羟脯氨酸

一种新型优化的肝组织羟脯氨酸含量测定方法的建立

修贺明郭争荣徐铮

【摘要】目的：建立一种可信度、敏感度高，适合于微量组织羟脯氨酸含量的测定方法―胃酶酸解法。方法：在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对胃酶法和传统盐酸水解法进行了比较。结果：在相同条件下，传统方法测得HYP含量为0.045ug/ml－1.547ug/ml，平均0.7789ug/ml；胃酶酸解法测得羟脯氨酸含量为

2.955ug/ml－4.500ug/ml，平均为

3.921ug/ml，两者比较有显著性差异（P＜0.01）。结论：胃酶酸解法的可信度、敏感度均优于传统方法，其更适合于微量组织羟脯氨酸的测定。

关键词：羟脯氨酸胃酶酸解法

【abstract】objective：

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成份之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，被认为是胶原中的特征性氨基酸。因此，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标，寻求一种合理、优化的HYP含量的测定方法已成为众多学者关注的焦点。

目前，人们对传统的HYP含量的测定方法－盐酸水解法已达成了共识，但是传统方法对组织要求量比较大，水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。近年来大批的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究，同时也深入的探讨了不同测定方法，虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进，但对其测定方法的研究欠少，仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究，针对传统方法的缺点对传统方法进行了改进，在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对两种方法进行了比较，探索出一条更为先进、更为稳定可靠的HYP 检测方法。现报道如下：

一，材料及其方法

1，主要实验材料

1.1 羟脯氨酸标准品北京鼎国生物技术发展中心

1.2 酶标仪美国VERSAmax

1.3 微量电子天平瑞士METTLer AE260

1.4 对二氨基苯甲醛天津市博迪化工有限公司

1.5 氯胺－T 天津市精细化工研究所

2，试剂配制

2.1 标准HYP储存液（1mg/ml）：称取100mgHYP标准品，用0.1mol/l盐酸溶解并定容至100ml，

置棕色瓶于4℃保存。

2.2 标准HYP应用液（25ug/ml）：取标准HYP储存液（1mg/ml）2.5ml，双蒸水定容至100ml，4℃保存，可用2－3周。

2.4 0.1mol/l 柠檬酸缓冲液（PH=6.0）：0.3g柠檬酸和

3.25g柠檬酸钠加双蒸水溶解并定容至100ml。

2.4 0.05mol/l氯胺－T溶液：1.41g氯胺－T用少量甲醇溶解并定容至100ml。

2.5 10％对二氨基苯甲醛（PDAB）：10gPDAB用少量甲醇溶解并定容至100ml。

2.6

3.15mol/l高氯酸溶液：70％高氯酸27ml加蒸水至100ml。

2.7 40％NaOH溶液：40gNaOH双蒸水溶解并定容至100ml。

2.8 0.5％胃蛋白酶溶液：0.5g胃蛋白酶加少量0.2mol/l盐酸溶解并定容至100ml。

3，组织样品

本实验组织样品为肝硬化大鼠肝组织（Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供），肝硬化模型用0.03％硫代乙酰胺（TAA）喂饲5月制备[1]，经病理检查证实为肝硬化后用25％硫奔妥钠腹腔麻醉后开腹摘取肝右叶，－80℃保存备用。

4，标准曲线的制备

（1）500ul去离子水作为空白对照，然后500ul标准羟脯氨酸溶液（25ug/ml）做倍比稀释，浓度依次为25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.13ug/ml，1.56ug/ml，0.78ug/ml。

（2）依次加入0.1mol/l的柠檬酸缓冲液（PH6.0）和0.05mol/l氯胺－T溶液，37℃水裕氧化25分钟。

（3）3.15mol/l高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5分钟终止氧化。

（4）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3分钟（显色）。

（5）冰裕冷却，空白凋零，酶标仪测定A560nm

传统方法肝组织羟脯氨酸的测定

（1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。

（2）加入3ml 6mol/l盐酸，混匀，移入15ml的试管，120℃高压水解2小时。

（3）40％的NaOH调PH值到6.0，然后12000转离心15分钟。

（4）取500ul上清加入一新准备的15ml试管中，依次加入0.1mol/l的柠檬酸缓冲液（PH6.0）和0.05mol/l氯胺－T溶液，37℃水裕氧化25分钟。

（5）3.15mol/l高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5分钟终止氧化。

（6）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3分钟（显色）。

（7）冰裕冷却，空白凋零，和准备的标准品一起测定A560nm.

