CRISPR—Cas基因组改造技术研究进展
郭嘉海1王奇奇2邹虎山3
（1.生物技术1班学号：121303109，2.生物技术1班学号：121303110，3.生物技术1班学号：
121303111）
摘要：CRISPRs—Cas系统是一种细菌获得性免疫系统，为一段规律成簇间隔短回文重复，保护细菌和古生菌免遭病毒、质粒等的入侵。这种免疫系统是由一种小RNA和多结构域蛋白质／蛋白复合物构成，其作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似。这个系统已发展为一种高效、特异、操作简单易行的基因修饰工具，与TALEN、ZFN相比．CRISPR—Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效和简易，具有更大的潜力。CRISPR／Cas系统已成功应用到细胞、干细胞、小鼠、斑马鱼及植物等多种生物，显示了其强大的基因编辑优点[1]。综述了CRISPR—Cas系统的技术原理及其在生物学研究中的应用最新研究进展，并探讨了该技术的发展前景。
关键词：规律成簇间隔短回文重复(CRISPRs)；内切酶；同源重组机制；非同源末端连接机制；脱靶效应；
Abstract：CRISPRs—Cas is the elucidation of the prokaryotic adaptive immune system and clustered regularly inter- spaced short palindromic repeats，which protects bacteria and archaea against viruses or conjugative plasmids．The immuni— tv svstem consists of bacteria RNA molecules and versatile multi—domain proteins or protein complexes，which may be simi— lar to the mechanism of RNA interferenee．CRISPR—Cas interfefence machines are utilized to develop into a genome edit — ing tools with efficiency，specialization and simplicity．Distinct from TALEN and ZFN，the CRISPR-Cas system has recent— ly emerged as a potentially facile and efficient alternative t001．Currently．researches have already modified the genome of cell，IPS，mouse，zebra，fish and plant with this system that show powerful ability to edit gene．The technical principles of CRISPR—Cas system and the latest progress on the application in biological study of CRISPR ／Cas system was reviewed，and the development future of the system was discussed．Key words：clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)；endonuclease；homologous recombi— nation；non—homologous end joining；off-target effect.
CRISPRs(Clustered regularly interspaced short pa—lindromic repeats)为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构[2-3]。CRISPR通过与一系
列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。这种结构的作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似，最早于1987年在大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的i印基因侧翼序列中被发现[4]。
1 CⅪSPR—Cas技术原理
CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列组成，重复序列的长度通常为21.48bp，重复序列之间被26～72bp间隔序列隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别睁[1]。
Cas(CRISPR associated)：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在向导RNA(guidance RNA) 引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR— Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是由间隔序列决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化(即通过增加或删除间隔序列)来实现的[4]。与TALEN、ZFN不同，CRISPR—Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效，具有更大的潜力。在细菌中，CRISPR参与协助一些细菌躲避哺乳动物免疫系统。目前已经发现3种类型的CRISPR—Cas系统，这3种类型可根据Cas位点基因组织源性的不同来区分。这3种类型进一步又可分成10种亚型，并表达针对干扰的不同蛋白复合物。虽然有很多CRISPR—Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要Cas9内切酶就足够，这种CRISPR—Cas系统被称作2型系统(Type II systems)， 2型系统以Cas9蛋白以及向导RNA为核心，即 CRISPR—Cas RNA引导核酸酶(CRISPR—Cas RNA —guided nuclease，CRISPR—Cas RGN)，Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达该蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或质粒等外源DNA的侵入。在二型CRISPR—Cas系统中，短链外源DNA整合在CRISPR基因组中，转录加工成CRISPR RNA(crRNA)，这些crRNA参与反式调控激活crRNA(tracrRNAs)．指导Cas蛋白特异性位点剪切致病 DNAtnl。然而，最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single —guide RNA，sgRNA)[6]。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。
