第七章蛋白质性质和结构分析
传统的生物学认为，蛋白质的序列决定了它的三维结构，也就决定了它的功能。由于用X光晶体衍射和NMR核磁共振技术测定蛋白质的三维结构，以及用生化方法研究蛋白质的功能效率不高，无法适应蛋白质序列数量飞速增长的需要，因此近几十年来许多科学家致力于研究用理论计算的方法预测蛋白质的三维结构和功能，经过多年努力取得了一定的成果。
7.1分析蛋白质的一级结构
蛋白质序列一级结构分析包括了对理化性质和序列模式的分析。蛋白质理化性质的分析通常包括：蛋白质的分子量、等电点(pI)、氨基酸组成、疏水性和亲水性分析等。目前已经开发了众多的蛋白质序列理化性质计算工具，且大多提供网络服务或允许自由下载安装。除了下表中列出的由ExPASy整理的蛋白质序列理化性质计算的工具外，ANTHEPROT、DNAMAN、BioEdit等也是较好的理化性质计算工具。理化性质对于进一步确定蛋白质的亚细胞定位、功能等非常有用，比如利用疏水残基与跨膜螺旋间的关系可以预测蛋白质序列是否跨膜，利用氨基酸组成成份可以预测蛋白质序列的亚细胞定位等。
7.1.1 ProtParam
ProtParam是计算输入序列的等电点(pI)、分子量(Mw)、氨基酸组成、消光系数、半衰期等理化性质的工具。对pI的确定基于早期研究中将蛋白质从由中性到酸性变性条件下迁移过程中所获得的pK值，对于碱性蛋白质所得到的pI值可能不准确。分子量的计算是把序列中每个氨基酸的同位素平均分子量加在一起，再加上一个水分子的分子量。用户可以把序列整理为FASTA格式，或提供SwissProt 标识。若用户提供了序列，该工具会自动计算全序列的pI和分子量；若用户提供的是SwissProt标识，程序会显示该条目的描述和物种记录，此时计算将在片段上进行，而不是针对整个序列。
7.1.2 ProtScale
可以计算给出蛋白质序列的氨基酸疏水区和亲水区，用户可以把序列整理为FASTA格式，或提供SwissProt标识，需选择合适的amino acid scale。
7.1.3 REP
可以分析指定蛋白质序列中的重复序列模块，用户可以把序列整理为FASTA格式，或提供SwissProt标识。已有的可供查询的模块包括：Ankyrin, Armadillo, HAT, HEAT, HEAT_AAA, HEAT_ADB, HEAT_IMB, Kelch, Leucin Rich Repeats, PFTA, PFTB, RCC1, TPR, WD40等。
7.2 分析蛋白质的二级结构
二级结构是指α螺旋和β折叠等规则的蛋白质局部结构元件。不同的氨基酸残基对于形成不同的二级结构元件具有不同的倾向性。按蛋白质中二级结构的成分可以把球形蛋白分为全α蛋白、全β蛋白、α＋β蛋白和α/β蛋白等四个折叠类型。预测蛋白质二级结构的算法大多以已知三维结构和二级结构的蛋白质为依据，用过人工神经网络、遗传算法等技术构建预测方法。还有将多种预测方法结合起来，获得“一致序列”。总的来说，二级结构预测仍是未能完全解决的问题，一般对于
α螺旋预测精度较好，对β折叠差些，而对除α螺旋和β折叠等之外的无规则二级结构则效果很差。
7.2.1 nnPredict
用神经网络方法预测二级结构，蛋白质结构类型分为全α蛋白、全β蛋白和α/β蛋白，输出结果包括“H”(螺旋)、“E”(折叠)和“-”(转角)。这个方法对全α蛋白能达到79%的准确率。
7.2.2 SOPMA
位于法国里昂的CNRS（Centre National de la Recherche Scientifique）使用独特的方法进行蛋白质二级结构预测。它不是用一种，而是5种相互独立的方法进行预测，并将结果汇集整理成一个“一致预测结果”。这5种方法包括：Garnier-Gibrat-Robson（GOR）方法（Garnier等，1996）、Levin同源预测方法（Levin 等，1986）、双重预测方法（Deléage和Roux，1987）、作为前面PredictProtein 一部分的PHD方法和CNRS自己的SOPMA方法（Geourjon和Déleage，1995）。简单的说，SOPMA这种自优化的预测方法建立了已知二级结构序列的次级数据库，库中的每个蛋白质都经过基于相似性的二级结构预测。然后用次级库中得到的信息去对查询序列进行二级结构预测。
7.2.3 Paircoil
Paircoil将输入序列与数据库中coiled-coils比较产生相似性分值。通过比较这个分值与球蛋白，卷曲螺旋蛋白的分值的分布，可以计算提交序列将会采取的卷曲螺旋构象的概率分值。
7.3 分析蛋白质的三级结构
蛋白质三维结构预测时最复杂和最困难的预测技术。研究发现，序列差异较大的蛋白质序列也可能折叠成类似的三维构象，自然界里的蛋白质结构骨架的多样性远少于蛋白质序列的多样性。由于蛋白质的折叠过程仍然不十分明了，从理论上解决蛋白质折叠的问题还有待进一步的科学发展，但也有了一些有一定作用的三维结构预测方法。最常见的是“同源模建”和“Threading”方法。前者先在蛋白质结构数据库中寻找未知结构蛋白的同源伙伴，再利用一定计算方法把同源蛋白的结构优化构建出预测的结果。后者将序列“穿”入已知的各种蛋白质的折叠子骨架内，计算出未知结构序列折叠成各种已知折叠子的可能性，由此为预测序列分配最合适的折叠子结构。除了“Threading”方法之外，用PSI-BLAST方法也可以把查询序列分配到合适的蛋白质折叠家族，实际应用中发现这个方法的效果也不错。
在谈及这种或那种预测技术之前要预先说明的是，无论用哪种方法，这些结果都是预测。不同的方法，采用了不同的算法，可能产生相同或不同的结果。但有一点很重要：弄清楚某种方法的原理，而不是仅把算法当作一个“黑箱”。因为一种方法可能对特定实例很合适，而对另一个则完全不对。虽然如此，存在一种强大合作的潜力：正确应用这些预测技术，参照以主要的生化数据，就能提供有关蛋白质结构与功能的有价值信息。
7.4 分析膜蛋白质
膜蛋白可分为膜附着蛋白和膜镶嵌蛋白两大类，膜蛋白的跨膜区一般形成 -螺
旋，膜附着蛋白通常由膜镶嵌蛋白剪切形成。
7.4.1 SOSUI
东京农业科技大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)提供的膜蛋白分类和二级结构预测在线工具，可分析蛋白质跨膜区。预测结果分为两类：membrane protein （显示transmembrane helix）和soluble protein（非膜蛋白）。
7.4.2 DGPI
Prediction of GPI-anchor and cleavage sites，预测GPI的切点与接点位置，判断是否是膜附着蛋白。
7.5 分析蛋白质的翻译后修饰
