而对目的基因进行研究，报告基因主要用于：1.把报告基因序列和起基因表达调控作用的序列连接起来，进行表达调控序列的结构和功能研究2、与目的基因融合表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达3、在反式作用因子相互作用检测体系中，可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质只见到相互作用。另外，在基因工程中常用报告基因里对转化条件进行摸索和优化功能研究。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件1、已被克隆且序列清楚2、表达产物受体细胞不存在3、表达产物能进行定量测定，在动物基因表达调控中，报告基因被广泛应用。
将所研究的目的基因调控序列克隆到报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当细胞系，通过测定报告基因的表达的水平，间接评价，在调控序列指导下对基因表达的作用。
分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第８５－９１页 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），８５－９１ 专题报告 Ｒｅｖｉｅｗ 植物基因启动子的克隆方法及其应用 尹辉李丹张毅李秋莉﹡ 辽宁师范大学生命科学学院，大连，１１６０２９ ﹡通讯作者，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ 摘要植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多，从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到ＰＣＲ方法的应用，此后相继问世的一些基于ＰＣＲ的克隆启动子技术，如载体锚定ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、接头ＰＣＲ、交错热不对称ＰＣＲ等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法，分析了它们的优缺点，并展望了今后的研究前景。 关键词启动子，启动子陷阱技术，反向ＰＣＲ，锚定ＰＣＲ，交错热不对称ＰＣＲ ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＹｉｎＨｕｉＬｉＤａｎＺｈａｎｇＹｉＬｉＱｉｕｌｉ＊ ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ，１１６０２９ ﹡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｈｅｈｏｔｓｐｏｔｓｔｕｄｙｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｒｏｍｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｕｓｅｄｗａｙｔｈａｔａｐｐｌｙｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇｐｒｏｍｏｔ－ｅｒｔｏｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆＰＣＲ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｏｔｓｏｆｗａｙｓｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｂａｓｅｄｏｎＰＣＲｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｓｕｃｈａｓＡ－ＰＣＲ，Ｉ－ＰＣＲ，ＬＡ－ＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｙｏｆ－ｆｅｒｅｄｍｏｒｅｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｓｏｍｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｐｌａｎｔｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｗａｙｓｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓａｌｓｏｄｉｓ－ｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｍｏｔｅｒ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｉ－ＰＣＲ，ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ 启动子是ＲＮＡ聚合酶能够识别并与之结合、从而起始基因转录的一段ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。本文就近几年来克隆植物基因启动子的各种方法做一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 １植物基因启动子克隆的几种方法 １．１利用常规ＰＣＲ技术克隆启动子 对于序列已知的启动子，只需要根据已知的启动子序列设计引物，然后采用ＰＣＲ扩增的方法就可以获得该启动子。该方法比较简便快捷，是近年来使用较为广泛的一种方法。 王利军等（２００４）根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥基因组序列中ａｔｓ１Ａ（核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶小亚基）基因启动子的序列设计引物，以拟南芥总ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出ａｔｓ１Ａ的基因启动子区片段，将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，得到重组质粒并且进行测序，序列分析表明，所克隆的片段为１１１７ｂｐ，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ａｔｓ１Ａ基因启动子序列比较，发现只在－７７６位缺失１个碱基。 该方法简便、快捷、操作简单，但不能克隆到全新的启动子。
启动子概述 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子是一段位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物。启动子分三类：启动子Ⅰ、启动子Ⅱ、启动子Ⅲ.只有启动子Ⅱ指导mRNA的转录。真核生物启动子Ⅱ由两大部分组成：上游元件(upstream element)和启动子核心(core promoter)。上游元件与转录的效率有关；启动子核心包括3部分：TATA 盒、起始子(initinator)及下游元件(downstream element)。TATA盒为转录调控因子包括各种调节蛋白的结合区，与转录起始位点的精确选择及转录有关，起始子是转录起始所必须，下游元件作用尚不清楚。原核生物启动子区范围较小，包括TATAAT区(Pribnow区)及其上游的TTGACA区。 启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合位点的DNA序列，位于基因上游。启动子具有如下特征： 1序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动活性的改变。 2方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，有单向启动子和双向启动子两类。 3位置特性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因的下4种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动 没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T， 故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7,pMC1，PGK启动子等。一下介绍几个常见的启动子。 （1）U6启动子 U6是二型启动子，一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列。由Ⅲ类RNA聚合酶启动子U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果。这一类 启动子在腺病毒和慢病毒干扰载体的构建中应用很多。U6更多的是用在shRNA的启动，来达到敲低一个基因的作用。
第六章子程序结构 §6.1 子程序的设计方法 §6.2 嵌套与递归子程序 §6.3 子程序举例 §6.4 DOS系统功能调用
§6.1 子程序的设计方法 一、子程序指令 二、子程序的调用与返回 三、现场的保护与恢复 四、子程序参数的传递 把功能相对独立的程序段单独编写和调试，作为一个相对独立的模块供程序使用，就形成子程序 子程序可以实现源程序的模块化，可简化源程序结构，可以提高编程效率
使用格式： 过程名PROC 属性 过程代码 过程名ENDP 一、过程定义伪操作 可以是：near或far NEAR属性（段内近调用）的过程只 能被相同代码段的其他程序调用FAR 属性（段间远调用）的过程可以被相 同或不同代码段的程序调用 属性的确定： 1、如果调用程序和过程在同一个代码段中，则使用NEAR属性; 2、如果调用程序和过程不在同一个代码段中，则使用FAR属性.