研究表明，Cas9蛋白对靶序列的识别需要的是crRNA中一段种子序列及与靶DNA序列互补的序列(PAM序列)。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non—homologous end ioining)对断裂的 DNA进行修复。如果细胞通过同源重组
机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段新的遗传信息。并且可通过设计不同crRNA，使得CRISPR—Cas系统能剪切不同的DNA序列[7-9]。
CRISPR—Cas系统可以通过共转染表达Cas9蛋白及 crRNA的质粒带人到任意人类细胞中。另外，这种RNA引导的DNA内切酶具有复杂的基因干扰能力。还可以定向整合到IPS细胞中。Cas9内切酶还可以转换成其他内切酶，能对DNA修复机制进行更多的调控。但是还需要更多的研究来证明这种系统的工作能力及潜在的脱靶影响．尤其是在复杂的基因组中，CRISPR —Cas系统是否具有识别特异性单一位点的能力。
CRISPR 系统如何避免自身免疫的发生
在研究 CRISPR/Cas 系统的过程中有一个很重要的问题．宿主菌利用 crRNA 与靶序列配对结合介导外源 DNA 切割，而 crRNA 本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的 pre-crRNA 经加工后形成的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中，那么 CRISPR/Cas 系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开．最近表皮葡萄球菌里的一项研究发现了CRISPR 系统区分靶点和自身基因组的方法．在表皮葡萄球菌里面成熟的 crRNA 除了 spacer 以外在其 5' 端和 3' 端包含有部分 repeat 序列[10]。当外源 DNA 入侵宿主菌时，crRNA 扫描到外源 DNA 上的靶序列(protopacer)并与之配对结合，但靶位点两端的序列不能发生配对，对于宿主菌基因组中相同序列的“protospacer”来说， crRNA 除了能与“protospacer”配对外，两端的 repeat 序列也能与“ protospacer”两侧的基因组 DNA 完全配对，实际上只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性，通过这样的机制 CRISPR/Cas 系统避免自我免疫[54]．另外，在研究稻白叶枯黄杆菌中的 CRRISP/Cas 系统时发现，虽然在宿主菌的 CRISPR 中的 spacer 序列能够与噬菌体 Xop411 一段靶序列完全配对，但宿主菌对噬菌体 Xop411 依旧不抵抗，分析发现是噬菌体 protospacer 临近的 PAM (proto-spacer adjacent motifs)突变引起，这说明外源DNA 的protospacer 序列临近的PAM 对CRISPR/Cas 系统识别外源 DNA 的必要性[53]．宿主菌的 CRISPR 基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在 PAM，这也是 CRISPR 系统能够区分自身 DNA 和外源 DNA 避免发生自身免疫的原因之一．
2 CRISPR—Cas技术应用
2．1在细胞水平上的应用
从实际应用的角度来看，CRISPR—Cas系统比TALENs更容易操作．因为每一对TALENs 都需要重新合成。而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。其中2型CRISPR—Cas系统(RNA介导的 Cas9系统)由于其简便性而应用得更多。Cho等。研究发现。对化脓性
链球菌编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的长约20 bp的双RNA复合体或者sgRNA就可以对人体基因组进行定点切割和改造。这套Cas9系统能在多种人体细胞包括诱导多能干细胞预定的DNA位点进行基因组双链DNA切割，并存在后续的修复现象，成功率高达38％，并且Cas9内切酶对细胞几乎没有毒性并能以非常高的效率对普通的基因组位点进行定向基因替换的操作。Jinek 等发现这套RNA介导的Cas9系统还能够在人体细胞内诱发位点特异性的基因组修饰行为，而且Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的行为是这套位点特异性的基因组修饰过程中的限速步骤。麻省理工学院张峰的研究团队利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对哺乳动物基因组上两个基因进行编辑等利用TALENs和CRISPRs 对细胞基因组同一基因进行修饰，效率分别为0％～34％和51％～79％，并且后者还较容易生成纯合子突变克隆(总克隆的7％～25％)[11]。
2．2在生物体水平上的应用
CRISPR—Cas系统除了能应用在细胞学研究上外，研究者发现Cas9系统还可以对生物体进行基因组改造的操作。2013年1月，洛克菲勒大学的研究者利用 CRISPR—Cas系统将设计好的DNA模板替换相应基因来达到基因的定向修饰120]。他们用这种方法对肺炎链球菌和大肠杆菌进行基因突变，发现100％的肺炎链球菌和65％的大肠杆菌带有突变，证实了这种方法可以用于细菌的基因组修饰。借助这一技术可以对各种微生物进行遗传学改造．打造出符合人类需要的工程微生物．使其造福人类，在生物能源或生物制药等诸多领域具有极大的应用潜力。同时马萨诸塞州综合医院的研究者利用人工合成的sgRNAs指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰，并证明取得与ZFN一样的修饰效果。他们将编码Cas9蛋白的mRNA 和特定的向导RNA(与斑马鱼基因组DNA的匹配机率高达24％．59％)注射到斑马鱼胚胎内，结果取得了成功，在所有被注射的斑马鱼胚胎内，10个切割位点中有8个位点都发生了切割，并且引入了插入或者缺失突变n。我国学者利用该技术也取得了突出成果，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞的研究团队利用 CRISPR—Cas系统定点突变了水稻和小麦两个作物的 0s肋S和姗D等5个基因。原生质体中基因突变效率为14．5％～38％，水稻转基因植物中突变效率为4％～9．4％，并且在T0代获得了水稻纯合pds突变体，呈现预期的白化和矮小表型。同时，通过同源重组DNA修复途径，利用单链寡核苷酸DNA(ssDNA)作为模板，在基因特定位点精确插入12 bp两个限制性内切酶识别序列。该研究首次证实CRISPR—Cas 系统能够用于植物的基因组编辑[11]。
