附录Ⅺ H 无菌检查法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度 10 000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基
培养基的制备及培养条件
培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2 ℃～ 25 ℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基
酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g
L-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0 ml 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1 ± 0.2 。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2 。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不
得超过培养基深度的 1/5 ，否则，须经 100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置 30 ℃～ 35 ℃培养。
2.改良马丁培养基
胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 值约为 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 6.4 ± 0.2 ，分装，灭菌。
改良马丁培养基置 23 ℃～ 28 ℃培养。
3.选择性培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
4.营养肉汤培养基
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2 ，分装，灭菌。
5.营养琼脂培养基
按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2 ，分装，灭菌。
6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2 ，分装，灭菌。
7.改良马丁琼脂培养基
按改良马丁培养基的处方及制法，加入 14.0g 琼脂，调节 pH 值使灭菌后为 6.4
± 0.2 ，分装，灭菌。
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。
灵敏度检查
菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu （菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1
支不接种作为空白对照，培养3天； 取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。
结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH 值至7.1±0.2，分装，灭菌。
2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾
3.56g ，磷酸氢二钠 7.23g，氯化钠
4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml ，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
3、根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法验证试验
当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。
菌种及菌液制备 除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养3～5天，各试验菌同法操作。
直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管，
分别接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100 cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，另1管作为对照，按置规定的温度培养3～5天。
结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。
验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查
检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。
检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。
阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。
操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。
供试品处理及接种培养基
除另有规定外，按下列方法进行。
1.薄膜过滤法
薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。
可溶于水的固体制剂供试品 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。
?-内酰胺类抗生素供试品 取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理方法处理，立即过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含适量?-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加少量的?-内酰胺酶；或将滤膜直接接种至含适量?-内酰胺酶的培养基中。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品 取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44℃，趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
无菌气（喷）雾剂供试品 取规定量，将各容器置至少－20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
装有药物的注射器供试品 取规定量，排出注射器中的内容物，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。然后按水溶性供试品项下方法操作。
同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。
具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品 取规定量，每个最小包装用50～100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。
2.直接接种法
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注： ①无菌十四烷酸异丙酯的制备 采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140℃干热灭菌2小时。
直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。
混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量，接种至各管培养基中。
固体制剂供试品 取规定量直接接种至各管培养基中。或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至各管培养基中。
有抑菌活性的供试品 取规定量，混合，加入适量的无菌中和剂或灭活剂，然后接种至各管培养基中。或直接接入含适量中和剂或灭活剂的各管培养基中。
非水溶性制剂供试品 取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的各管培养基中。
敷料供试品 取规定数量，以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg 或1cm×3cm的供试品，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
肠线、缝合线等供试品 肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装，无菌拆开包装，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
灭菌医用器具供试品 取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
放射性药品 取供试品1瓶(支)，接种于装量为7.5ml的培养基中。每管接种量为0.2ml。
培养及观察
上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
结果判断
阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：
⑴ 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
⑵ 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