子程序是常用的程序结构。采用子程序可以提高编程效率，使程序结构更为清楚，便于维护。 1.子程序调用指令CALL CALL指令位于主程序，CALL调用的子程序与CALL指令可以处于同一代码段内，也可以在不同的代码段，因而分段内调用和段间调用；调用时可以采用直接寻址，也可采用间接寻址，故调用指令有四种格式：段内直接调用、段内间接调用、段间直接调用、段间间接调用。 指令中“near ptr”表示段内调用，“far ptr”表示段间 调用，但是由于汇编程序可自动识别“段内”和“段间”， 故可省略。 二、子程序调用及返回指令
子程序调用和返回指令： code1 segment main proc far …… call far ptr subp ……ret main endp code1 ends code2 segment subp proc far …… ret subp endp code2 ends 段间调用和返回 code segment main proc far …… call subp ……ret main endp subp proc near …… ret subp endp code ends 段内调用和返回
“螺旋讲堂”2008 年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
“螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
螺旋 亲爱的螺友们，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网，让 我们一同在讨论中学习，在交流中成长！ 分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从 某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当 然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的 DNA 序列了。 我们这期主要探讨基因的表达。而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。基因 的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要 谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？ 这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用 的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！ 本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有 详细说明.
一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道， 基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游， 当一个基因在没有 确定其转录起始位点的时候，我们假定 NCBI 上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的 第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游 2000bp 左右和下游200bp 左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发 现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因 mRNA 序列和基因组序列 BLAST， 就能够在染色体上找到这段基因 组序列。我这里用 human 的 AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下.
https://www.doczj.com/doc/9013515478.html,
启动子克隆方法研究进展 随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1启动子克隆的几种方法 1.1利用启动子探针载体筛选启动子 启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。 当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。
实验报告 课程名称汇编语言程序设计 实验项目实验三、子程序结构和设计实验仪器微机系统、汇编调试环境 系别计算机科学与技术 专业计算机科学与技术 班级/学号计科1103/2011011111 学生姓名房皓 实验日期2013-6-2 成绩 指导教师胡信裕
实验三子程序结构和设计 一、实验目的 1.进一步熟悉、掌握顺序结构、分支结构、循环结构程序设计和调试。 2.熟悉、掌握子程序设计和调试； 3.熟悉、掌握键盘输入和屏幕输出的中断调用方法和应用。 二、实验要求 1.Windows操作系统并具有命令提示符操作界面的计算机，且系统内安装有汇编语言编 程环境。 2.在开始本实验之前，复习教科书的相关内容，并预先写出相应的源程序。 3.通过汇编IDE上机调试，注意观察，并记录下现象。 三、实验内容 功能要求：从键盘上以16进制数的形式输入20个无符号数（0~255），以回车作为一个数输入的结束。将它们以16进制数的形式在屏幕上按输入顺序显示，并换一行后将它们由大到小排序显示，数之间用空格隔开。【可键入任意字符，但只对十六进制数处理显示】。 1.运用文本编辑器编辑实验源程序（EXP3.asm）； 实验程序设计如下： Data segment array db20dup(?) mess1 db0dh,0ah,'PRE_Enter:',0dh,0ah,'$' mess2 db0dh,0ah,'SORTED:',0dh,0ah,'$' ;a_len equ ($-array)/2 Data ends Code segment Assume ds:data,cs:code Main proc far start: mov ax,data mov ds,ax call getarray ;调用getarray子程序 mov ah,9;显示提示信息mess1: mov dx,offset mess1 int21h call output ;调用output子程序，输出排序前的序列 call disp0d0a ;调用disp0d0a子程序，输出回车换行 call disp0d0a call sort ;调用sort子程序，由大到小排序 mov ah,9;显示提示信息mess2: mov dx,offset mess2 int21h call output ;调用output子程序，输出排序后的序列