2．3人工构建 CRISPR/Cas9 的方法以及突变效率的检测
ZFN 和 TALEN 对靶点的识别主要依赖于 DNA 结合蛋白对核酸的识别．ZFN 中一个锌指蛋白(结构单元)识别三个碱基序列，而 TALEN 的一个 RVD 识别一个碱基，为了保证特异性，通常靶点长度在 10bp 以上。因此，在构建 ZFN 或是 TALEN 时需要根据靶点的序列来将锌指蛋白单元或是 RVD 排列组合起来，操作繁琐、制备周期长、需要耗费大量的劳动和费用[12]。
CRISPR/Cas9 系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换 20～30 bp 的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于 ZFN 和 TALEN 更加简单、快捷，适合规模化、高通量的组装[12]。
ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 打靶基因后引入突变的方式基本一致，都是 NHEJ 或是 HR．在CRISPR/Cas9 的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照 ZFN 和 TALEN 方法。主要包括：靶位点直接 PCR 后 TA 克隆测序、限制性内切酶法和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法。
3.结语与展望
从 CRISPR 发现至今 25 年已经过去了， CRISPR 的功能逐步被解密。CRISPR 作为细菌和古细菌的一种免疫系统与哺乳动物后天免疫系统有类似之处，不同的是 CRISPR 的免疫记忆能够遗传给后代。获得免疫能力的细菌或是古细菌能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，非常完美地验证了拉马克的获得性遗传理论。除了免疫能力以外，最新的研究发现致病菌的 CRISPR 还可以通过调节内源基因表达帮助它躲避宿主的免疫系统同时增强其毒力。越来越多的研究表明 CRISPR 还可能有更多其他的功能，它作为一种保护装置能够帮助细菌和古细菌更好地适应外界不断变化的环境压力[12]。
CRISPR/Cas9 作为最简单的 Type Ⅱ CRISPR 系统被成功地改造成为类似于 ZFN 和TALEN 的 ENN。相对于 ZFN 和 TALEN 它的优势主要体现在其构建更加方便简单．不同的物种、不同的细胞或是不同的靶点对于同一种 ENN 效率都有很大差异，很难轻易下结论哪种ENN 对基因组的编辑效率会更高．CRISPR/Cas9 独特之处是既可以作为双链的内切酶也可被改造成为切口酶，另外靶点的唯一限制是 3' 端必须有 PAM 序列(NGG)，所以它的靶点在基因中出现的频率远高于 TALEN 和 ZFN． CRISPR/Cas9 的主要缺点可能是它的脱靶效应，它对靶点的识别取决 14 bp 序列(PAM 和它 3' 端的 11 bp)，这种长度的序列在基因组中很容易重复出现[2]。
CRISPR/Cas9 作为第三代人工核酸酶成为目前研究的热点，相对于 ZFN 和 TALEN 有其独特的优势：a．构建简单方便快捷，适用于任何分子生物实验室；b．用于基因组的点突变编
辑优于 ZFN 或 TALEN；c．CRISPR/Cas9 精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高于 ZFN 或TZLEN．可以预见，CRISPR/Cas9 在基础理论研究、临床治疗和农牧渔业等领域必将有越来越有广阔的应用前景，并且产生深远的影响[2]。
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Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2015, 5, 32-41 Published Online July 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/ac317525.html,/journal/hjbm https://www.doczj.com/doc/ac317525.html,/10.12677/hjbm.2015.53005 Methods, Principles and Application of Gene Editing Yuchang Zhu1, Xiaojiang Zheng1, Yibing Hu2* 1School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 2College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing Jiangsu Email: *huyb@https://www.doczj.com/doc/ac317525.html, Received: Jul. 1st, 2015; accepted: Jul. 24th, 2015; published: Jul. 27th, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/ac317525.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Fast development of gene editing technologies provides more powerful tools for gene function analysis. Now researchers can easily manipulate targeted gene with the Zinc Finger Nuclease (FZN), Transcription Activation Like Effector Nuclease (TALEN) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins (CRISPR) technologies emerged in the last dec-ade. These technologies revolutionized gene functional analysis and medical treatment. In this re-view, several typical gene editing technologies were listed, and their principles, characteristics and application were discussed. Keywords Gene Editing, Methods, Principles, Application 基因编辑技术的方法、原理及应用 朱玉昌1，郑小江1，胡一兵2* 1湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 2南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 Email: *huyb@https://www.doczj.com/doc/ac317525.html, 收稿日期：2015年7月1日；录用日期：2015年7月24日；发布日期：2015年7月27日 *通讯作者。
