43卷 6期2003年12月
微生物学报Acta Microbiologica Sinica Vol.43December
No.6
2003
基金项目:国家/863计划0(2002A2104101);国家自然科学基金(30370048)
*
通讯作者。Tel:86-571-86971287;Fax:86-571-86971634;E -mail:minhang@z https://www.doczj.com/doc/ab7970091.html,
作者简介:夏 颖(1977-),女,安徽宿州人,博士研究生,从事环境微生物研究。E -mail:xiaying7702@https://www.doczj.com/doc/ab7970091.html, 收稿日期:2003-01-28,修回日期:2003-07-31
一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析
夏 颖 闵 航
*
(浙江大学生命科学学院 杭州 310029)
摘 要:由石油污染土壤中分离到一株能以多环芳烃(菲、芴、萘)为唯一碳源的细菌,经形态观察、生理生化(Biolog -GN)和G+C mol%分析,鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌(Sphin gomonas paucimobilis )。与16S rDNA 序列同源性的比较进一步确证了鉴定结果。经菲诱导后的细菌谷胱甘肽S -转移酶(Glutathione S -transferase,GST)酶活明显高于未诱导前,表明谷胱甘肽S -转移酶可能与多环芳烃的降解有关。根据该酶基因的同源性序列设计引物,PCR 扩增出编码谷胱甘肽S -转移酶基因片段,进一步证实在该菌中有GST 的存在。测序后基于编码GST 的基因所进行的系统发育分析表明,该多环芳烃降解菌与其它多环芳烃降解菌在进化上亲缘关系较近。关键词:鞘氨醇单胞菌,谷胱甘肽S -转移酶,系统发育
中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2003)06-0691-07
多环芳烃(Poly -aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类广泛分布的化学污染物,因其潜在的毒性、致癌性及致畸致变作用引起了人们的极大关注[1]
。目前对多环芳烃的处理中,微
生物降解被视为一种行之有效且不会造成二次污染的方法[2]
,因而对可降解多环芳烃污染微生物的研究也越来越多。近年来,对可降解芳香族化合物细菌中的谷胱甘肽S -转移酶(Glutathione S -transferases,GSTs)的研究逐渐成为热点。GST 可以催化谷胱甘肽与异生物质的结合从而达到解毒的目的,并且许多编码GST 的基因位于降解操纵子上,又使它
成为十分有用的报告基因[3]。Lloyd -Jones 等[4]
认为编码GST 的基因可能广泛存在于PAH 降解菌中并且可以成为检测这类菌的分子工具。
目前国内对细菌GST 的研究尚为少见,仅蔡宝立等[5]对细菌中二氯甲烷脱氯酶P GST 进行过研究。本文从石油污染土壤中分离到的一株多环芳烃(芴、萘、菲)降解菌,其对菲
的降解能力已另有报道[6]
,这里报道所分离菌株的GST 和系统发育进化地位及其在菲降解中所起的可能作用。
1 材料和方法
111 样品来源和培养基成分
分离样品采自浙江大学华家池校区实验工厂附近被石油污染的土壤。无机盐(MM)
[7]
培养基:每升含MgSO 4#7H 2O 012g,CaCl 20102g,KH 2PO 4110g,K 2HPO 4
110g,NH 4NO 3110g,FeCl 30105g,pH 710。菲溶于氯仿后抽滤灭菌,加到预先灭菌的MM 培
692微生物学报43卷
养基中。
加富MM培养基:在MM培养基中分别加1000mg P L酵母膏和1000mg P L蛋白胨,用于菌株的平板培养和斜面保存。
112主要试剂和仪器
菲为Fluka公司产品,纯度为99%。用于PCR扩增的全套试剂及扩增引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。GST酶测试试剂盒购自Pharmacia公司。PCR仪的型号为PE公司PTC-200型。
113分离菌株生理鉴定
在Biolog96孔平板上,除对照孔不含碳源外,每孔都含有Tetrazolium violet(四唑紫)缓冲营养培养基和不同碳源[8]。被鉴定的菌细胞悬浮于微孔中,培养72h后用Biolog细菌自动鉴定仪检测供试菌株的代谢指数。
114分离菌株G+C mol%
细菌总DNA提取采用氯仿苯酚混合提取法制备,DNA溶于011@SSC溶液中。确定Tm采用热变性解链法。G+C mol%含量按照经验公式011@SSC G+C%=2144(Tm-5319)计算[9]。
115分离菌株16S rDNA和GST基因的PCR扩增和序列测定
1151116S rDNA扩增和序列测定:16S rDNA引物:5c-AGAGTTTGATCC TGGC TC AG-3c;5c-AAGGAGGTGATCC AGCCGC A-3c。50L L反应体系中含有012mmol P L dNTPs,016mmol P L引物,1P10体积的10@PCR缓冲液,115mmol P L MgCl2,115U Taq酶,以及100ng左右的模板DNA。反应条件为95e5min;94e1min,55e1min,72e2min,29个循环;72e10min。取5L L反应液进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物的测序工作由上海申友生物技术公司完成。11512编码GST的基因扩增和序列测定:依照GenBank上已有的GST基因序列设计引物[4,10]:5c-GATTTCC TGACGGTC AAC(T)CC-3c;5c-GCCCAGC ATC ACGAACAGATAG-3c。50L L 反应体系其中含有012mmol P L dNTPs,016mmol P L引物,1P10体积的10@PCR缓冲液, 115mmol P L MgCl2,115U Taq酶,以及100ng左右的DNA。反应条件为95e5min;94e 1min,5715e1min,72e1min,35个循环;72e10min。琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的测序工作由上海申友生物技术公司完成。