⑶ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。
表1 批出厂产品最少检验数量
供试品 批产量N（个） 接种每种培养基所需的 最少检验数量
≤100 10%或4个（取较多者）
100＜N≤500 10个
注射剂
＞500 2%或20个（取较少者）
大体积注射剂（＞100 ml）2%或10个（取较少者）
≤200 5%或2个（取较多者）
眼用及其他非注射产品
＞200 10个
≤4 每个容器
4＜N≤50 20%或4个容器（取较多者）桶装无菌固体原料
＞50 2%或10个容器（取较多者）抗生素固体原料药（≥5
克）
6个容器
医疗器具
≤100 10%或4件（取较多者）
100＜N≤500 10件
＞500 2%或20件（取较少者） 注：若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
表2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量
供试品装量V （ml） 每支供试品接入每种培养
基的最少量
供试品最少检验数
量（瓶或支）
≤1 全量 10 ①1＜V＜5 半量 10 5≤V＜20 2ml 10 20≤V＜50 5ml 10 50≤V＜100 10ml 10 50≤V＜100(静脉给药) 半量 10 100≤V≤500 半量 6 V ＞500 500ml 6①
注：① 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
表3 固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量
供试品装量 M/支或瓶 每支供试品接入每种培养
基的最少量
供试品最少检验数
量(瓶或支)
M <50mg 全量 10 ①50mg≤M<300mg 半量 10
300mg≤M<5g 150 mg 10
M≥5g 500 mg 10 ②
10
外科用敷料棉花及纱布 取100 mg 或
1cm×3cm
缝合线、一次性医用材料 整个材料③ 10 ①
10
带导管的一次性医疗器具
（如输液袋）
其它医疗器具 整个器具③（切碎或拆散开） 10 ①
注：① 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
② .抗生素粉针剂（≥5克）及抗生素原料药（≥5克）的最少检验数量为6瓶（或支）。桶装固体原料的最少检验数量为4个包装。
③ 如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
附录XII A 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL 硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL） 琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 2、改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。 4、营养肉汤培养基 胨10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000mL 取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
应掌握的基本概念：(以下内容将包含在选择、填空和问答题中） 1、项目的定义 一般认为：项目是一个组织为实现自己既定的目标，在一定的时间、人员和资源约束条件下，所开展的一种具有一定独特性的一次性工作。 2、项目管理的定义 1.项目管理是使用各种管理方法、技术和知识为实现项目目标而对项目各项活动所开展的管理工作。 2.项目管理涉及到对于项目或项目阶段的起始、计划、组织、控制和结束这样五个具体的管理过程（或内容）。 3、一个项目可以划分为四个主要工作阶段： 1.项目的定义与决策阶段 2.项目的计划和设计阶段 3.项目的实施与控制阶段 4.项目的完工与交付阶段 4、现代项目管理知识体系的构成 按照PMI的体系可以划分为如下九个主要的方面。 1．项目集成管理 确保各种项目工作和项目的成功要素能够很好的协调与配合，以及相应的管理理论、方法、工具。 2．项目范围管理 计划和界定一个项目或项目阶段需要完成的工作和必须要完成的工作的管理工作的理论、方法、工具。 3．项目时间管理 又叫项目工期进度管理，是有关如何按时完成项目工作的理论、方法、工具。 4．项目成本管理 又叫项目选价管理，是如何在不超出项目预算的情况下完成整个项目工作，所需的管理理论、方法、工具。 5．项目质量管理 如何确保项目质量，以及保证项目质量所需的管理理论、方法、工具。 6．项目人力资源管理 如何更有效地利用项目所涉及的人力资源，以及在项目人力资源管理方面所需的管理理论、方法、工具。 7．项目沟通管理 如何有效、及时地生成、收集、储存、处理和最有效的使用项目信息，以及在项目信息和沟通管理方面所需的管理理论、方法、工具。 8．项目风险管理 如何识别项目风险、分析项目风险和应对项目风险，以及项目风险管理所需的管理理论方法、工具。 9．项目采购管理 也叫做项目获得管理，是有关从项目组织外部寻求和获得各种商品与劳务的管理，以及这一管理所需的理论、方法、工具。 5、项目管理过程 一个项目的全过程或项目阶段都需要有一个相对应的项目管理过程。这种项目管理过程一般由五个不同的管理具体工作过程构成。 1．起始过程 它包含有：定义一个项目阶段的工作与活动、决策一个项目或项目阶段的起始与否，以及决定是否
无菌检查法-2015版中国药典 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g (或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2. 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨17.0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾2.5g 葡萄糖（一水合/无水）2.5g （2.3g）纯化水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
项目投资的基本概念 黄大方 一、项目投资的相关概念 1、投资主体 投资人或从债权人也可以作为项目的投资主体（间接投资主体）。这三种人都要从各自的立场分析评价投资项目。 企业项目投资的直接投资主体就是企业本身。 2、项目计算期 项目计算期是指投资项目从投资建设(建设起点)开始到最终清理(终结点)结束整个 过程的全部时间，包括建设期和生产经营期。 n ＝s+p 从上述数轴中应该明白六点：建设期起点（项目计算期起点）；建设期终点（经营期起点）；经营期终点（项目计算期终点）。 NCF1 ：第1年现金净流量( 假定其全部发生于第1年末现金净流量) NCF2：第2年现金净流量(假定其全部发生于第2年末现金净流量) 注意NCF 与N 、S 、P 之间的换算关系如某项目建设期为3年，生产经营期7年，则： NCF9=NCF （3+6）表示项目计算期第9年，也是生产经营期第6年的净现金流量。 如某项目建设期为3年，生产经营期7年，则：项目计算期第7年即为生产经营期第4年（7-3）；生产经营期第2年即为项目计算期第5年（3+2）。 3、投资项目的有关价值指标 1）原始总投资等于企业为使项目完全达到设计生产能力、开展正常经营而垫支的全部现实资金，包括建设投资（固定资产投资、无形资产投资、开办费投资）与流动资金投资。原始总投资可以一次投入，也可以分次投入。 2）投资总额等于原始总投资与建设期资本化利息之和，其中固定资产投资与其资本化利息之和称为固定资产原值。
投资决策中的现金流量，通常由以下几个方面构成： 1、初始现金流量 初始现金流量是指项目开始投资量发生的现金流量。包括： （1）固定资产投资。 （2）其他长期资产投资。 （3）流动资金投资。 （4）原有固定资产的变价收入。 2、营业现金流量 营业现金流量是指项目完成后，就整个寿命周期内由于下沉生产营业所带来的现金流量。此类现金流量可按年计算。其值等于营业现金收入减去营业现金支出和 税金支出后的差额。 应该注意的是，定期损益计算的净收益和营业上实际发生的现金流量是有所不同的。因为根据权责发生制进行定期的损益计算，费用中包括了非现金支出的部分（主要是折旧费、摊销费和利息费）。因此，以定期操作益计算的净收益为基础，可按下式调整计算现金流量： 营业现金流量=定期操作益计算的净收益+非现金支出的成本费用 3、终结点现金流量 终结点现金流量是指项目经济寿命终结时发生的现金流量。主要包括 a)固定资产的变价收入或残值收入 b)原垫支的流量资金回收额。
无菌检查法
目录 一、培养基 (2) <一>培养基的制备 (2) <二>培养基的适用性检查 (3) 二、稀释液、冲洗液及其制备方法 (4) 三、方法验证或试验 (4) <一>菌种及菌液制备 (4) <二>验证方法 (4) <三>结果判断 (4) 四、供试品的无菌检查 (4) 五、供试品处理及接种培养基 (5) <一>薄膜过滤法 (5) <二>直接接种法 (6) 六、培养及观察 (7) 七、结果判断 (7)
无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 一、培养基 <一>培养基的制备 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌） 酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml；L-胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g（或硫乙醇酸0.3ml）；水1000ml；酵母浸出粉5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2、改良马丁培养基（用于培养真菌） 胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 改良马丁培养基置23～28℃培养。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证。 4、营养肉汤培养基 胨10g；牛肉浸出粉3.0g；氯化钠5g；葡萄糖5.0g；水1000ml。 取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使 灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2