基因编辑技术一、概念 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。 二、应用 1.在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时 间和经费； 2.在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的 要求，如改良水稻等粮食作物； 3.在医疗领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发 病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的 目的等。 三、作用机理 基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。 注： 非同源末端连接（Non-homologous End Joining-NHEJ)是细胞在不依赖同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂（Breaks)的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA 断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。
同源重组（HR）修复即双链DNA中的一条链发生损伤，在DNA 进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板，不能合成互补的DNA 链，所以产生缺口，而从原来DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代DNA的这种修复现象。 四、类别 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。 1.ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA 2.TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切 区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域 3.CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责 DNA的剪切 四、传统技术的优缺点 1.ZFN?的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某 些特定的序列来设计ZFN实现靶基因的修饰，但也有其发展的 局限性，ZFN?的识别结构域中存在上下文依赖效应，使得?ZFN 设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序 列均可设计出满足要求的?ZFN，也无法实现在每一个基因或其 他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的?ZFN作用位点，并 且在已经成功运用的?ZFN的报道中，大多数研究者并不公布 其?ZF?序列。所以，在?ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术
职业生涯规划书 院系：人文与艺术学院 班级：14编辑出版学 姓名：曹嵩 学号：2014103363 一序言 伟大领袖毛泽东曾说过：精通的目的全在于应用.进入大学已经接近一年的时间了，在大学校园中我学到了很多的知识，并且在学习专业知识和基础知识的同时，我也注意培养自己的综合能力，同时积极关注行业资讯，为将来的工作就业做好准备。通过一段时间来自己的了解和与老师们的交流，我渐渐的对于本专业的就业和求职方向有了一定的了解。 然而由于没有完整科学的分析和计划，我对于自己未来职业的认知仍然知识停留在表层。只知道将来或许会从事哪一方面的职业，会有哪些性质的工作。并没有深入的去了解具体要从事什么职业，要掌握哪些具体的技和专业知识外的综合技能。 通过本学期所学习的《大学生职业生涯规划》这一门课程，我学习带了如何运用科学的方式来对自己的未来职业进行分析和规划。对于求职和就业有了更多的了解。经过课堂学习和课后的认知，我对自己的职业兴趣和目前的就业环境进行了分析，再综合各方面的因素后，我制定出自己的职业生涯规划，对于看似遥远实则很快将会到来的职业生涯提前计划准备，为自己毕业后顺利的找到自己满意合适的工作铺好道路。 二认识自我-展现自我 我出生在一个普通的家庭中，家庭条件一般。虽然生活在尽管不富裕却很和睦的大家庭里，但我一直感觉被家里人的爱包围下很幸福的长大的。对于父母的辛苦我一直身怀愧疚和感激的，他们是我好好学习的资本和无限动力，想要学有所成让他们以我为豪，好好工作给他们安逸的生活。 家庭从小就给了我文化熏陶，很小的时候家人就开始培养我阅读的习惯，鼓励我广泛的读书，我也逐渐的开始喜欢读书这件事情，对于阅读充满了兴趣。 由于从小开始对于阅读的喜爱，我在之后的学习生涯中，始终偏爱文科类的学科，在高中时也选择了文科作为将来的学习方向。平时在学习的过程中我也非常关注当下的畅销书和流行文化，对于文化行业始终保持着关注和热情。 高中时我选择了就读文史类学科，但忙于高中学习且受到当时的限制所以并没有针对具体的专业进行准备，但因为平时喜欢看小说和各类文学作品，广泛的阅读让我认知了很多的事物，所以我已经决定要从事文化传媒行业，理想将来的职业有作家，编辑，记者等等典型的文科职业。 高考后我经过报考这一阶段，对于专业的划分和学习内容有了初步的了解。在综合考量后我最终选择了就读编辑出版学这一专业。我选择这一门专业最初基本是根据自己的兴趣而做出的选择，并没有很多的考虑自己和行业的状况。现在当我通过科学的分析方法对自我进行了仔细分析。 自我分析 1、性格方面：我的性格虽然谈不上外向活泼，也算乐观开朗。在人际交往中能够从容的和陌生人进行交流，虽然并不能很快的与人打成一片，但是却能做到良好的沟通。虽然平