蛋白质序列的翻译后修饰分析包括信号肽分析、亚细胞定位、糖基化修饰等。这些性质多半可直接由分析其序列而获得，并且这些性质大多与蛋白质的结构和功能相关，比如羧基端含有KDEL序列特征的蛋白质将被引向内质网，从而通过确定其亚细胞预测其功能。又如，亚细胞定位与功能相关，因为蛋白质必须在一定的细胞位置与一定的蛋白质相互作用才能完成特定的功能。蛋白质如果没有定位到正确的细胞位置还可能引起比如cancer和Alzheimer等疾病。另外，细菌的extracellular蛋白可以沿着类似的default pathway进入到真核生物细胞中。更进一步，通过与某些真核生物蛋白形成复合体进入特定的亚细胞位置，从而激发或抑制某些特定的细胞功能，甚至直接导致细胞死亡。这对于疾病治疗和预防，如治疗癌症，以及寻找疾病疫苗或生物制剂药物，如构造细菌武器及其治疗疫苗等具有重要意义。再如，蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。尤其在细胞应答外界刺激时，蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号传递方式。如在中枢神经系统中，几乎所有的兴奋性神经递质信号受体调控的方式都是磷酸化与去磷酸化。
7.5.1 SignalIP
SignalP可以对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌和真核生物的蛋白质序列进行信号肽分析。预测采用了隐马尔可夫和人工神经网络技术的融合。其训练数据是从SwisProt第29版中挑选来的，分为真核生物，革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌三组。
7.5.2 NetOGlyc和NetNGlyc
分别分析O-连接糖链和N-连接糖链的连接位点，判断待分析蛋白是否可能发生糖基化。
7.6 分析蛋白质的亚细胞定位
蛋白质必须在一定的亚细胞器上才能正确行使其功能。同时也只有在相同或相近的亚细胞位置上蛋白质间才会有相互作用。亚细胞位置异常的蛋白质通常还会引起如癌症、老年痴呆症等疾病。亚细胞定位的预测目前有同源传递、基于序列motifs识别的方法、ab initio方法、蛋白质-蛋白质相互作用方法等。这里对PSORTB的预测原理和方法作简单介绍。
PSORTB 1.0 for bacteria预测5类亚细胞位置：cytoplasm, the inner membrane, the
periplasm, the outer membrane, the extracellular space(针对革兰氏阴性菌)。采用的训练数据集是从SWISS-PROT 40.29中收集的注释了亚细胞位置的革兰氏阴性菌序列。工具的使用方法见网页https://www.doczj.com/doc/a413839343.html,/。
7.7分析化学因子作用蛋白质的位点
PeptideCutter：分析蛋白质在各种蛋白酶和化学试剂处理后的内切产物。蛋白酶和化学试剂包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、LysC、溴化氰、ArgC、AspN和GluC等。
蛋白质结构解析的方法对比综述 工程硕士李瑾 摘要：到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法，这两种方法各有优点和不足。 关键词：x射线衍射法 NMR法 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和不足[1]。 首先是X射线晶体衍射法。该方法的前提是要得到蛋白质的晶体。通常是将表达目的蛋白的基因经PCR扩增后克隆到一种表达载体中，然后转入大肠杆菌中诱导表达，目的蛋白提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，得到蛋白质的原子结构[2]。 x射线晶体衍射法的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，最快当天就能得出结构，另外不受肽链大小限制，无论是多大分子量的蛋白质或者RNA、DNA，甚至是结合多种小分子的复合体，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的关键是摸索蛋白结晶的条件。该方法得到的是蛋白质分子在晶体状态下的空间结构，这种结构与蛋白质分子在生物细胞内的本来结构有较大的差别。晶体中的蛋白质分子相互间是有规律地、紧密地排列在一起的，运动性较差；而自然界的生物细胞中的蛋白质分子则是处于一种溶液状态，周围是水分子和其他的生物分子，具有很好的运动性。而且，有些蛋白质只能稳定地存在于溶液状态，无法结晶[2]。 核磁共振NMR（nuclear magnetic resonance）现象很早就被科研人员观察到了，但将这种方法用来解析蛋白质结构，却是近一二十年的事情。NMR法具体原理是对水溶液中的蛋白质样品测定一系列不同的二维核磁共振图谱，然后根据已确定的蛋白质分子的一级结构，通过对各种二维核磁共振图谱的比较和解析，在图谱上找到各个序列号氨基酸上的各种氢原子所对应的峰。有了这些被指认的峰，就可以根据这些峰在核磁共振谱图上所呈现的相互之间的关系得到它们所对应的氢原子之间的距离。[3]可以想象，正是因为蛋白质分子具有空间结构，在序列上相差甚远的两个氨基酸有可能在空间距离上是很近的，它们所含的氢原子所对应的NMR峰之间就会有相关信号出现[4] 。通常，如果两个氢原子之间距离小于0.5纳米的话，它们之间就会有相关信号出现。一个由几十个氨基酸残基组成的蛋白质分子可以得到几百个甚至几千个这样与距离有关的信号，按照信号的强弱把它们转换成对应的氢原子之间的距离，然后运用计算机程序根据所得到的距离条件模拟出该蛋白质分子的空间结构。该结构既要满足从核磁共振图谱上得到的所有距离条件，还要满足化学上有关原子与原子结合的一些基本限制条件，如原子间的化学键长、键角和原子半径等[4]。 NMR解析蛋白结构常规步骤如下：首先通过基因工程的方法，得到提纯的目的蛋白，在蛋白质稳定的条件下，将未聚合，而且折叠良好的蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，PH6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后由写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、13N、13C原子，等电磁波发射完毕，再收集受激发的原子所放出的“能量”，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构[5] [6]。 用NMR研究蛋白质结构的方法，可以在溶液状态进行研究，得到的是蛋白质分子在溶液中的结构，这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态[7]。此外，通过改变溶液的性质，还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件，即蛋白质分子所处的各种环境，以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。在溶液环境中，蛋白质分子具有与自然环境中类