116系统发育树构建
采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株的序列,与本文所测得序列一起输入Clustalx118程序进行DNA同源序列排列,并经人工仔细核查。在此基础上,序列输入Phylip316软件包,以简约法构建系统发育树。使用Kimura2-parameter法,系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap)500次重复检测, DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
117菲对分离菌株GST活性影响
使用试剂盒GST Detection Module。原理如下:在GST酶催化下,GST酶的底物1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)与谷胱甘肽发生反应,其产物为一种共价物,可以用紫外分光光度计在340nm处检测,依据其吸收值的增长曲线,可评估粗制酶液的GST活性。
图1 菌株ZX4细胞形态(15000@)
Fig.1 The cell morphology of
s train ZX4(15000@)
2 结果
211 分离菌株的细胞形态学
由分离样品中分离到一株以菲为唯一碳源的菌株,编号为ZX4。该菌菌体细胞为杆状,大小为(0120~0136)L m @(0140~0180)L m,具端生或侧生单根鞭毛(图1)。该菌培养特征为菌落呈亮黄润泽,较小,圆形,边缘齐整,表面光滑,易挑起。革兰氏染色阴性,过氧化氢酶阴性。212 分离菌株生理鉴定
将ZX4菌株细胞悬浮液接种到95种碳源的Biolog
板微孔中,培养72h 后,测定ZX4菌株代谢指数。经B -i olog 细菌鉴定系统分析代谢指数(表1),ZX4菌株属少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis )。
表1 菌株ZX 4对95种碳源的利用
Table 1 Uti li zati on of 95carbon subs trates by s train ZX4using Biolog microplate
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6期夏 颖等:一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析
213 分离菌株的G+C mol%含量
由热扫描曲线得出菌株ZX4的Tm 值为80e 。由公式计算得DNA 中的G+C mol%为6315%。符合鞘氨醇单胞菌属(Sphingomons )的G+C mol%含量特征。214 分离菌株16S rDNA 和GST 基因的PCR 扩增和序列分析
21411 PCR 扩增和测序结果:PCR 扩增结果显示ZX4菌株GST 基因的PCR 产物长度约为350bp 左右,16S rDNA PC R 产物约为1500bp 左右,符合预期产物长度。
16S rDNA 序列在GenBank 中登录号为AY212803,GST 基因部分序列如下:CCCC TG -GTCCC GGCCC TCACCC TGGAC AGC GGCGAGACCC TGACCGAGAACCCC GCC ATCCTGC TGTACAT -AGCCGACC AGAACCCCGCGTC TGGCC TGGCGCCGGCCGAAGGC AGCC TCGATCGTTACCGAC TGC -TGAGCCGTC TC AGC TTCC TCGGTTCC GAATTCCAC AAGGCATTCGTGCCGTTGTTCGC CCCCGGC A -CTTCCGAC GAAGCGAAGGCGGCGGC CGCGGAATC GGTC AAGAACC ACC TCGCCGC GC TCGATAA -GGAATTGGCCGGGC GGGACC ACTATGC TGGC AATGCTTTCAGTGTTGCC GACATC TATC TGTTCGT -GATGTGGGCAA
21412 序列同源性比较:将两基因的序列结果输入GenBank 以BLAST 进行序列同源性比较,结果显示16S rDNA 序列与鞘氨醇单胞菌属的多种细菌具有较高同源性,与少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis )UT26的同源性高达98%。而GST 基因扩增结果也与多株细菌的GST 基因序列具有较高的同源性,与少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas pauci -mobilis )EPA505,溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aro maticivorans )F199和Sphingomonas chungbukensis (原Pseudomonas sp.)DJ77分别具有94%、77%和73%的同源性,进一步说明测得序列应为目的序列。
21413 分离菌株与同种不同菌株之间的系统发育分析(基于16S rDNA 序列):图2显示基于16S rDNA 序列的ZX4菌株与少动鞘氨醇单胞菌各菌株之间的系统发育树。由该图可见ZX4菌株与菌株B PSI -3、E PA505和UT26均有较高相似性,而与ATCC29837、GIFU2395菌株则相似性较低,
遗传距离也较远。
图2 基于16S rD NA 序列的ZX4菌株与少动鞘氨醇单胞菌菌株系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZX4and s trains of Sphingo monas pauc imobilis based on 16S rD NA sequence (Genetic dis tances between strain ZX4and s trains of Sphingo monas pauc imobilis are s hown in brackets)
215 基于GST 基因的系统发育树构建
表2示构建系统发育树所用的菌株,以甲基杆菌属(Methylobacterium )菌株DM4的
694微 生 物 学 报43卷