第6章CpLTP3、CpLTPI.4基因启动子克隆及瞬时表达分析 为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、CpLTP4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。 6.1 实验材料 6.1.1 植物材料 供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内,常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85％，16h光照(2000Lx)，温度25℃，8h黑暗，温度20℃。烟草W38（Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。 6.1.2 菌种和载体 大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。 克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。 6.1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)均购自上海生物工程有限公司。 6.1.4 主要设备 紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机（Eppendoff），TGL-16B型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR仪，IKA型 涡旋器（德国产），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳 仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。
了解启动子 目录 1. 基因的构成 (2) 2. 启动子（promoter） (3) 3. 终止子（termianator） (4)
1. 基因的构成 基因是由成千上万个核苷酸对组成。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用不同。在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。任何一个基因都包括非编码区和编码区。能够转录为相应信使RNA-mRNA，进而指导蛋白质合成(也就是能编码蛋白质）的区段叫做编码区,编码区中可分为内含子和外显子。不能转录为信使RNA、不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。非编码区位于编码区前后，同属于一个基因，控制基因的表达和强弱。 非编码区虽然不能编码蛋白质，但对遗传信息的表达是不可缺少的，因为在它上面由调控遗传信息表达的核苷酸序列，该序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子、终止子属于非编码区。因为回文序列的特殊排列，大多都位于非编码区。
原核基因的编码区全部编码蛋白质，真核生物的基因是间断的、不连续的、断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，可以编码蛋白质的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。非编码区在每个断裂基因的第一个和最后一个外显子的外侧，有人称其为侧翼序列。在侧翼序列上有一系列调控序列。通常把基因转录起点前面即5’端的序列称为上游(upstream)，起点后面即3’端的序列称为下游(downstream)。并把起点的位置记为+1，下游的核苷酸依次记为+2，+3，……，上游方向依次记为-1，-2，-3，……。 2. 启动子（promoter） 位于编码区上游的非编码区中，含有丰富的转录因子结合位点（transcription factor binding sites, TFBS）。主要包含核心启动子区域（TSS附近-60bp到+40bp）和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，对于精确转录是必须的最小单元；调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。 启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp（主要在transcript start site 上游1kb的范围内），有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。
1、UCSC （1）网址：https://www.doczj.com/doc/9013515478.html,/cgi-bin/hgNear 在Genome里选择物种，比如human，search里输入你的基因名PTEN，点击Go （2）出现新的页面，看到“Known Gene Names”下面的PTEN了吧，点它 （3）又回到了和（1）类似的页面，此时，点击sequence （4）出现一个新的页面，选中promoter，同时可以输入数值修改具体的序列区域，比如Promoter including 2000 bases upstream and 100 downstream，即表示启动子-2000～＋100区域 （5）点击“get sequence”，出现页面中最上面的序列“>uc001kfb.1 (promoter 2000 100) PTEN - phosphatase and tensin homolog”就是你要的人PTEN启动子-2000～＋100区域的序列了 2、Ensembl （1）网址：https://www.doczj.com/doc/9013515478.html,/index.html 在“Search Ensembl“标题下search后的下拉框中选中物种名homo sapiens（人），for框中输入基因名PTEN，点击Go （2）出现的新页面中比较乱，但不要管它，直接寻找“Ensembl protein coding gene ”字样的，对，也就是第二个，点击它 （3）新出现的页面也很乱，不过依然不用管它，看到左侧有点肉色（实在不知道怎么描述了）的那些选项了吗，对，就是“Your Ensembl”下面那一堆，在里面找“Genomic sequence”，点它 （4）现在的界面就一目了然了，在“5' Flanking sequence”中输入数值确定启动子长度（默认为600），比如1000，点击update； （5）出现的序列中，标为红色的就是基因的外显子，红色之间黑色的序列就是内含子，而第一个红色自然就是第一外显子了，那么从开始的碱基一直到第一个红色的碱基间自然就是启动子-1000~+1的序列啦 这样，你不仅查到了启动子，连它的外显子、内含子序列也全部搞定了
“螺旋课堂”2008 年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
“螺旋课堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
螺旋 亲爱的螺友们好，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网， 让我们一同在讨论中学习，在交流中成长！ 分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从 某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当 然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的 DNA 序列了。 我们这期主要探讨基因的表达。而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。基因 的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要 谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？ 这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用 的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！ 本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有 详细说明.