蛋白质结构与功能的关系 （The relationship between protein structure and function） 摘要蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强！现而今关于蛋白质功能研究还有待发展，一门新兴学科正在发展，血清蛋白组学，生物信息学等！本文仅就蛋白质结构与其功能关系进行粗略阐述。 关键词：蛋白质结构；折叠/功能关系；蛋白质构象紊乱症；分子伴侣 Keywords：protein structure；fold／function relationship；protein conformational disorder；molecular chaperons 虽然蛋白质结构与生物功能的关系比序列与功能的关系更加紧密，但结构与功能的这种关联亦若隐若现，并不能排除折叠差别悬殊的蛋白质执行相似的功能，折叠相似的蛋白质执行差别悬殊功能的现象的存在。无奈，该领域仍不得不将100多年前Fisher提出的“锁一钥匙”模型(“lock—key”model)和50多年前Koshand提出的诱导契合模型(induce fitmodel)作为蛋白质实现功能的理论基础。这2个略显粗糙的模型只是认为蛋白质执行功能的部位局限在结构中的一个或几个小区域内，此类区域通常是蛋白质表面上的凹洞或裂隙。这种凹洞或裂隙被称为“活性部位(active site)”或“别构部位（fallosteric site）”，凹陷部位与配体分子在空间形状和静电上互补。此外，在酶的活性部位中还存在着几个作为催化基团(catalyticgroup)的氨基酸残基。对蛋白质未来的研究应从实验基本数据的归纳和统计入手，从原始的水平上发现蛋白质的潜藏机制【1】。 蛋白质结构与功能关系的研究主要是以力求刻画蛋白质的3D结构的几何学为基础的。蛋白质结构既非规则的几何形，又非完全的无规线团(randomcoil)，而是有序(α一螺旋和β一折叠)与无序(线团或环域loop)的混合体。理解蛋白质3D结构的技巧是将结构简化，只保留某种几何特征或拓扑模式，并将其数字化。探求数字中所蕴含的规律，且根据这一规律将蛋白质进行分类，再将分类的结构与蛋白质的功能进行比较，以检验蛋白质抽象结构的合理性。如果一种对蛋白质结构的简化、比较和分类能与蛋自质的功能有较好地对应关系，那么这就是一种对蛋白质结构的有价值的理解。蛋白质结构中，多种弱力(氢键、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用、堆积力等)和可逆的二硫键使多肽链折叠成特定的构象。从某种意义上说，共价键维系了蛋白质的一级结构；主链上的氢键维系了蛋白质的二级结构；而氨基酸侧链的相互作用和二硫桥维系着蛋白质的三级结构。亚基(subunit)内部的侧链相互作用是构象稳定的基础，蛋白质链之间的侧链的相互作用是亚基组装(四级结构)的基础，而蛋白质中侧链与配体基团问的相互作用是蛋白质行使功能的基础。 牛胰核糖核酸酶(RNase)变性和复性的实验是蛋白质结构与功能关系的很好例证。蛋白质空间结构遭到破坏；，可导致蛋白质的理比性质和生物学性质的变化，这就是蛋白质变性。变性的蛋白质，只要其一级结构仍然完好，可在一定条件下恢复其空间结构，随之理化性质和生物学性质也可重现，这被称为复性。RNase是由124个氨基酸残基组成的一条肽链，分子中8个半胱氨酸的巯基构成4对二硫键，进而形成具有一定空间构象的活性蛋白质。天然RNase遇尿素和β巯基乙醇时发生变性，其分子中的氢键和4个二硫键解开，严密的空间结构遭破坏，丧失了生物学活性，但一级结构完整无损。若去除尿素和β巯基乙醇，RNase又可恢复其原有构象和生物学活性。RNase分子中的8个巯基若随机排列成二硫键可有105种方式。有活性的RNase只是其中的一种，复性时之所以选择了自
蛋白质结构分析原理及工具 （南京农业大学生命科学学院生命基地111班） 摘要：本文主要从相似性检测、一级结构、二级结构、三维结构、跨膜域等方面从原理到方法再到工具，系统地介绍了蛋白质结构分析的常用方法。文章侧重于工具的列举，并没有对原理和方法做详细的介绍。文章还列举了蛋白质分析中常用的数据库。 关键词：蛋白质；结构预测；跨膜域；保守结构域 1 蛋白质相似性检测 蛋白质数据库。由一个物种分化而来的不同序列倾向于有相似的结构和功能。物种分化后形成的同源序列称直系同源，它们通常具有相似的功能；由基因复制而来的序列称为旁系同源，它们通常有不同的功能[1]。因此，推测全新蛋白质功能的第一步是将它的序列与进化上相关的已知结构和功能的蛋白质序列比较。表一列出了常用的蛋白质序列数据库和它们的特点。 表一常用蛋白质数据库 网址可能有更新 氨基酸替代模型。进化过程中，一种氨基酸残基会有向另一种氨基酸残基变化的倾向。氨基酸替代模型可用来估计氨基酸替换的速率。目前常用的替代模型有Point Accepted Mutation (PAM)矩阵、BLOck SUbstitution Matrix (BLOSUM)矩阵[2]、JTT模型[3]。 序列相似性搜索工具。序列相似性搜索又分为成对序列相似性搜索和多序列相似性搜索。成对序列相似性搜索通过搜索序列数据库从而找到与查询序列相似的序列。分为局部联配和全局联配。常用的局部联配工具有BLAST和SSEARCH，它们使用了Smith-Waterman 算法。全局联配工具有FASTA和GGSEARCH，基于Needleman-Wunsch算法。多序列相似性搜索常用于构建系统发育树，这里不阐述。表二列举了常用的成对序列相似性比对搜索工具
蛋白质结构及性质论文 ——动科一班黄细旺（1207010127）&冯志（1207010126） 摘要：蛋白质结构及其理化性质 关键词：蛋白质、结构、理化性质 前言： 蛋白质分子是由许多氨基酸通过肽键相连形成的生物大分子。人体内具有生理功能的蛋白质都是有序结构，每种蛋白质都有其一定的氨基酸百分组成及氨基酸排列顺序，以及肽链空间的特定排布位置。因此由氨基酸排列顺序及肽链的空间排布等所构成的蛋白质分子结构，才真正体现蛋白质的个性，是每种蛋白质具有独特生理功能的结构基础。 蛋白质结构 蛋白质分子结构分成一级、二级、三级、四级结构四个层次，后三者统称为高级结构或空间构象。并非所有的蛋白质都有四级结构，由一条肽链形成的蛋白质只有一级、二级和三级结构，由二条或二条以上多肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。 1．蛋白质的一级结构 蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。一级结构的主要化学键是肽键，有些蛋白质还包含二硫键，它是由两个半胱氨酸巯基脱氢氧化而成。 2．