论文周记手册 第一周（3.21—3.25）：查阅资料，确定论文选题，翻译专业的英文资料。 时光荏苒，转眼大学生活已经接近尾声，即将面对的是大学生活中的最后一张答卷了既毕业论文的写作，这周主要是要决定好毕业论文的选题，经过仔细的斟酌考虑，我最终确定毕业论文的选题为《河北省上市公司盈利质量实证分析》。围绕这一主题，列出了几个相关的题目备用，然后充分利用学校图书馆、期刊、杂志、网络等资源，参考了大量的时事，了解这些题目目前的理论研究现状，尽力搜集相关资料并做初步筛选。对于筛选后所选取的资料将进行反复阅读并理解，遇到复杂难懂或个人能力无法解决的问题及时与导师联系，取得帮助。在阅读了大量的资料后，我了解到盈利质量是上市公司十分关注的问题，盈利质量的高低直接影响这企业的发展，通过选取评价指标，运用赫尔利的评价方法对河北省上市公司盈利质量进行合理分析。以上是本周工作，下周将会根据所选的题目进行资料的搜集整理工作。 第二周（3.28—4.1）：整理调研资料。 这周的工作主要是对上周所选的论文题目进行资料收集工作。所需资料的获取途径主要是通过图书馆文献查询和网络资源的搜集，利用学校图书馆的网络资源，搜集与论文题目相关的材料及期刊文章等，并针对论文进行相关的记录及摘抄，另外，在中国知网当中，也搜集到了大量与论文题目相关的文章期刊等，在对这些文章进行了大量的阅读分析之后，大致总结出了自己的论文应该从哪些方面着手，分析并列出文章的基本结构、重点、难点和主要研究问题，同时在一些财务专用网站上找到了部分与论文相关的资料及文献。搜集之后对这些材料进行了认真的整理，并且以涉及的内容不同为标准进行了分类，以便在日后的论文写作过程予以参考，以上是本周工作，下周主要将精力放在开题报告的撰写上。 第三周（4.4—4.8）：与教师确定论文提纲，撰写开题报告。 在上周收集、整理完相关资料后，这周的主要任务就是开始撰写开题报告。虽然查阅了大量的资料，但是要把这些资料完美的融入到自己的论文当中还是具有一定的难度的。在解决这一问题时，我把搜集到的资料又认真的阅读了一遍，并做了仔细的批注，经过了反复的琢磨修改后，终于形成了大致的论文框架结构，关于开题报告当中的选题意义和目的这一方面，经过了大量资料的搜集，阅读和初步整合，我深刻的了解到制定一套科学合理的盈利质量指标的重要性。在阅读大量资料后，结合自己的观点归纳总结的，对于文献综述这部分，在大量的资料基础上，挑选出从盈利的真实性、收现性、持续稳定性和增长性四个方面指标，对河北省上市公司2010年相关指标进行描述分析，以提出评价盈利质量的科学方法，提高投资者的投资决策水平。本周的工作就是对收集的资料进行梳理和撰写开题报告，下周以开题报告为基础写出论文大纲。 第四周（4.11—4.15）：实施设计或撰写论文初稿。 在写完开题报告后，本周的主要任务是对论文提纲进行细致的补充和修改，论文的提纲对于论文的写作极具指导意义，因为一个优秀的提纲能够体现出一篇论文的基本逻辑框架，在具体的写作过程中能够使论文的条理更加清晰，不至于写作过程中发生逻辑的混乱。我按照一般论文的基本结构，将整篇文章大体分为三部分，既概念的解读，方法的介绍，方法的使用。论文主要从以下几个部分对该问题进行简要的论述：1.引言；2.盈利质量概念的解读，根据各学者对盈利质量的理解，总结盈利质量的概念；3.对选取的沃尔评价法与主成分分析方原理、方法的介绍；4.对所选盈利指标类型的介绍，及对河北省上市公司样本数据的处理； 5.分别就沃尔评分法和主成分分析法对河北省上市公司盈利质量进行分析，再将两种方法的
基因编辑技术最新进展 人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。这些手段在治疗严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich综合征方面获得了成功。尽管如此，RNAi 技术在应用的广泛性上还存在局限。 基因编辑技术（genome editing technologies）是针对DNA本身进行的操作手段。最近应用型基因编辑领域的"鼻祖"，美国麻省理工学院张锋教授等人发表在《Nature Medicine》杂志上的一篇综述详细介绍了这些技术的原理以及在临床上的应用前景。 基因编辑技术的基本原理
归巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四种核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。根据其识别方式的不同可以分为：蛋白质与DNA的识别与切割，包括归巢酶，ZFN，TALEN； RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割，即CRISPR/cas9。在特异性方面，归巢酶具有一个较大的DNA识别结构域，此结构同时负责DNA的切割；ZFN与TALEN是由多个酶亚基组成的复合体，分别具有特异性识别DNA的能力与 DNA内切活性。在应用方面，归巢酶及ZFN需要通过人工突变的方式构造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN则需要复杂的分子克隆达到此目的。与之不同，在CRISPR/cas9系统中，可以通过简单的sgRNA的变化达到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB）的结果并引起生物体的主动修复。NHDJ修复以另外一条未被切割的DNA链为模板，从而保证修复结果的准确。在反复不断地断裂-修复过程中，容易在切割位点造成插入或缺失突变，这样就达到了造成基因紊乱的目的。另外，研究人员利用HDR的修复机制可以人为制造想要得到的突变结果，从而达到基因修复的效果。 基因编辑疗法简介 基因编辑在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。对于突变引起的有害基因的活化，可以通过简单的沉默或敲除的方式达到治疗的目的，如亨廷顿氏舞蹈症（一种显性突变引起的家族性遗传病），但是对于突变引起的正常基因的失活，则需要通过HDR的方式对目的序列进行编辑，使其恢复到原有的健康状态，如泰萨氏病（一种隐性基因突变引起的遗传性疾病）。 基因编辑的效率 基因编辑的效率受到编辑方式，细胞类型，位点序列等多个因素的影响。总体上来讲，NHEJ要比HDR效率更高。对于我们更关心的HDR方式，主要受到4个因素的影响：1，修饰的本质，如改变的序列幅度；2，其识别特异性的干扰，如
前言 转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技术与锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具，这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂（DNA double-strand break）来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。 成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR）技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与其它基因组编辑工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。 本文将以上述三种技术为例，介绍并探讨新一代位点特异性基因组工程技术的生物学原理、未来发展趋势，及其在遗传学研究领域的作用和潜在的医学应用前景。 