一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道， 基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游， 当一个基因在没有 确定其转录起始位点的时候，我们假定 NCBI 上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的 第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游 2000bp 左右和下游200bp 左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发 现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因 mRNA 序列和基因组序列 BLAST， 就能够在染色体上找到这段基因 组序列。我这里用 human 的 AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下.
https://www.doczj.com/doc/9013515478.html,
启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。 不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。 （1）、-10序列在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。 频度：T89 A89 T50 A65 A65 T100 据预测，Pribnow框中，一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。 目前认为，Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物，Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 RNA聚合酶的结合，诱导富含AT的Pribnow框的双链解开，然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。 （2）、-35序列 只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。 各碱基出现频率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。 -35序列的功能：它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此，-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。 -35序列提供RNA聚合酶识别信号， -10序列有助于DNA局部双链解开，启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 2.熟悉原核生物启动子的结构与功能、其中的－35区、－10区等的结构？ ①域中的基序并与之结合，启动转录的起始。一般将DNA上的转录位点定位+1来排序，其下游（右侧）为正值，其上游（左侧）为负值。原核生物不同基因的启动子虽然结构也有一定的差异，但明显具有共同的特点。◆结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；◆序列保守，如-35序列，-10序列结构都十分保守；◆位置和距离都比较恒定；◆直接和多聚酶相结合；◆常和操纵子相邻；◆都在其控制基因的5′端；◆决定转录的启动和方向。 ②-35序列又称为Sextama盒,其保守序列为TTGACA，与-10序列相隔16～19bp。其功能是：◆为RNA 聚合酶的识别位点。RNA 聚合酶的核心酶只能起到和模板结合和催化的功能，并不能识别-35序列，只有σ亚基才能识别-35序列，为转录选择模板链。◆-35序列和-10序列的距离是相当稳定的，过大或过小都会降低转录活性。这可能是因为RNA 聚合酶本身的大小和空间结构有关。 ③-10序列也称为Pribnow框盒,其保守序列为TATAAT，位于-10bp左右，其中3′端的“T”十分保守。A,T较丰富，易于解链。它和转录起始位点“I”一般相距5bp。其功能是：◆与RNA聚合酶紧密结合；◆形成开放启动复合体；◆使RNA聚合酶定向转录。 为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?显然启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5’末端的序列称为上游（upstream），而把其后而即3’未端的序列称为下游（downstream）。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3…
启动子（Promoters）克隆方法研究进展 1启动子克隆的几种方法1.1利用启动子探针载体筛选启动子1.2利用PCR技术克隆启动子1.3环状PCR 1.4利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子1.5YADE法1.6TAlL-PCR 关键词：研究进展方法启动子Promoters克隆方法 随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1启动子克隆的几种方法 1.1利用启动子探针载体筛选启动子 启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子； (4)插入方向正确；(5)插入片段3'端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lac Z)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet')和卡那霉素抗性基因(Kan')。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pS UPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。 1.2利用PCR技术克隆启动子 即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。 苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5'启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5'启动子区的片段，酶切克隆到p SK的SacI和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片
C M V启动子