蛋白质的二级结构 蛋白质的二级是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肪酸主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链构象。 （一）肽单元20世纪30年代末L.Panling和R.B.Cory应用X线衍射技术研究氨基酸和寡肽的晶体结构其目的是要获得一组标准键长和键角以推导肽的构象最终提出了肽单元概念。他们发现参与肽健的6个原子位于同一平面Cα1和Cα2在平面上所处的位置为反构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元其中肽键（C-N）的键长为0132nm．介于C－N的单健长（0149nm）和双键长（0127nm）之问，所以有一定程度双键性能，不能自由旋转。而Cα分别与N和羰基碳相连的键都是典型的单键可以自由旋转。 （二）α-螺旋Paulαing和Core根据实验数据提出了两种肽链局部主链原子空间构象的分子模型，称为α-螺旋和β-折叠，它们是蛋白质二级结构的主要形式，在α-螺旋结构中多肽键的主链围绕中心轴是有规律的螺旋式上升，螺旋的走向为顺时钟方向即右手螺旋，其氨基酸恻键伸向螺旋外侧。每36个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm。a一螺旋的每个肽键N－H和第四个的羧基氧形成氨键，氢键的方向与螺旋长轴基本平行。肽链中的全部肽键都可形成氢键以稳固α-螺旋结构。肌红蛋白和血红蛋白分子中有许多肽链段落呈a一螺旋结构，毛发的角蛋白、肌肉的肌球蛋白以及血凝块中的纤维蛋白它们的多肽链几乎全长
蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的结构包括一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。 一级结构是蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。 蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架本身在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。常见的二级结构有α螺旋、三股螺旋、β折叠、β转角、β凸起和无规卷曲。α螺旋中肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展，它可能是极性的、疏水的或两亲的。β折叠是肽链的一种相当伸展的结构，有平行和反平行两种。如果β股交替出现极性残基和非极性残基，那么就可以形成两亲的β折叠。β转角指伸展的肽链形成180°的U形回折结构而改变了肽链的方向。β凸起是由于β折叠股中额外插入一个氨基酸残基而形成的，它也能改变多肽链的走向。无规卷曲是在蛋白质分子中的一些极不规则的二级结构的总称。无规卷曲无固定走向，有时以环的形式存在，但不是任意变动的。从结构的稳定性上看，右手α螺旋＞β折叠＞ U型回折＞无规卷曲，但在功能上，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当，α右手螺旋和β折叠一般只起支持作用。 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。三级结构通常由模体和结构域组成。稳定三级结构的化学键包括氢键、疏水键、离子键、范德华力、金属配位键和二硫键。模体可用在一级结构上，特指具有特殊生化功能的序列模体，也可被用于功能模体或结构模体，相当于超二级结构。结构模体是结构域的组分，基本形式有αα、βαβ和βββ等。常见的模体包括：左手超螺旋、右手超螺旋、卷曲螺旋、螺旋束、α螺旋-环-α螺旋、Rossmann卷曲和希腊钥匙模体。结构域是在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块，由若干个结构模体组成的相对独立的球形结构单位，它们通常是独自折叠形成的，与蛋白质的功能直接相关。一个结构域通常由一段连续的氨基酸序列组成。根据其占优势的二级结构元件的类型，结构域可分为五大类：α结构域、β结构域、α/β结构域、α+β 结构域、交联结构域。以上每一类结构域的二级结构元件可能有不同的组织方式，每一种组织就是一种结构模体。这些结构域都有疏水的核心，疏水核心是结构域稳定所必需的。 具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。组成寡聚蛋白质或多聚蛋白质的每一个亚基都有自己的三级结构。蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。驱动四级结构形成或稳定四级结构的作用力包括
蛋白质凭借游离的氨基和羧基而具有两性特征，在等电点易生成沉淀。不同的蛋白质等电点不同，该特性常用作蛋白质的分离提纯。生成的沉淀按其有机结构和化学性质，通过pH的细微变化可复溶。蛋白质的两性特征使其成为很好的缓冲剂，并且由于其分子量大和离解度低，在维持蛋白质溶液形成的渗透压中也起着重要作用。这种缓冲和渗透作用对于维持内环境的稳定和平衡具有非常重要的意义。 在紫外线照射、加热煮沸以及用强酸、强碱、重金属盐或有机溶剂处理蛋白质时，可使其若干理化和生物学性质发生改变，这种现象称为蛋白质的变性。酶的灭活，食物蛋白经烹调加工有助于消化等，就是利用了这一特性。 (二)蛋白质的分类 简单的化学方法难于区分数量庞杂、特性各异的这类大分子化合物。通常按照其结构、形态和物理特性进行分类。不同分类间往往也有交错重迭的情况。一般可分为纤维蛋白、球状蛋白和结合蛋白三大类。 1.纤维蛋白包括胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。 (1) 胶原蛋白胶原蛋白是软骨和结缔组织的主要蛋白质，一般占哺乳动物体蛋白总量的30%左右。胶原蛋白不溶于水，对动物消化酶有抗性，但在水或稀酸、稀碱中煮沸，易变成可溶的、易消化的白明胶。胶原蛋白含有大量的羟脯氨酸和少量羟赖氨酸，缺乏半胱氨酸、胱氨酸和色氨酸。 (2) 弹性蛋白弹性蛋白是弹性组织，如腱和动脉的蛋白质。弹性蛋白不能转变成白明胶。 (3) 角蛋白角蛋白是羽毛、毛发、爪、喙、蹄、角以及脑灰质、脊髓和视网膜神经的蛋白质。它们不易溶解和消化，含较多的胱氨酸(14-15%)。粉碎的羽毛和猪毛，在15-20磅蒸气压力下加热处理一小时，其消化率可提高到70-80%，胱氨酸含量则减少5-6%。 2.球状蛋白 (1) 清蛋白主要有卵清蛋白、血清清蛋白、豆清蛋白、乳清蛋白等，溶于水，加热凝固。 (2) 球蛋白球蛋白可用5-10%的NaCl溶液从动、植物组织中提取；其不溶或微溶于水，可溶于中性盐的稀溶液中，加热凝固。血清球蛋白、血浆纤维蛋白原、肌浆蛋白、豌豆的豆球蛋白等都属于此类蛋白。 (3) 谷蛋白麦谷蛋白、玉米谷蛋白、大米的米精蛋白属此类蛋白。不溶于水或中性溶液，而溶于稀酸或稀碱。 (4) 醇溶蛋白玉米醇溶蛋白、小麦和黑麦的麦醇溶蛋白、大麦的大麦醇溶蛋白属此类蛋白。不溶于水、无水乙醇或中性溶液，而溶于70-80%的乙醇。 (5) 组蛋白属碱性蛋白，溶于水。组蛋白含碱性氨基酸特别多。大多数组蛋白在活细胞中与核酸结合，如血红蛋白的珠蛋白和鲭鱼精子中的鲭组蛋白。 (6) 鱼精蛋白鱼精蛋白是低分子蛋白，含碱性氨基酸多，溶于水。例如鲑鱼精子中的鲑精蛋白、鲟鱼的鲟精蛋白、鲱鱼的鲱精蛋白等。鱼精蛋白在鱼的精子细胞中与核酸结合。 球蛋白比纤维蛋白易于消化，从营养学的角度看，氨基酸含量和比例也较纤维蛋白更理想。 3. 结合蛋白 结合蛋白是蛋白部分再结合一个非氨基酸的基团(辅基)。如核蛋白(脱氧核糖核蛋白、核糖体)，磷蛋白(酪蛋白、胃蛋白酶)，金属蛋白(细胞色素氧化酶、铜蓝蛋白、黄嘌呤氧化酶)，脂蛋白(卵黄球蛋白、血中β1-脂蛋白)，色蛋白(血红蛋白、细胞色素C、黄素蛋白、视网膜中与视紫质结合的水溶性蛋白)及糖蛋白(γ球蛋白、半乳糖蛋白、甘露糖蛋白、氨基糖蛋白)。