Dcm A P GST 基因为外群构建的系统发育树见图3。
表2 用于建立系统进化树的菌株
Table 2 The related s trains used in phylogenetic tree
Strain
Degradation substrate Acces sion number Protein denomination
Alcali gene s faecalis
Phenanthrene AB024945GST Sphingomonas paucimobilis EPA505Four ri ng PA H
AF001779GST Sphingomonas aromatici vorans F199Benzene,naphthalene,toluene AF039717BphK Burkholderia s p.s train LB400Polyc hlorinated biphenyl
X7650011BphK Cycloclastic us oligotro phus RB1Toluene,naphthalene,phenanthrene U51165XylK Sphingomonas chungbukensis DJ 77Poly -aromatic hydrocarbons AF001103PhnC Sphingomonas s p.s train RW53,6-dic hloro -2-methoxybenzoate AJ224977Orf3Burkholderia ce pacia AC11002,4,5-trichlorophenoxyace tic acid U11420Orf3Sphingomonas paucimobilis SYK -65,5c -dehydrodivanillate D11473LigF Proteus mirabilis )U38482GSTB1-1E .coli K -12strain J M 105)
D38497GST Methylobac terium s p.s train D M4Dichloromethane M 32346Dc mA Sphingomonas chloro phenolica
Tetrachlorohydroquinone
M 98559
PcpC
图3 基于GST 基因构建的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree based on the GST gene s equences
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6期夏 颖等:一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析
图4菲诱导对菌株ZX4GST活性的影响Fig.4Effec t of phenanthrene induction
on GST ac tivity of strai n ZX4216GST测定
由图4可见,菌株ZX4的GST具有与1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)结合的活性,且经菲诱导后,其GST活性明显高于诱导前。
3讨论
本文中ZX4菌株由形态特征,生理生化(B-i olog鉴定)及GC含量可鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)[11,12],但ZX4菌株与该种各菌株之间的系统发育分析却揭示同种之间的各菌株相似性存在较大差异,这种情况在Nalin等[13]鉴定UT26菌株时也曾有提及,虽然UT26与ATCC29837在系统进化关系上
较远,但是依据其表型的相似性仍将其认为是同一种。这种表型与分子指标之间不一致的原因尚不清楚,有可能是在长期的进化过程中,某些菌株内的进化分子中出现较大突变。ZX4菌株中GST可以和CDNB结合,具有一般GST的特性。GST在经菲诱导后其酶活明显提高表明GST可能对降解物具有脱毒作用[14,15]。Lloyd-Jones等[5]认为编码GST的基因可能是广泛存在于PAH降解菌中,本文ZX4菌株中GST基因的扩增与序列测定进一步证实了其推论。
由基于GST基因构建的系统发育树可见,ZX4菌株与同样可降解多环芳烃的菌株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)EPA505、Sphingomonas chungkuensis DJ77、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)F199,寡营养解环菌(C ycloclasticus oligotro-phus)RB1、粪产碱菌(Alcaligenes facealis)等明显聚为一群,并且与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、大肠杆菌(E.coli)K-12的JM105也在同一类群中。Hofer等[16]推断它们是同源的,并且这一类GST有可能起源自其中的E.coli K-12的JM105和Proteus mirabilis,系统发育进化树也进一步证实了这种推论。Sphingomonas paucimobilis E PA505的GST、Sphin-gomonas chungkuensis DJ77的PhnC和Sphingomonas aromaticivorans F199的BphK在基因排列上几乎都有这样一个共同点,即它们的下游是水解酶(BphD,PhnD)和外双加氧酶(BphE, PhnC),上游则是芳香环羟化双或单双加氧酶[16,17]。本文ZX4菌株是否具有与此相同的基因排列有待进一步证实。另外与ZX4菌株同属鞘氨醇单胞菌属的RW5、SYK-6等菌株却在其它较远分支,这可能是由于GST具有脱毒作用,因而在进化过程中出现了自然选择的定向性,导致具有相似多环芳烃降解功能的菌株也具有相似的GST序列。
参考文献
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Identification ,Cloning and Sequencing of GS T Gene of
Bacteriu m Degrading Poly -aromatic Hydrocarbons
Xia Ying Min Hang