精品资料 CMV启动子 质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等。zhengzzh对CMV和T7的来源做了介绍。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。 T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS 和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。 CMV：CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达[1]。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。在这一区段的-50～-580bp之间至少有4套13～18bp的重复序列。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型的细胞的影响 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
1.启动子：是转录时RNA聚合酶结合的位点，是位于基因编码区的一段DNA，与RNA聚 合酶结合后起始mRNA合成的序列。 2.复制起始位点：是DNA复制的起点，是带动目的基因复制的 3.起始密码子：是位于mRNA上的，是翻译开始的地方，其本质是RNA 4.转录起始点：转录时，RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。 5.一般启动子位于转录起始点上游，具体位置关系如下： a.真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子。 b.RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因，启动子（I类）较单一，由转录起始位点附近 的两部分序列构成。第一部分是核心启动子，由-45—+20位核苷酸组成，单独存 在时就足以起始转录。另一部分由-170—-107位序列组成，称为上游调控元件，能 有效地增强转录效率。 c.RNA聚合酶Ⅲ负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些核内小分子RNA（snRNA），其 启动子（Ⅲ类）组成较复杂，又可被分为三个亚类。两类5S rRNA和tRNA基因的 启动子是内部启动子，位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。第三类启动子 由三个部分组成，位于转录起始位点上游。 d.RNA聚合酶II负责转录的II类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因， 后者的启动子结构与III类基因启动子中的第三种类型相似。编码蛋白质的II类基 因启动子在结构上有共同的保守序列，多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共 有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定，也有一些II类启 动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。 6.原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列-35区和-10区组成，位 置关系：-35区，-10区与-35区之间的间隔，-10区，间隔，转录起始位点
微机原理与技术实验四：子程序结构
实验四：子程序设计 一、实验目的：掌握子程序结构，熟悉汇编上机环 境。 二、实验内容：设有数组SCORE存放学生的成绩 （0~100分），编写一个子程序统计0~59分、60~69分、70~79分、80~89分、90~100分的人数，并分别存放到SCOREE、SCORED、SCOREC、SCOREB、SCOREA单元中。编写一个主程序与之配合使用。 三、实验步骤： 1、在“轻松汇编”环境下编写、编译和生成程序； 2、进入DEBUG界面，运行程序，观察SCOREE、SCORED、SCOREC、SCOREB、SCOREA变量的值是否正确: 在DEBUG下运行程序：F9键 观察多个变量值：“Data”→“Add Watch”→“输入变量1” “Data”→“Add Watch”
“输入变量2” …… 四、流程图与源程序： DATA SEGMENT SCORE DB 80,78,45,81,90,72,60,75 SCOREE DB 0 SCORED DB 0 SCOREC DB 0 SCOREB DB 0 SCOREA DB 0 DATA ENDS STCK SEGMENT DB 10 DUP(?) STCK ENDS CODE SEGMENT ASSUME CS:CODE,DS:DATA,SS:STCK START: 补全程序
MOV AH,4CH INT 21H ;以下为子程序 COUNT PROC 补全程序 RET COUNT ENDP CODE ENDS END START
主程序开始 设置地址指针指向SCORE 首地址 设置循环次数=SCORE 元素个数 调成绩判断子程序 地址指针加一 循环次数减一 循环次数=0 N 返回DOS Y 子程序开始 取当前地址指针所指向的元素 当前元素<90SCOREA 加一 当前元素<80SCOREB 加一 当前元素<70SCOREC 加一 当前元素<60SCORED 加一 SCOREE 加一 子程序返回 N Y N Y N Y N Y 五、实验小结 说明：实验报告要包涵上述五项 DATA SEGMENT
基因启动子分析 一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没有确定其转录起始位点的时候，我们假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST，就能够在染色体上找到这段基因组序列。我这里用human的AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下. 1 首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,这个我想大家都应该很清楚,如下图.
2 然后就是用这段mRNA序列和人类的基因组序列BLAST 3 BLAST得到了很多结果，我们往往选择最上面那个最匹配的结果。
4 点击之后就可以看到下图，这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上的位置一目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本启动子就应该在第一外显子上面，我用红色的方框标明了。 5 大家有没有注意到左上方有个数据框，我把数值改为76,360K 到 76,362.200 ,刚好2200BP,包括了第一个外显子的前200BP左右. 然后点击红色框标明的Download/view sequence.
6 然后就到了这个界面, Sequence Format 选择GenBank, 然后点击 Display. 就得到我们所需要的序列了. 7 这里我们可以看到1989到2201是AGGF1的mRNA序列,说明我们的确找到了该基因5'非翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bp都克隆下来. 以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区域或者是基因的3'非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的.