实验十
蛋白质功能性质的检测
*** 2014305004**
2014 级食品科学与工程*班
一、实验目的 通过本实验定性地了解蛋白质的主要功能性质。
二、实验原理 蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物 理化学性质，即对食品的加工、贮藏、销售过程中发生作用的那些性质，这些性 质对食品的质量和风味起着重要的作用。 蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系 中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。 蛋白质的功能性质可分为水化性质、表面性质、蛋白质-蛋白质相互作用的 有关性质三个主要类型，主要包括有吸水性、溶解性、保水性、分散性、粘度和 粘着性、乳化性、起泡性、凝胶作用等。
三、实验材料、试剂和仪器 1. 实验材料 （1） 2%蛋清蛋白溶液：取 2g 蛋清加 98ml 蒸馏水稀释，过滤取清夜。 （2） 卵黄蛋白：鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎。 2. 试剂 硫酸铵、饱和硫酸铵溶液；氯化钠、饱和氯化钠溶液；花生油；酒石酸 3. 仪器 刻度试管；100ml 烧杯；冰箱
四、操作步骤 1. 蛋白质水溶性的测定 在 10ml 刻度试管中加入 0.5ml 蛋清蛋白，加入 5ml 水，摇匀，观察其水溶 性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白 质的氯化钠溶液。
取上述蛋白质的氯化钠溶液 3ml，加入 3ml 饱和硫酸铵溶液，观察球蛋白的 沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋 清蛋白质在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。 2. 蛋白质乳化性的测定 取 0.5ml 卵黄蛋白于 10ml 刻度试管中，加入 4.5ml 水和 5 滴花生油；另取 5ml 水于 10ml 刻度试管中，加入 5 滴花生油；再将两支试管用力振摇 2~3min， 然后将两支试管放在试管架上，每隔 15min 观察一次，共观察 4 次，观察油水是 否分离。 3. 蛋白质起泡性的测定 (1) 在二个 100ml 的烧杯中，各加入 2%的蛋清蛋白溶液 30ml，一份用玻璃 棒不断搅打 1~2min；另一份用吸管不断吹入空气泡 1~2min，观察泡沫的生成、 泡沫的多少及泡沫稳定时间的长短。 (2) 在二支 10ml 刻度试管中，各加入 2%的蛋清蛋白溶液 5ml，一支放入冰 箱中冷至 10℃，另一支保持常温（30~35℃） ，以相同的方式振摇 1~2min，观察 泡沫产生的数量及泡沫稳定性有何不同。 (3) 在三支 10ml 刻度试管中，各加入 2%的蛋清蛋白溶液 5ml，其中一支试 管加入酒石酸 0.1g，一支加入氯化钠 0.1g；另一支作对照用，以相同的方式振摇 1~2min，观察泡沫的多少及泡沫稳定性有何不同。 4. 蛋白质凝胶作用的测定 在试管中加入 1ml 蛋清蛋白， 再加 1ml 水和几滴饱和食盐水至溶解澄清， 放 入沸水中，加热片刻观察凝胶的形成。
五、实验结果与分析 1.蛋白质水溶性的测定 水中 现象 产生白色沉淀 加入饱和氯化钠后 沉淀溶解，澄清溶液 加入饱和硫酸铵后 出现白色絮状物
蛋清蛋白加入水有白色沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇 匀， 得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。这是因为加入中性盐会增加蛋白质分子表 面的电荷， 增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质分子在水溶液中溶解
举例说明蛋白质结构和功能的关系 答： 1.蛋白质的一级结构与功能的关系 蛋白质的一级机构指：肽链中氨基酸残基（包括二硫键的位置）的排列顺序。一级结构是蛋白质空间机构的基础，包含分子所有的信息，且决定蛋白质高级结构与功能。 ①一级结构的变异与分子病 蛋白质一级结构是空间结构的基础，与蛋白质的功能密切相关，一级机构的改变，往往引起蛋白质功能的改变。 例如：镰刀形细胞贫血病 镰刀形细胞贫血病的血红蛋白（HbS）与正常人的血红蛋白（HbA）相比，发现，两种血红蛋白的差异仅仅来源于一个肽段的位置发生了变化，这个差异肽段是位于β链N端的一个八肽。在这个八肽中，β链N端第6位氨基酸发生了置换，HbA中的带电荷的谷氨酸残基在HbS中被置换成了非极性缬氨酸残基，即蛋白质的一级机构发生了变化。 ②序列的同源性 不同生物中执行相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白质的一级机构具有相似性，称为序列的同源性。最为典型的例子， 例如：细胞色素C（Cyt c） Cyt c是古老的蛋白质，是线粒体电子传递链中的组分，存在于从细菌到人的所有需氧生物中。通过比较Cyt c的序列可以反映不同种属生物的进化关系。亲缘越近的物种，Cyt c中氨基酸残基的差异越小。如人与黑猩猩的Cyt c完全一致，人与绵羊的Cyt c有10个残基不同，与植物之间相差更多。蛋白质的进化反映了生物的进化。 2.蛋白质空间结构与功能的关系 天然状态下，蛋白质的多肽链紧密折叠形成蛋白质特定的空间结构，称为蛋白质的天然构象或三维构象。三维构象与蛋白质的功能密切相关。 ①一级结构与高级结构的关系： 一级结构决定高级机构，当特定构象存在时，蛋白质表现出生物功能；当特定构象被破坏时，即使一级构象没有发生改变，蛋白质的生物学活性丧失。例如：牛胰核糖核苷酸酶A（RNase A）的变性与复性 当RNase A处于天然构象是，具有催化活性； 当RNase A处于去折叠状态时，二硫键被还原不具有催化活性；当RNase A恢复天然构象时，二硫键重新形成，活性恢复。 ②变构效应 变构效应：是寡聚蛋白质分子中亚基之间存在相互作用，这种相互作用通过亚基构象的改变来实现。蛋白质在执行功能是时，构象发生一定变化。 例如：肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合 两种蛋白质有很多相同之处，结构相似表现出相似功能。这两钟蛋白质都含有血红素 辅基，都能与氧进行可逆结合，因此存在着氧合与脱氧的两种结构形式。但是肌红蛋白几乎在任何氧分压情况下都保持对氧分子的高亲和性。血红蛋白则不同，在氧分压较高时，血红蛋白几乎被氧完全饱和；而在氧分压较低时，血红蛋白与氧的亲和力降低，释放出携带的氧并转移给肌红蛋白。