胃酶酸解法肝组织羟脯氨酸的测定

（1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。

（2）加入3ml 0.5％胃蛋白酶溶液，混匀，移入15ml的试管，37℃保温24小时，每隔3－5小时混匀一次，使其充分水解。

（3）加入1ml 6mol/l盐酸，120℃高压水解2小时。

（4）以下步骤同传统方法3－7。

二，结果

1，组织匀浆传统盐酸水解方法在组织匀浆静置1小时后液体出现分离状，沉淀较多；而胃酶酸解法静置后仍呈混悬状态，几乎看不到沉淀.由此可见，胃酶酸解法能够充分水解组织中的胶原，比传统方法水解更加彻底。

2，标准曲线标准曲线如图1 所示。在0～25ug / ml 浓度范围内，随着羟脯氨酸含量的增加，A560nm值也增加,即羟脯氨酸含量和所测得的A560nm 值之间成正向线性关系。

3，从酶标仪测定结果来看，在取相同液量的情况下，传统方法测得HYP含量平均值为

0.7789ug/ml；胃酶酸解法测得HYP含量平均值为3.9321ug/ml，是传统方法的5倍，说明此法比传统方法更加敏感，可信度较高。

4，胃酶酸解法测得HYP含量范围为2.955ug/ml－4.500ug/ml，平均为3.921ug/ml；传统方法测得HYP含量范围为0.045ug/ml－1.547ug/ml，平均0.7789ug/ml，两者比较有显著性差异（t ＝19.127， p＜0.01）。具体结果见表1

表1，两种方法对肝组织HYP含量的测定结果（ug/ml）

编号胃酶酸解法传统盐酸水解法

1 2.955 0.289

2 3.271 0.176

3 3.816 0.045

4 3.961 0.421

5 3.800 1.461

6 3.922 0.747

7 3.947 0.439

8 3.882 0.876

9 3.842 1.442

10 4.082 0.953

11 3.900 1.179

12 4.189 1.547

13 4.460 0.292

14 4.500 0.795

15 4.384 1.021

三，讨论

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）为非必需氨基酸，构成胶原组织主要成份，含量相对稳定，约占胶原氨基酸总量的13％，是衡量组织胶原含量的特异性指标之一，目前可用于HYP含量的测定方法及改良法的报道很多[2-6]，但每种方法之间都存在着这样或那样的不足，如（1）组织需要量大；（2）耗时较长，所以仍需进一步改进。

影响组织胶原测定的主要因素，在试剂，方法学一定的情况下，那么胶原的水解成为影响HYP测定的主要因素，胶原水解的完全与否，由两个主要因素构成（1）机械剪切组织的破碎程度；（2）盐酸水解的时间与温度。前者直接影响着后者，因不同组织的胶原含量不同，耐受剪切力必然不同，即使是相同组织，因病变而发生胶原含量的变化也会使相同的剪切力下破碎程度发生改变，直接影响进一步的水解程度及后续测定HYP的含量的精确性。

因此，我们在胶原水解过程中引入胃蛋白酶，其主要优点（1）价廉；（2）最强的水解酸之一；（3）酸性条件下（PH2.0）作用最强，利于蛋白的酸解；（4）提高水解速率。胃酶将蛋白水解成胨和多肽，为胶原进一步酸解提供了便利条件，加快了水解过程，本实验相同重量的肝组织经机械研磨后加入胃蛋白酶消化液后液体呈混悬状态，更有利于进一步水解。我们在相同条件下对两种方法进行了比较，结果显示胃酶酸解法与传统方法水解相同组织的HYP含量相差5倍，经统计学分析有显著性差异（p＜0.01），说明这种方法更加有应用价值，更能反应真实的胶原中的HYP含量。此法在微量组织胶原测定中的优势更加明显，可使样品处理中的误差率减少，提高HYP检出率。

参考文献：

1，张杰，陈积圣，王坤等.硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法的改进，中华实验外科杂志1999 年11月第16卷第6期

2，周少春，车建途，李定国.大鼠肝组织羟脯氨酸的测定，上海第二医科大学学报, 1997年06期

3，Kivirikko KI，Laitinen O，Prockop DJ.Modification of a specific as say for hydroxyproline in urine.