一、TALEN技术 TAL效应因子（TAL effector, TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE 通过细菌 III类分泌系统（bacterial type III secretion system）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。 近年来， TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。2011年《自然·方法》（Nature Methods）将其列为年度技术，而2012年的《科学》（Science）则将TALEN技术列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。 1. TALEN结构及技术原理 1.1 TALEN的典型结构 如前文所述，典型的 TALEN由一个包含核定位信号（Nuclear localization signal, NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定 DNA序列的典型串联TALE 重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。不同类型的TALEN元件识别的特异性DNA 序列长度有很大区别。一般来说，天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17-18bp；而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度则一般为14-20bp。
同济大学本科生毕业设计(论文) 工作的若干规定 （同教[2007]20号） 为了进一步规范我校毕业设计（论文）工作，全面提高毕业设计（论文）质量，特制定本规定。 一、毕业设计（论文）目的与要求 毕业设计（论文）教学目的是培养学生具备综合运用所学的基础理论、专业知识和基本技能，分析与解决实际问题的能力；使学生得到从事实际工作所必需的基本训练和进行科学研究工作的初步能力。毕业设计（论文）作为培养学生创新精神和实践能力的一次较为系统的训练，应注重以下几方面能力的培养： 1．调查研究、查阅和应用中外文献及采撷网络信息的能力； 2．理论分析、制定设计或试验方案的能力； 3．设计、计算及制图的能力； 4．实验研究及数据处理的能力； 5．综合分析、凝练创新、编制设计说明书或撰写论文、调研报告的能力； 6．外语、计算机应用的能力。 二、毕业设计（论文）选题原则 选题恰当是做好毕业设计（论文）的前提，指导教师在选择毕业设计（论文）课题时应遵循以下原则： 1．课题的选择应符合专业培养目标，达到毕业设计（论文）教学大纲的基本要求。 2．课题的选择应体现教学与生产、科研、文化和经济发展相结合的原则，即选题在符合毕业设计（论文）教学要求的前提下，应尽量结合生产实际、科学研究、现代文化、经济建设的任务进行，以利于增强学生面对实际的意识，培养学生严谨的科学态度和一丝不苟的工作精神，调动学生的积极性，增强责任感和紧迫感。 3．课题的选择应贯彻因材施教的原则，使学生的特长或潜能有更好的发挥，并鼓励学生有所创新。 4．选题的范围和深度应符合学生的实际情况，并尽可能多地反映现代科学技术发展水平。提倡不同专业（学科）互相结合，扩大专业面，开阔学生视野，实现学科之间的互相渗透。 5．毕业设计（论文）按不同学科类型分别有所侧重： （1）工科类专业毕业设计（论文）结合工程实践性课题的比例应不低于70%，首先应保证基本工程训练，在此基础上做一些提高性的、拓展性的专题研究； （2）理科类专业毕业设计（论文）要结合当前的科技发展，让学生走向学科前沿，论文要有一定的学术水平； （3）经管、人文、法学、外语、艺术类专业毕业论文（设计）要有新颖性，要结合社会、经济、文化发展中的现实问题、让学生接触社会，论文要有一定的新意或创见。 6．毕业设计（论文）课题应遵循“一人一题”的原则。课题经院（系）领导审定后，学生可在教师指导下，采取自选与分配相结合的办法，确定毕业设计（论文）课题。可以几名学生共同完成一个大课题，但必须做到分工明确，工作量适当，并根据各自独立完成的任务，给出课题名称或分别在原课题名称后加副标题以示区别。学生除了在导师提出的课题中选择毕业设计（论文）课题外，也可以根据专业特点选择自己感兴趣的题目作为毕业设计（论文）课题，但必须经指导教师审定。 三、审题工作程序及要求
南京师范大学 毕业设计（论文） （ 2012 届） 题目：论****** 学院： ****学院 专业： **** 姓名： *** 学号： ***** 指导教师： **** 南京师范大学教务处制
目录（黑体、小四。目录中的正文采用左右分散对齐，标题中间与页码间以……联结。） 1 导论（章、黑体、小四。标题号与标题间不加点、空一格。） (1) 2 企业内部信息流的内涵与形态 (1) 2.1 企业内部信息流的内涵 (1) 2.2 企业内部信息流的形态（节、二级标题、宋体、小四、退一字。标题号间用圆点） (1) 2.2.1 正式信息流（小节、三级标题、宋小四、再退一字。标题号间用圆点）1 2.2.2 企业非正式信息流 (2) ……（四级以下标题可按 A.B.C.和 a.b.c.顺序设两层，但一般不列入目录。）………………………（所有标题末尾均不加标点符号。）…………………………………… 3 企业内部信息流的基本特征 (2) …… …… 7 加强企业内部信息流管理 (9) 7.4 以信息素质培养为手段，加强信息质量基础 (10) 8 结论 (10) 谢辞 (10) 参考文献 (10) （结论、谢辞、参考文献依上例中的顺序设立。）
1 导论 （一级标题、黑体、三号、顶格。标题号与标题间不加点、空一格。标题与正文间空一行。正文与下一标题间也空一行。） 随着现代信息技术的高速发展,企业…… （正文、宋体、小四号。西文字母用Times New Roman。首行缩进两字。正文选择格式段落为：最小值，15磅，段前、段后均为0行。） （注意不加页眉、页脚。） 2 企业内部信息流的内涵与形态 2.1 企业内部信息流的内涵 （二级标题、黑体、小三号、顶格。标题号间加圆点。不同级次标题相连时不另空行。） 信息在企业内部总是流动着的,…… 2.2 企业内部信息流的形态 2.2.1 企业正式信息流 （三级标题、黑体、小三号、顶格。标题号间加圆点，标题末尾不加标点。不同级次标题相连时不另空行。） 企业正式信息流是指企业为达到一定的目的、…… [1] 垂直信息流（正文中非标题分项采用［1］、［2］、［3］…单独序号，对分项中的小项采用①、②、③…的序号或数字加半括号，括号后不再加其他标点。）垂直信息流是指…… [2] 水平信息流 水平信息流是指…… 2.2.2 企业非正式信息流 毕业论文的公式、图与表的要求： 1、公式号以章分组编号，如（2–4）表示第2章的第4个公式。 2、公式应尽量采用公式编辑应用程序编入，选择默认格式，公式号右对齐，公式调整至基本居中。 3、图与表也以章分组编号，如图3–5表示第3章的第5幅图。 4、图与表应有相应的名称，如“实验系统流程示意图”等。 5、图与表应设置在文章中首次提到处附近。