三种分析蛋白结构域(Domains)的方法 1，SMART入门，蛋白结构和功能分析 SMART介绍 SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool) allows the identification and annotation of genetically mobile domains and the analysis of domain architectures. More than 500 domain families found in signalling, extracellular and chromatin-associated proteins are detectable. These domains are extensively annotated with respect to phyletic distributions, functional class, tertiary structures and functionally important residues. Each domain found in a non-redundant protein database as well as search parameters and taxonomic information are stored in a relational database system. User interfaces to this database allow searches for proteins containing specific combinations of domains in defined taxa. For all the details, please refer to the publications on SMART. SMART(，可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。简单点说，就是集合了一些工具，可以预测蛋白的一些二级结构。如跨膜区（Transmembrane segments），复合螺旋区（coiled coil regions），信号肽（Signal peptides），蛋白结构域（PFAM domains）等。 SMART前该知道的 1，SMART有两种不同的模式：normal 或genomic 主要是用的数据库不一样。Normal SMART, 用的数据库 Swiss-Prot, SP-TrEMBL 和 stable Ensembl proteomes。Genomic SMART, 用全基因组序列。详细列表：，一些名词解释 进行时 可以直接用各个数据库蛋白的ID。如Uniprot/Ensembl??ID / Accession number (ACC)。或是直接蛋白序列。运行SMART也可选择signal peptides、PFAM domains等的预测，勾上就是。看下图 SMART结果 运行后的结果用图表表示。其实运行后的结果都有明确的解释。详细请看下面。
蛋白质结构与功能的关系 摘要：蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强！现而今关于蛋白质功能研究还有待发展，一门新兴学科正在发展，血清蛋白组学，生物信息学等！本文仅就蛋白质结构与其功能关系进行粗略阐述。 关键词：蛋白质分子一级结构、空间结构、折叠/功能关系、蛋白质构象紊乱症；分子伴侣正文： 1、蛋白质分子一级结构和功能的关系 蛋白质分子中关键活性部位氨基酸残基的改变，会影响其生理功能，甚至造成分子病(molecular disease)。例如镰状细胞贫血，就是由于血红蛋白分子中两个β亚基第6位正常的谷氨酸变异成了缬氨酸，从酸性氨基酸换成了中性支链氨基酸，降低了血红蛋白在红细胞中的溶解度，使它在红细胞中随血流至氧分压低的外周毛细血管时，容易凝聚并沉淀析出，从而造成红细胞破裂溶血和运氧功能的低下。 另一方面，在蛋白质结构和功能关系中，一些非关键部位氨基酸残基的改变或缺失，则不会影响蛋白质的生物活性。例如人、猪、牛、羊等哺乳动物胰岛素分子A链中8、9、10位和B链30位的氨基酸残基各不相同，有种族差异，但这并不影响它们都具有降低生物体血糖浓度的共同生理功能。 蛋白质一级结构与功能间的关系十分复杂。不同生物中具有相似生理功能的蛋白质或同一种生物体内具有相似功能的蛋白质，其一级结构往往相似，但也有时可相差很大。如催化DNA 复制的DNA聚合酶，细菌的和小鼠的就相差很大，具有明显的种族差异，可见生命现象十分复杂多样。 2、蛋白质分子空间结构和功能的关系 蛋白质分子空间结构和其性质及生理功能的关系也十分密切。不同的蛋白质，正因为具有不同的空间结构，因此具有不同的理化性质和生理功能。如指甲和毛发中的角蛋白，分子中含有大量的α-螺旋二级结构，因此性质稳定坚韧又富有弹性，这是和角蛋白的保护功能分不开的;而胶原蛋白的三股π螺旋平行再几股拧成缆绳样胶原微纤维结构，使其性质稳定而具有强大的抗张力作用 又如细胞质膜上一些蛋白质是离子通道，就是因为在其多肽链中的一些α-螺旋或β-折叠二级结构中，一侧多由亲水性氨基酸组成，而另一侧却多由疏水性氨基酸组成，因此是具有“两亲性”(amphipathic)的特点，几段α-螺旋或β-折叠的亲水侧之间就构成了离子通道，而其疏水侧，即通过疏水键将离子通道蛋白质固定在细胞质膜上。载脂蛋白也具有两亲性，既能与血浆中脂类结合，又使之溶解在血液中进行脂类的运输。 3、折叠/功能关系 体内各种蛋白质都有特殊的生理功能，这与空间构象有着密切的关系。肌红蛋门和血红蛋白是阐述空间结构与功能关系的典型例子。肌红蛋门(Mb))和血红蛋白(Hb)都是含血红素辅基的结合蛋白质。Mb有一条肽链，经盘曲折折叠形成三级结构，整条肽链由A~H8段α螺旋盘曲折叠成为球状，疏水氨基酸侧链在分子内部，亲水氨基酸侧链在分子外部，形成亲水的球状蛋白，血红素辅基位于Mb分子内部的袋状空穴中。Hb有四条肽链，两条β链也有与Mb 相似的A~H8段α螺旋，有两条α链只有7段α螺旋。Hb与Mb的折叠方式相似，也都能与氧进行可逆的结合。Hb的一个亚基与氧结合后可引起构象变化，是另一个亚基更易于与氧结合，这种带氧的亚基协助不带氧的亚基去结合氧的现象称为协同效应。氧与Hb结合后可