A nal Biochem 1967.19 :249 - 255

4，Gordeladze JO，Halse J，Dj

5，Matsuda Y, Matsumoto K, Yamada A , et al. Preventive and therapeutic effects in rats of hepatocyte growth factor infusion on liver fibrosis/ cirrhosis. Hepatology ,1997 ,26 :81 - 89

6 ，Pierce RA，Glaug MR，Greco RS ，et al. Increased procollagen mRNA levels in carbon

tetrachloride－induced liver fibrosis in rats. J Biol Chem ,1987 ,262 :1652 - 1558

作者单位

通讯作者

羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法

羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0250 规格：50T/48S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体1mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸和蒸馏水。操作步骤： 一、羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入5mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/LNaOH（约3mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至8mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm， 第1页共3页

乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定——L(-)-羟脯氨酸含量测定法

乳与乳制品中 动物水解蛋白鉴定 乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定 法 —L(-)-羟脯氨酸含量测定 羟脯氨酸含量测定法 1主题内容与适用范围 本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。 本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。 本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。 2 引用标准 ) --羟脯氨酸含量测定 L(--) GB9695.23-90 肉与肉制品L( 3 原理 试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。 4 试剂 所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。 4.1 氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。 将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。 4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。 4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。 4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。 4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。 4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙醇。 4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。 4.7.1 标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。 4.7.2 标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液 5.00mL于500mL容量瓶中,定容。 5 仪器和设备

脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定 在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 待测植物叶片 （二）仪器设备 1. 722型分光光度计； 2.研钵； 3.100ml小烧杯； 4.容量瓶； 5.大试管； 6.普通试管； 7.移液管； 8.注射器； 9.水浴锅； 10.漏斗； 11.漏斗架； 12.滤纸； 13.剪刀。 （三）试剂 1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 3.冰醋酸。 4.甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 （2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶

羟脯氨酸检测试剂盒说明书

货号: QS1907 规格：50管/48样羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 测定原理 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP 含量。 自备实验用品及仪器 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸、高氯酸和蒸馏水。 试剂组成和配制 O（V/V）= 1:1，室温保存。 组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，加入5mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12 小时，12000g，25℃，离心20min，用提取液定容至5mL，取上清待测。 2.细胞：取500万个细胞，加入2mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然 降压后待测。 3.血清等液体：直接测定。 羟脯氨酸含量计算公式 标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991 （1）按组织计算 第1页，共2页

HYP含量（mg/g 鲜重）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷(V样÷V样总×W) 560 -0.0251）÷W = 0.385×（A 560 （2）按细胞计算 HYP含量（mg/104cell）=（A -0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个) 560 -0.0251）÷细胞数量（万个） = 0.154×（A 560 （3）按液体体积计算 HYP含量（mg/mL）=（A -0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样 560 -0.0251） = 0.077×（A 560 V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样品体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样品质量，g 注意事项 1、OD值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。 2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。 3、最低检出限为3.8mg/L。 第2页，共2页

原料中羟脯氨酸含量的测定

原料中羟脯氨酸含量的测定 1.材料和试剂 1.1材料 秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。 1.2试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。 1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L] 量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却至室温后用水定容。 1.2.3缓冲溶液（PH=6.8） 包括下列组分： a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）； b）14.0g氢氧化钠； c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。 用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。 1.2.4氯胺T溶液 称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。临用前配制。 1.2.5显色剂 称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。 1.3羟脯氨酸标准溶液 1.3.1标准储备液 称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。 1.3.2标准工作液 移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分

别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、 1.5μg/mL、 2.0μg/mL。临用前配制。 2.仪器和设备 3.试样制备 用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。用绞肉机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。 4.分析步骤 4.1试样 称取4g试样（精确至0.001g）于烧杯中，避免试样粘在烧杯壁上。 4.2水解 4.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液，加入烧杯中，用培养皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。 4.2.2趁热将水解产物转移至250mL容量瓶中。用10mL硫酸溶液分三次洗涤烧杯，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。然后将其过滤至三角瓶中。 4.3测定 4.3.1用移液管移取5mL的上述滤液至250mL容量瓶中。 4.3.2移取4.00mL上述溶液于比色管中，加入2.00mL氯胺T试剂，混合后于室温下放置20min±1min。 4.3.3加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塞子将比色管封