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN ——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内切酶是否可以应用于基因编辑技术，韩春雨团队发表文章，利用NgAgo蛋白实现了格DNA引导的基因组编辑，但其实验结果目前依然存在争议。
本科毕业设计（论文、创作） 题目：(三号黑体，居中，一行不超过18个汉字） (论文题目可分两行书写) 作者姓名黑体三号，加粗，居中 指导教师导师姓名及职称 专业班级电子信息工程0901 学院信息工程学院 提交日期20xx年x月x日
Dissertation Submitted to Zhejiang University of Technology for the Degree of Bachelor Dissertation Title (Times New Roman, Bold, Centered, Multi-lines allowed) College of Information Engineering Zhejiang University of Technology June 20xx
浙江工业大学 本科生毕业设计(论文、创作)诚信承诺书 本人慎重承诺和声明： 1. 本人在毕业设计（论文、创作）撰写过程中，严格遵守学校有关规定，恪守学术规范，所呈交的毕业设计（论文、创作）是在指导教师指导下独立完成的； 2. 毕业设计（论文、创作）中无抄袭、剽窃或不正当引用他人学术观点、思想和学术成果，无虚构、篡改试验结果、统计资料、伪造数据和运算程序等情况； 3. 若有违反学术纪律的行为，本人愿意承担一切责任，并接受学校按有关规定给予的处理。 学生（签名）： 年月日
本科毕业设计的任务书（用盖过红章的任务书替换）
摘要 简单介绍研究背景和目的。本文的主要工作和成果如：针对…采用…，提出了…，效果如何（得到什么研究结论）； 300-500字左右；摘要应简明扼要，表达毕业设计论文的主要工作与取得的成果，体现设计与研究工作的核心思想。 最后，对全文进行总结，简短说明工作的不足之处，并对进一步的设计与研究提出一些建议。 关键词：关键词数量为4－6个，每一关键词之间用逗号分开，最后一个关键词不用标点符号
生物学研究最具影响力技术：“基因编辑技术”大盘点 2014年10月29日，Nature杂志上发布了名为”Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”的研究论文，据悉，该文章发布了一种超越CRISPR 的基因组编辑新技术，而CRISPR技术在今年被《Nature Methods》评为在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术之一。 新方法不需要内切酶在特异位点剪切DNA，也不需要使用启动子，大大降低了新基因自身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。该技术使用一种常用的病毒——改良的腺相关病毒（AAV）。改良的病毒载体中，所有的病毒基因被删除，只保留了治疗基因。再利用同源重组，将目标基因插入，达到基因编辑的目的。 在了解这项新技术有点之后，有必要了解什么是基因编辑技术及基因编辑的三大利器：ZFN（锌指核酸酶）、TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复技术）。 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物；在医辽领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。因此，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA 结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 基因编辑技术优缺点： 1）ZFN 的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计
毕业总结论文格式 毕业总结 一、构成项目 1、构成项目 本科毕业论文包括以下内容(按顺序)封面、内容提要与关键词、目录、正文、注释、附录、参考文献、封底。其中“注释”与“附录”视具体情况安排，其余为必备项目。如果需要， 可以在正文前加“引言”，在参考文献后加“后记”。 2、各项目含义 封面封面由文头、论文标题、作者、院系、专业、年级、学号、指导教师、答辩日期、等内容组成。(具体见封面格式) 内容提要与关键词内容提要是对论文内容的概括性描述，应忠实于原文，字数控制在2—3字之间。关键词是从论文标题、内容提要或正文中提取的、能表现论文主题的、具有实质意义的词语，通常不超过7个。 目录列出论文正文的一、二级标题名称及对应页码，附录、参考文献、后记等的对应页码。 正文正文是论文的主体部分，通常由绪论(引论)、本论、结论三部分组成。这三部分在 行文上可以不明确标示。正文的各个章节或部分应以若干层级标题来标识。正文字数以6 —8 字为宜。 注释对所创造的名词术语的解释或对引文出处的说明。注释采用脚注形式。 附录附属于正文、对正文起补充说明作用的信息材料，可以是文字、表格、图形、图像等形式。 参考文献作者在写作过程中使用过的文章、著作名录。 二、毕业论文格式编排 1、纸型及页边距
毕业论文一律用国际标准a4型纸(297mmx21mm)打印。页面分图文区与白边区两部分，所有的文字、图形、其他符号只能出现在图文区内。页边距上、下、左、右均为5厘米，装 订线为厘米，统一采用5倍行间距编排。 2、版式与用字 文字图形一律从左至右横写横排。文字一律通栏编辑，使用规范的简化汉字。除非必要，不使用繁体字。忌用异体字、复合字及其他不规范的汉字。 3、论文各部分的编排式样及字体字号 文头封面顶部居中，4号宋体加粗，上下各空一行。固定内容为“中央广播电视大学人才 培养模式改革和开放教育试点会计学专业毕业论文”。 论文标题2号黑体加粗，文头下居中，上下各空两行。 论文副标题小2号黑体加粗，紧挨正标题下居中，文字前加破折号。 作者、学校、专业、年级、学号、指导教师、答辩日期、成绩等项目名称用3号黑体， 内容用3号楷体，在正副标题下居中依次排列，各占一行。成绩一栏内容留空，由论文答辩 机构手写。 中文内容提要及关键词排在封二或另起页，标题3号黑体，顶部居中，上下各空一行;内 容用5号宋体，每段起首空两格，回行顶格。关键词三个字用4号黑体，内容用5号黑体;关键词通常不超过3-5个，词间空一格。 目录另起页，项目名称用3号黑体，顶部居中;内容用小4号仿宋。 正文文字另起页，论文标题用3号黑体，顶部居中排列，上下各空一行;正文文字一般用 小4号宋体，每段起首空两格，回行顶格，单倍行距。 正文文中标题 一级标题。标题序号为“一、”，4号黑体，独占行，末尾不加标点; 二级标题，标题序号为“(一)”，与正文字体字号相同，独占行，末尾不加标点; 三级以下标题，三、四、五级标题序号分别为“”、“(1)”和“①”，与正文字体字号相同，可根据标题的长短确定是否独占行若独占行，则末尾不使用标点，否则，标题后必须加句号。每级标题的下一级标题应各自连续编号。