XXX无菌检验方法学验证方案 编号：VP.SV.039.00
目录 验证方案的审批 验证小组名单 验证实施进度 技术性文件 引言 1．概述 2．验证目的 3．职责 无菌检查方法学的确认 再验证周期
验证方案审批
验证小组名单 验证实施进度 技术性文件
引言 1.概述 1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方 法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。 2.验证目的： 2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验， 寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。 3.职责 3.1验证办 3.1.1负责验证方案的审批。 3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。 3.1.3负责验证数据及结果的审核。 3.1.4负责验证报告的审核。 3.1.5负责再验证周期的确认。 3.2质量监控部 3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。 3.2.3负责取样及样品检验。 3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。 3.2.5负责拟订验证方案。 3.2.6负责组织试验所需设备。 3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。 3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认 1.验证环境、设备及实验前准备： 1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或 隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。 1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗 设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅 特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实 业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公 司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭 州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备 厂)；。⑧微孔滤膜（孔径0.45μm直径50mm）… 1.3供试品： 1.4所需培养基： 1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定 厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定 厂家：北京三药科技开发公司； 营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 1.5稀释液、缓冲液： 0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页) 1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102] 生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F） 98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶 (管)，培养 14 天，结果应无菌生长。 2.方法学验证: 2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
1. 目的： 建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2. 范围： 适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。 3. 责任： 化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。 4. 定义： 无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。 5.内容： 5. 1无菌操作设备： 无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。 5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌 衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局 部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外 光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。 5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及 可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完 毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半时。 5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程 中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯 旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板： 在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间 的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露
30分钟后 将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加 总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／ 升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况 定期置换过滤器。 5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、 75％酒精棉及拖鞋等。 5.2仪器、用具： 5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。 5.2.2用具的包扎： 5.2.2.1移液管 在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。 5.2.2.2试管 在管口塞上纱布棉塞。 5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩 将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。 5.2.2.4注射器 洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。
无菌检验方法验证记录 1.适用范围 本方案适用于本公司各品种无菌检验方法的验证。 2.目的 通过验证确认所采用的方法适合于该药品的无菌检查，确保该产品无菌检查结果的正确性。 3.职责 项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。 验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。 QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。 QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。 QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。 质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。 4. 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的无菌检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行实验，根据实验结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的无菌检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 5.检查和确认 5.1无菌检验室，洁净级别1万级；超净工作台，局部100级（确认方法：审阅相关的验证资料）。 无菌检验室（洁净级别1万级）验证报告 超净工作台（洁净级别100级）验证报告 检查结论：验证资料完整，符合相应洁净度要求且在有效期内。 检查人：日期： 5.2与验证相关的文件（确认方法：检索）。 无菌检查法操作规程和检定菌传代操作规程 净化工作台使用操作规程 无菌检验室清洁消毒规程 培养箱标准操作规程 检查结论：验证所需资料齐全、完整，符合验证要求。 检查人：日期： 5.3检验用仪器设备（确认方法：检查、核对）。