羟脯氨酸的测定方法

1羟脯氨酸含量测定 2羟脯氨酸标准曲线绘制 3试剂的配制【6-7】 [6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559 [7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546 柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。 0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。 对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。 3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。 羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。 羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。 4标准曲线绘制 分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。 浓度μg/mL0.50 1.00 1.25 1,50 1,75 2.00 2.25 0.612 吸光度A560 0.134 0.284 0.347 0.409 0.477 0.55 6样品水解将样品反复绞碎，充分混合。称取5.000g样品放入250ml三角瓶中，加

羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 微量法

羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0255 规格：100T/96S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，

羟脯氨酸检测试剂盒使用说明

羟脯氨酸检测试剂盒使用说明 微量法货号:BC0255 规格:100T/96S 产品简介： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一补被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP 含量。 产品内容： 组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）=1:1，室温保存； 细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存； 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1.组织：取约0.2g样品于玻璃管，加入2mL的组提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，16000rpm，25℃，离心20min，用提取液定容至2mL，取上清待测。 2.细胞：取约500万个细胞，加入1mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。 二、测定操作：

对照管 测定管样本（uL）60试剂一（uL） 60 60 混匀，室温静置20min 试剂二（uL）6060H 2O（uL） 180 120 混匀，60℃，20min，取出后室温静置15min，测定A 560。(A 560=A 测定-A 对照) 羟脯氨酸含量计算： 用微量比色皿测定的计算公式: 标准曲线：y=64.875x+0.0251，R 2 =0.9991（1）按组织计算 HYP 含量（mg/g）=（A 560-0.0251）÷64.875×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) =0.154×（A 560-0.0251）÷W （3）按细胞计算： HYP 含量（mg/104 cell)=（A 560-0.0251）÷64.875×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万个） =0.077×（A 560-0.0251）÷细胞数量（万个） V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：反应中样本体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积，mL；W：样本质量，g。用96孔板测定的计算公式如下: 标准曲线：y=32.4375x+0.0251，R 2 =0.9991

乳制品中L-羟脯氨酸的测定

乳制品中L-羟脯氨酸的测定 1 引言 皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”。本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测，可根据实际情况进行选择。 2 仪器与试剂 2.1 仪器、器皿 2.1.1 HPLC+紫外检测器 2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱（CAT#: 99751）。 2.1.3 11 mL水解瓶（CAT#: 55354） 2.1.4 1.5 mL塑料离心管。 2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。 2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。 2.1.7 0.22 μm针式过滤器（CAT#:37177）。 2.1.8 2 mL样品瓶（瓶：CAT#:5323，盖CAT#:5325） 2.2 试剂 2.2.1 甲醇（CAT#:50102）。 2.2.2 乙腈（CAT#:50101） 2.2.3 正己烷（CAT#:50115） 2.2.3 三乙胺（CAT#:50131） 2.2.4 冰醋酸（CAT#:50132） 2.2.5 三乙胺（CAT#:50131） 2.2.6 磷酸氢二钠（CAT#:50158） 2.2.7 磷酸二氢钠（CAT#:50157） 2.2.8 L-羟脯氨酸（CAT#:46587） 2.2.9 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。

