RNA pull-down实验
定义:
使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
RNA Pull Down实验流程。
注释:① 目标RNA生物素标记;② 磁珠富集RNA;③ RNA结合蛋白孵育;④ RNA结合蛋白洗
脱;⑤ WB或者MS检测
常见问题:
问题1:RNA 降解
可能原因:1)无核酸酶的环境被破坏;
2)体外转录的RNA探针降解
解决办法:1)清洗和使用新开的离心管和试剂等
2)RNA探针合成后,电泳检测其长度和浓度
问题2:RNA结合蛋白的亲和力不够:
可能原因:1)结合缓冲环境没有优化
2)裂解不完全
3)磁珠用量不足
4)RNA探针用量不足
解决办法:1)优化孵育时间、温度、盐浓度等条件
2)增加裂解液和蛋白上样量的比例
3)增加裂解液
4)增加磁珠用量
5)增加探针用量
6)确定生物素和链霉亲和素效率
问题3:RNA结合蛋白没有结合
可能原因:1)靶蛋白量不足
2)缓冲体系不对
3)RNA探针和蛋白的亲和力本来就低
解决办法:1)增加上样蛋白量
2)应用低盐体系
3)加入交联试剂
问题4:结合的非特异性高
可能原因:1)缓冲环境没有优化
2)缓冲环境严谨性低
3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化解决方法:1)优化孵育时间温度盐浓度等条件
2)使用严谨性高的缓冲体系
3)调低RNA探针和样品的比例
4)提高裂解液的量
问题5:WB信噪比高
可能原因:1)阳性信号率低
2)一抗效率低
3)蛋白没有充分溶解
解决方法:1)增加二抗的量
2)用敏感度的化学发光液
3)用细胞裂解液预孵一抗
4)增加样品的量
5)确定有没有其他可能的结合情况
6)增加裂解液用量