基因编辑技术简介-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA 序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI 形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内
比较基因编辑技术（NgAgo-gDNA）和（CRISPR-Cas9）的原理，并阐述二者在分子遗传学中的应用或前景 CRISPR-Cas系统[Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)& CRISPR-associated genes (Cas) ]：一个有效的CＲISPＲ/Cas系统包括3个部分: CＲISPＲ位点上游的前导序列，由高度保守的重复序列(repeat)和各不相同的间隔序列(spacer)有规则排列的CＲISPＲ簇及Cas基因。CＲISPＲ位点上游存在一段( A + T) 富集的前导序列，其在CＲISPＲ/Cas系统转录过程中起启动子的作用。CＲISPＲ－Cas系统能够将短序列的外源基因整合到CＲISP Ｒ的2个重复序列中，当有外源基因入侵时，间隔序列转录并加工成非编码ＲNA与特异的Cas蛋白组成复合物，结合并剪切与之匹配的外源基因。Cas9蛋白中含有的结构域，包括核酸内切酶核酸外切酶解旋酶聚合酶和ＲNA结合蛋白，Cas蛋白参与CＲISPＲ的转录加工等过程。 作用机制： （1）新的间隔序列的获取：间隔序列的获取大概分成3个步骤: 对入侵核酸的识别和扫描，寻找潜在的PAM( protospacer adjacent motifs) 序列并通过PAM序列来决定间隔序列前体( protospacer) 的具体位置;通过对入侵核酸中所决定的间隔序列前体的切割产生新的间隔序列; 将间隔序列插入靠近CＲISPＲ引导序列的2个重复序列之间 （2）CＲISPＲ系统的表达：整合后的间隔序列首先被转录为蛋白结合形成CＲISPＲ相关核糖核蛋白复合物( CＲISPＲ－associated ribonucleo protein complexes) ，通过扫描外源基因的PAM序列，crＲNA与外源基因的相应靶位碱基互补配对结合，最后复合物所含的核酸酶将外源DNA降解。 （3）基因的敲除或敲入：CＲISPＲ/Cas系统对外源基因的切割和降解，需要crＲNA和tracrＲNA 介导tracrＲNA 的5'端序列和crＲNA的3'端保守序列通过碱基互补配对形成一个杂交的分子，这个杂交的分子通过其特殊的空间结构和Cas9相互结合形成一个蛋白－ＲNA复合物，该复合物通过crＲNA的5' 端特异性的20个碱基与靶标基因相结合，从而指引Cas9的2个内切酶活性中心切断双链的DNA，造成双链断裂。
毕业论文设计论文题目：浅析网络文学 学生姓名：xxxx 专业：汉语言文学 班级：xxx秋季班 指导老师：xxxxxx 时间：二零xx年六月二十五日
浅析网络文学 无论人们对于"网络文学"还会产生多少争议，这个概念终于站稳了脚跟。现今已经没有多少人否认网络文学的存在。尽管"网络文学"的完善定义有待于理论的进一步修补，但是，文学进驻网络空间并且成为一个活跃的臣民，这已经是不争的事实。其实，许多人的目光正在越过这个事实向后延伸：网络为文学制造了哪些强有力的冲击？换言之，因为网络文学的出现，传统文学正在或者即将发生哪些深刻的改变？ 蔡智恒、安妮宝贝、李寻欢、宁财神、邢育森这些网络作家的名字渐为人知，网易公司与文学网站"榕树下"的文学评奖均己落下帷幕。检阅过"榕树下"网站的得奖作品之后，资深作家陈村慷慨地赠言网络文学："前途无量"。他在"网络之星"丛书的序言之中说："有人一口否定网上的文学作品都是垃圾，那是精神错乱，我们应该怜悯他。有人说网上的作品才是文学，那是理想，我们要努力。"显而易见，陈村所青睐的是"网络的原创文学"――即仅仅在网络空间写作和发表的作品。 由于文学爱好者的录入或者网站招徕用户的点击，网络空间存有大量业己出版的世界文学经典或者风靡一时的流行之作。对于这一部分文学而言，网络仅仅是一种征集读者的新型传播媒介。栖息于网络空间的文学不过是纸张文学的电子复制。这一部分文学并没有因为网络而改头换面，甚至提出新的美学设想。相形之下，"网络的原创文学"可能包含了某种前所未有的文学类型。在这一批文学那里，网络不再是计算机屏幕对于书籍纸张的替代；网络的特征介入文学生产――从遣词造句到发行传播――的全过程。伊格尔顿曾经提议考察艺术的"生产工具"。对于文学说来，书写工具很大程度地决定了文学生产与文学消费之间的互动关系。从龟甲、钟鼎、竹简、缣帛到纸张，新型的文学生产资料不断地改变书写者与阅读者的范围。这不仅派生出种种特殊的文体，同时还不断地重建文学社会学。如同人们的历史考察所发现的那样，书写工具的日益廉价导致了持续的文化民主。书写工具摆脱了权贵阶层的政治、经济垄断之后，文化归还了大众。大众的通俗语言赢得了文字的记载，甚至赢得了刊印的权利。这不是一个简单的文化事件；这时常还意味了某些发不出声音的匿名阶层开始浮出文化地平线。某种意义上可以说，文化生产工具以及文化传播体系的改变时常是缔造一个新型社会的重要条件。根据安德森的观点，印刷技术的发明对于资本主义社会产生了巨大的作用――安德森称之为"印刷资本主义"。他概括说："资本主义和印刷技术通过作用于人类语言的不可避免的多样性的命运，使一种新形式的想象的共同体成为可能，这种共同体的基本形态为现代民族的产生创造了条件。" 现今，一些人将网络空间形容为“后纸张”时代的书写与传播工具。愈来愈多的人意识到，经济、社会民主以及文化形式无不因为网络的介入而产生历史性的转折；对于文学说来，人们逐渐将问题凝聚到这个方面：这一项技术革命是否包含了诱发艺术革命的契机？很少人有胆量预言，网络文学的兴盛丝毫无损于传统文学的既定规范；但是，人们可以从某些不无委婉的表述之中发现传统文学的抵抗。不少传统文学的作家重复申明：文学的本质从未改变，评价文学的尺度始终如一，他们对于网络文学与传统文学一视同仁。余华断言："对于文学说来，无论是网上传播还是平面出版传播，只是传播的方式不同，而不会是文学本质的不同。" "文学的特性将因此――随着作品的发表方式、传播方式和作家成分结构的
1 基本介绍 基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。 而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。 2016年美国间谍首脑发布了一项公开警告，将基因编辑列为潜在的大规模杀伤性武器（WMD）之一。[2] 2 应用技术 这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。 那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？ CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。 3 执行手段 1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。