胶原海绵的羟脯氨酸含量测定

胶原海绵的羟脯氨酸含量测定 摘要：选用普通实验室均能实现的Woessner第Ⅰ法对自制胶原海绵和 Gelfix(国外样品)进行了羟脯氨酸含量测定，结果表明，该方法操作简单，重复 性好：自制胶原海绵的羟脯氨酸含量稳定，与国外样品的羟脯氨酸含量接近，且与胶原蛋白的羟脯氨酸含量接近，证实了两种胶原海绵的纯度均较高。 关键词：胶原海绵；羟脯氨酸；含量测定 胶原海绵是无过敏性、无菌冻干胶原，是促进伤口痊愈的特效药，还可作为各种外科手术填充剂和止血药，疗效显著，用途广泛。羟脯氨酸是胶原的特异性氨基酸，而且含量比较稳定，定量测定胶原水解后的羟脯氨酸含量乃是胶原定量所常用的方法〔1〕。 传统测定胶原特异性氨基酸含量和胶原总量的方法是化学比色法和电泳法，其操作步骤繁琐，影响因素多，样品需要量大，且准确性差。氨基酸分析仪可提供快速、准确、高灵敏度的测定方法〔2〕，但氨基酸分析仪价格昂贵，普通实验室难以实现。Kivirikko〔3〕等报道了一种测定尿液中羟脯氨酸的特殊方法，它 适合于羟脯氨酸含量少的样品。Woessner〔4〕等报道了适合于从组织液、动植物中提取的蛋白质等生物材料的羟脯氨酸含量的测定方法，其中Woessner第Ⅰ法操作简便，但易受其它氨基酸影响，仅适用于羟脯氨酸含量高的样品测定。据报道，胶原蛋白的羟脯氨酸含量较高〔5〕，因此，本文选用Woessner第Ⅰ法对自制的胶原海绵进行了羟脯氨酸含量测定，以此作为质量检验的一项重要指标。Gelfix是欧洲科研大药厂生产的胶原海绵，为了对比自制的胶原海绵与国外产品的纯度，本文同时对Gelfix进行了羟脯氨酸含量测定。 1 材料与方法 1.1 试剂与器材 试剂：盐酸，氯胺T，乙二醇甲醚，醋酸，氢氧化钠，枸橼酸钠，醋酸钠，过氯酸，以上均为分析纯；氨基酸标准品，生化标准试剂；氮气：纯度为99.99%。器材：多功能电子恒温水浴锅，上海凯乐电子设备厂；UV-160A紫外分光光 度计，日本岛津；PHS-2C酸度计，天津第二分析仪器厂；LC-222鼓风干燥箱，温度波动±1℃；ZFA84-Z型旋转蒸发器，上海玻璃仪器厂；精密电子天平，美 国Denver仪器公司；安培瓶；移液管；带塞试管；容量瓶。 1.2 实验方法 1.2.1 胶原海绵的制备：根据文献〔6-7〕所述制备出可溶性胶原材料，然后将 其分散在0.1%乙酸溶液中(浓度为15～25 mg/ml)，冷冻干燥制成海绵状胶原材料。 1.2.2 Woessner第Ⅰ法 1.2.2.1 羟脯氨酸标准液的配制：准确称取羟脯氨酸标准品，加入少许0.001 mol/L盐酸溶液，配制浓度分别为1.0 μg/ml，2.0 μg/ml，3.0 μg/ml，4.0 μg/ml，5.0 μg/ml的标准液。 1.2.2.2 样品处理液的制备：准确称取胶原海绵样品约10 mg，记为W，加入6 mol/L盐酸1 ml，于安培瓶中充氮2 min，封管后于110℃加热24 h进行水解，水解后用旋转蒸发器去除盐酸，加入蒸馏水5 ml稀释，取400 μl该溶液稀释至

脯氨酸含量测定

植物抗逆性的测定（脯氨酸快速测定法） 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，Barheff 和Naylor（1966年）指出：在水分亏缺的情况下，引起蛋白质分解，而脯氨 酸首先大量地被游离出来。植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒性的生理指标。 （一）原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当有磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 （二）材料及设备 1. 材料仪器械：（1）待测植物（水稻、小麦、玉米、高梁、大豆均可）。（2）722分光光度计，（3）研钵，（4）100ml小烧杯，（5）容量瓶，（6）大试管2支，（7）普通式管8支，（8）移液管；（9）注射器；（10）水浴锅，（11）漏斗，（12）漏斗架，（13）滤纸，（14）剪刀。 2. 试剂 （1）酸性茚三酮溶液：将1. 25茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6M 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。

（2）3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸蒸馏水溶解后定容至100ml。 （3）冰醋酸，（4）甲苯 （三）实验步骤 1. 标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。 （2）系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，其每瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5，及6μg/ml/ （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30分钟。 （4）冷却后向各试管准确加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出密度（y）依脯氨酸浓度（x）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线计算2ml测定液中脯氨酸的含量 （μg/ml）。 2. 样品的测定 （1）脯氨酸的提取：准确称了以不同处理的待测植物叶片各0.5g，分