二、食品加工中蛋白质功能性质的应用 各种蛋白质都有不同的功能性质，在食品加工过程发挥出不同的功能。根据其功能性质的不同，选定适宜的蛋白质，确定用量，加入到食品中，使之与其它成分如糖、脂肪、水反应，可加工成理想的成品。 (一)以乳蛋白作为功能蛋白质 在生产冰淇淋和发泡奶油点心过程中，乳蛋白起着发泡剂和泡沫稳定剂的作用。乳蛋白冰淇淋还有保香作用。在焙烤食品中加入脱脂乳粉，可以改善面团的吸水性，增大体积，阻止水分的蒸发，控制气体的逸散速度，加强结构性。乳清中的蛋白质，具有较强的耐搅打性，可用作西式点心的顶端配料，稳定泡沫，脱脂奶粉可以作为乳化剂添加到肉糜中去，增强其保湿性。’ (二)以卵类蛋白作为功能蛋白质 卵类蛋白主要由蛋清蛋白和蛋黄蛋白组成。 蛋清蛋白的主要功能是促进食品的凝结、胶凝、发泡和成形。在搅打适当黏度的卵类蛋白质的水分体系时，其中的蛋清蛋白的重叠的分子部分伸展开，捕捉并且滞留住气体，形成泡沫。卵类蛋白对泡沫有稳定作用。用鸡蛋作为揉制糕饼面团混合料时，蛋白质在 气一液界面上形成弹性膜，这时已有部分蛋白质凝结．把空气滞留在面团中，有利于发酵，防止气体逸散，面团体积增大，稳定蜂窝结构和外形。 蛋黄蛋白的主要功能是乳化及乳化稳定性。它常常吸附在油水界面上，促进产生并稳定水包油乳状液。卵类蛋白能促进油脂在其它成分中的扩散，从而加强食品的黏稠度。 鸡蛋在调味汁和牛乳糊中不但起增稠作用，还可作为黏结剂和涂料，把易碎食品黏连在一起，使它们在加工时不致散裂。 (三)以肌肉蛋白质作为功能蛋白质 肌肉蛋白的保水性是影响鲜肉滋味、嫩度和颜色的重要功能性质，也是影响肉类加工质量的决定因素。肌肉中的水溶性肌浆蛋白和盐溶性肌纤蛋白的乳化性，对大批量肉类的加工质量影响极大。肌肉蛋白的溶解性、溶胀性、黏着性和胶凝性，在食品加工中也很重要。如胶凝性可以提高产品强度、韧性和组织性。蛋白的吸水、保水和保油性能，使食品在加工时减少油水的流失量，阻止食品收缩；蛋白的黏着性有促进肉糜结合，免用黏着剂的作用。 (四)以大豆蛋白质作为功能蛋白质 大豆蛋白质具有广泛的功能性质，如溶解性、吸水和保水性、黏着性、胶凝性、弹性、乳化性和发泡性等。每一种性质都给食品加工带来特定的效果。如将大豆蛋白加入到咖啡乳内，是利用其乳化性；涂在冰淇淋表面，是利用其发泡性；用于肉类加工，是利用它的保水性、乳化性和胶凝性。加在富含脂肪的香肠、大红肠和午餐肉中，是利用它的乳化性，提高肉糜问的黏性等等。因其价廉，故应用得非常广泛。
蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链，天然蛋白质分子有自己特有的空间结构，称为蛋白质构象。 蛋白质结构的不同组织层次：一级结构指多肽链的氨基酸序列。二级结构是指多肽链借助氢键排列成特有的α螺旋和β折叠片段。三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。球状构象给出最低的表面积和体积之比，因而使蛋白质与周围环境的相互作用降到最小。四级结构是指寡居蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。二、三、四级结构为蛋白质的高级结构。蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素：1。与溶剂分子（一般是水）的相互作用。2。溶剂的PH值和离子组成。3。蛋白质的氨基酸序列。后一个是最重要的因素。 （一）蛋白质折叠的热力学假说 蛋白质的高级结构由其一级结构决定的学说最初由Christian B. Anfinsen于1954年提出。在1950年之前，Anfinsen一直从事蛋白质结构方面的研究。在进入美国国立卫生研究所（NIH）以后，继续从事这方面的研究。Anfinsen和两个博士后Michael Sela、 Fred White在研究中发现，使用高浓度的巯基试剂——β- 巯基乙醇（β- mercaptoethanol）可将二硫键还原成自由的巯基，如果再加入尿素，进一步破坏已被还原的核糖核酸酶分子内部的次级键，则该酶将去折叠转变成无任何活性的无规卷曲。对还原的核糖核酸酶的物理性质进行分析的结果清楚地表明了它的确采取的是无规卷曲的形状。 在成功得到一种去折叠的核糖核酸酶以后，Anfinsen 着手开始研究它的重折叠过程。考虑到被还原的核糖核酸酶要在已被还原的8个Cys残基上重建4对二硫键共有105 种不同的组合，但只有一种是正确的形式，如果决定蛋白质构象的信息一直存在于氨基酸序列之中，那么，最后重折叠得到的总是那种正确的形式。否则，重折叠将是随机的，最后只能得到少量的正确形式。Anfinsen 的重折叠实验还是比较顺利的，他通过透析的方法除去了导致酶去折叠的尿素和巯基乙醇，再将没有活性的酶转移到其生理缓冲溶液之中，在有氧气的情况下于室温放置，以使巯基能重新氧化成二硫键。经过一段时间以后，发现核糖核酸酶活性得以恢复，这意味着它原来的构象恢复了。由于上述过程没有细胞内任何其他成分的参与，完全是一种自发的过程，因此，有理由相信此蛋白质正确折叠所需要的所有信息全部存在于它的一级结构之中。在此基础上，Anfinsen提出了蛋白质折叠的热力学假说（thermodynamic hypothesis）。根据此假说，一个蛋白质的天然三维构象对应于在生理条件下其所处的热力学最稳定的状态。热力学稳定性由组成的氨基酸残基之间的相互作用决定，于是蛋白质的三维构象直接由它的一级结构决定。 （二）蛋白质高级结构对高级结构形成的影响 1．二级结构 蛋白质的二级结构由氢键维持。包括α螺旋、β折叠、β转角和无规卷等。α螺旋是一种重复性结构，螺旋中每个α-碳的Φ和Ψ分别为-57o和-47o附近。
蛋白质的功能性质（Functional Properties of Protein） 蛋白质的功能性质是指食品体系在加工、贮藏、制备和消费过程中蛋白质对食品产生需要特征的那些物理、化学性质。各种食品对蛋白质功能特性的要求是不一样的（表2-3）。 表2-2 食品体系中蛋白的功能作用 表2-3 各种食品对蛋白质功能特性的要求