符合3Q（IQ、OQ、PQ）要求。 5.3.1 智能集菌仪 型号：WJ-6 生产厂家：杭州高得泰林公司 蠕动泵转速：140 rpm 5.3.2 集菌培养器 型号：KSF330 生产厂家：杭州高得泰林公司 批号： 5.3.3 培养箱 型号：HP400S 生产厂家：武汉瑞华仪器设备有限公司 校验有效期至：年月日 设定温度：32.5℃ 型号：PYX-280S-A 生产厂家：KELI 科力仪器 校验有效期至：年月日 设定温度：25.5℃ 5.3.4超级净化层流台 型号：YJ-875 生产厂家：苏州市姑苏空调净化有限公司 验证有效期至：年月日 检查结论：符合要求 检查人：日期： 5.4检验用菌种、培养基和试液（确认方法：检查、核对） 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 批号生产厂：中检所 铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104] 批号生产厂：中检所 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501] 批号生产厂：中检所 生胞梭菌[CMCC（B）64941 ] 批号生产厂：中检所 白色念珠菌[CMCC（F）98001] 批号生产厂：中检所 β-内酰胺酶：2ml（大于200单位/ml）批号生产厂：中检所 硫乙醇酸盐流体培养基批号：生产厂：北京三药科技开发公司改良马丁培养基批号：生产厂：北京三药科技开发公司营养肉汤培养基批号：生产厂：北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基批号：生产厂：北京三药科技开发公司检查结论：符合要求
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法验证 方案及报告 验证方案申请人:验证方案审核人:验证方案审批人:日期: 日期: 日期: 年 年 年 月 月 月 日 日 日
浙江红雨医药用品有限公司 1 概述 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于 实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品 受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的 验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2 验证目的 对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本 公司产品的无菌检查。 3 实验原理 直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作 用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。 本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得 出直接接种法无菌检验的有效性。 4 验证范围 实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。 5 6 职责 7 验证内容 建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比 较观察菌落的生长状况，得出结论。 8 验证指示物 本实验所用菌种为购于浙江省食品药品检验研究所标准菌株:金黄色葡萄球菌、白色 念球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌。
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，
附录Ⅻ A 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度10 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 培养基的制备 培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉
5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0 ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g (或硫乙醇酸) （0.3 ml) 水1000 ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1 ± 0.2 。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 ，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 2.改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000 ml
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法 验证方案及报告 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1 概述 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作 为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用 于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样 品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制 约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验 方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组 成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2 验证目的 对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本 公司产品的无菌检查。 3 实验原理 直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作 用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。 本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得 出直接接种法无菌检验的有效性。 4 验证范围 实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。 5 执行程序 文件编码文件名称存放部门 HY-QC-012 无菌检验操作规程品管部 6 职责 姓名职务职责 刘传杰经理负责验证方案的批准实施、验证报告的批准 周德标QC 验证方案、验证报告的起草并负责验证过程中现场的监控及取样张思东QC 负责按制订无菌检验规程实施检验和验证实验 7 验证内容 建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比 较观察菌落的生长状况，得出结论。 8 验证指示物 本实验所用菌种为购于浙江省食品药品检验研究所标准菌株:金黄色葡萄球菌、白色 念球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌。
无菌检查法 1.目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。 2.范围：对成品的无菌检查。 3.责任：质量监督部。 4.内容： 4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种 方法。无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。 4.2仪器、设备和用具： ℃及除湿装置。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控
制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。 ℃的生化培养箱。 4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02 酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。 ℃灭菌30分钟。 4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉 花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。 4.3试液： 4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。 4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。 4.3.3灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角 瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。 4.3.4新洁尔尔灭（1:1000）溶液。 4.3.53-5％甲酚溶液。 4.3.60.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培