食品的感官品质是由各种食品原料复杂的相互作用产生的。例如蛋糕的风味、质地、颜色和形态等性质，是由原料的热胶凝性，起泡、吸水作用、乳化作用、粘弹性和褐变等多种功能性组合的结果。因此，一种蛋白质作为蛋糕或其他类似产品的配料使用时，必须具有多种功能特性。动物蛋白，例如乳（酪蛋白）、蛋和肉蛋白等，是几种蛋白质的混合物，它们有着较宽范围的物理和化学性质，及多种功能特性，例如蛋清具有持水性、胶凝性、粘合性、乳化性、起泡性和热凝结等作用，现已广泛地用作许多食品的配料，蛋清的这些功能来自复杂的蛋白质组成及它们之间的相互作用，这些蛋白质成分包括卵清蛋白、伴清蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶和其他清蛋白。然而植物蛋白（例如大豆和其他豆类及油料种子蛋白等）；和乳清蛋白等其他蛋白质，虽然它们也是由多种类型的蛋白质组成，但是它们的功能特性不如动物蛋白，目前只是在有限量的普通食品中使用。 一、蛋白质的界面性质(Interficial properties) 泡沫或乳化体系类的食品，一般要利用到蛋白质的起泡性、泡沫稳定性和乳化性等功能，例如焙烤食品、甜点心、啤酒、牛奶、冰淇淋、黄油和肉馅等，这些分散体系，除非有两亲物质存在，否则是不稳定的。蛋白质是两亲分子，它能自发地迁移到空气-水界面或油-水界面，在界面上形成高粘弹性薄膜，其界面体系比由低分子质量的表面活性剂形成的界面更稳定。 1．乳化性质 许多食品属于乳胶体（牛奶、乳脂、冰淇淋、豆奶、黄油、干酪、蛋黄酱和肉馅），蛋白质成分在稳定这些胶态体系中通常起着重要的作用。天然乳胶体靠脂肪球“这种“膜”由三酰甘油、磷脂、不溶性脂蛋白和可溶性蛋白的连续吸附层所构成。蛋白质一般对水/油（W/O）型乳胶液的稳定性较差。这可能是因为大多数蛋白质的强亲水性使大量被吸附的蛋白质分子位于界面的水相一侧。 蛋白质的表面活性不仅与蛋白质中氨基酸的组成、结构、立体构象、分子中极性和非极性残基的分布与比例，二硫键的数目与交联，以及分子的大小、形状和柔顺性等内在因素有关，而且与外界因素，甚至加工操作有关。凡是能影响蛋白质构象和亲水性与疏水性的环境因素，诸如pH、温度、离子强度和盐的种类、界面的组成、蛋白质浓度、糖类和低分子量表面活性剂，能量的输入，甚至形成界面加工的容器和操作顺序等，都将影响蛋白质的表面活性。蛋白质在搅打和均质时形成泡沫和乳状液的关键在于蛋白质能自发和快速的吸附在新形成的界面（空气-水或油-水）上。
第二章蛋白质的结构与功能 复习测试 （一）名词解释 1. 肽键 2. 结构域 3. 蛋白质的等电点 4. 蛋白质的沉淀 5. 蛋白质的凝固 （二）选择题 A型题： 1. 天然蛋白质中不存在的氨基酸是： A. 胱氨酸 B. 谷氨酸 C. 瓜氨酸 D. 蛋氨酸 E. 丝氨酸 2. 下列哪种氨基酸为非编码氨基酸： A. 半胱氨酸 B. 组氨酸 C. 鸟氨酸 D. 丝氨酸 E. 亮氨酸 3. 下列氨基酸中哪种氨基酸无 L型与D型氨基酸之分： A. 丙氨酸 B. 甘氨酸 C. 亮氨酸 D. 丝氨酸 E. 缬氨酸 4. 天然蛋白质中有遗传密码的氨基酸有： A. 8种 B. 61种 C. 12种 D. 20种 E. 64种 5. 测定100克生物样品中氮含量是2克，该样品中蛋白质含量大约为： A. 6.25% B. 12.5% C. 1% D. 2% E. 20% 6. 蛋白质分子中的肽键： A. 是一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基形成的 B. 是由谷氨酸的γ-羧基与另一个氨基酸的α-氨基形成的 C. 氨基酸的各种氨基和各种羧基均可形成肽键 D. 是由赖氨酸的ε-氨基与另一分子氨基酸的α-羧基形成的 E. 以上都不是 7. 多肽链中主链骨架的组成是 A. –CNCCNCNCCNCNCCNC- B. –CCHNOCCHNOCCHNOC- C. –CCONHCCONHCCONHC- D. -CCNOHCCNOHCCNOHC- E. -CCHNOCCHNOCCHNOC- 8. 蛋白质的一级结构是指下面的哪一种情况： A. 氨基酸种类的数量 B. 分子中的各种化学键 C. 多肽链的形态和大小 D. 氨基酸残基的排列顺序 E. 分子中的共价键 9. 维持蛋白质分子一级结构的主要化学键是： A. 盐键 B. 氢键 C. 疏水键 D. 二硫键 E. 肽键 10. 蛋白质分子中α-螺旋构象的特点是： A. 肽键平面充分伸展 B. 靠盐键维持稳定 C. 螺旋方向与长轴垂直 D. 多为左手螺旋 E. 以上都不是 11. 下列哪种结构不属于蛋白质二级结构： A. α-螺旋 B. 双螺旋 C. β-片层 D. β-转角 E. 不规则卷曲
蛋白质一级结构的测定 1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量 2.拆分蛋白质分子的多肽链 非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍 共价二硫桥：氧化剂或还原剂 3.断开多肽链内的二硫桥 过甲酸氧化法常用试剂过甲酸 巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸 4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解 酸水解：常用hcl,水解后除去 碱水解：用于测定色氨酸含量。很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。 5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端 N-末端分析： ①二硝基氟苯DNFB ②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高 ③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化 ④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大） C-末端分析： ①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸 ②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇 ③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。Y可以作用于任何一个C末端残基 6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套 ①酶裂解法：肽链内切酶。胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶 胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键 ②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。溴化氰：断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键羟胺断裂肽段的分离纯化 7.测定各肽段的氨基酸序列 Edman化学降解法：PITC与多肽链的游离氨基作用，测定任何非封闭的多肽蛋白质序列仪酶降解法：利用外肽酶（氨肽酶和羧肽酶）逐个向里切 质谱法，气质联用法 根据核苷酸序列的推定法 8.重建完整多肽链的一级结构 9.确定半胱氨酸残基之间形成的S-S交联桥的位置 采用胃蛋白酶水解原来的含二硫桥的蛋白质，所得的肽段混合物用对角线电泳进行分离，用茚三酮反应鉴定