*
(Colle ge o f Li fe Sciences ,Zhe j iang U nive rsity ,Hangzhou 310029,China )
Abstract :A bacterium (designated strain ZX4)able to degrade poly aromatic hydrocarbons was iso -lated from oi-l contaminated soil.Based on analysis of the 16S rDNA sequence,whole cell fatty ac -id,and Biolog -GN,the strain was identified as Sphingomonas paucimobilis .The detection of GST
(Glutathione S -transferase)indicated that the GST from the strain had the activity of c onjugating with CDNB and it maybe rela te with degradation of PAHs.The PCR product of GST gene from the strain confirmed its presence.Phylogeny analysis based on gst sequence indica ted that the strain was relatively close with the strain which can degrade PAH like wise.Key words :Sphingomonas paucimobilis ,GST,Phylogeny
Foundati on item:Chi nese National Programs for High Technology Res earch and Devel opment (2002A2104101)
*
Corresponding author.Tel:86-571-86971287;Fax:86-571-86971634;E -mail:mi nhang@https://www.doczj.com/doc/ab7970091.html,
Received date:01-28-2003
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6期夏 颖等:一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析
第七章多环芳烃和非苯芳烃 一、 写出下列化合物的构造式。 1、α－萘磺酸 2、 β－萘胺 3、β－蒽醌磺酸 SO 3H NH 2 C C O O SO 3H 4、9－溴菲 5、三苯甲烷 6、联苯胺 Br CH NH 2 二、 命名下列化合物。 1. 2. C C O 3. SO 3H NO 2 4. CH 2 5. 6. CH 3 CH 3 OH NO 2 二苯甲烷 对联三苯 1，7－二甲基萘 三、 推测下列各化合物发生一元硝化的主要产物。 SO 3H SO 3H 1. HNO 3H 2SO 4 O 2N SO 3H NO 2 + 2. CH 3 H 2SO 4 HNO CH 3 NO 2
3. OCH 3H 2SO 4 NO 2 OCH 4. CN CN NO 2 3H 2SO 4 NO 2 CN 四、 回答下列问题： 1，环丁烯只在较低温度下才能生成，高于350K 即（如分子间发生双烯合成）转变为二聚体 , 已知它的衍生物二苯基环丁二烯，有三种异构体。上述现象说明什么？写出二苯环丁烯三种异构体的构造式。 解：环丁二烯π－电子为四个，具有反芳香性，很不稳定，电子云不离域。三种二苯基环丁二烯结构如下： Ph Ph Ph Ph Ph Ph 2，1，3，5，7－环辛四烯能使高锰酸钾水溶液迅速褪色，和溴的四氯化碳溶液作用得到C 8H 8Br 8。 （a 这两个共振结构式表示？ 解：不可以，因为1，3，5，7－辛环四烯不具有离域键，不能用共振结构式表示。 （c ）,用金属钾和环辛四烯作用即得到一个稳定的化合物2K +C 8H 8(环辛四烯二负离子)，这种盐的形成说明了什么？预期环辛四烯二负离子将具有怎样的结构？ 解：环辛四烯二负离子具有芳香性，热力学稳定，其结构为：
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/ab7970091.html, 园林废弃物中高效降解菌的分离与鉴定 作者：周童袁泽斌万可牟昌红王从梅欧阳秀琴王波 来源：《天津农业科学》2018年第10期 摘要：为了更好地对园林废弃物进行资源化利用，试验以堆肥腐熟后的园林废弃物作为 供试材料，进行其菌株的分離和鉴定。通过细菌16S rDNA测序分析，鉴定出21株细菌，分 属于3门5纲7目10科13种，其中，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）分别鉴定出4种、6种和3种；通过真菌rDNA ITS 测序分析，鉴 定出9株真菌，分属于1门（子囊菌门）2纲2目2科3属5种，其中青霉菌属（Penicillium）鉴定出3种，曲霉属（Aspergillus）和短梗霉属（Aureobasidium）各鉴定出1种。 关键词：园林废弃物；菌株；分离；鉴定 中图分类号：S961.6 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.10.001 Abstract： In order to make better use of garden wastes， the experiment was conducted to isolate and identify the strains from the garden wastes composting. According to the bacterial 16S rDNA sequencing analysis， 21 bacteria strains were identified， which were belonged to 3 phyla，5 classes， 7 orders， 10 families and 13 species. Among the three phyla， the bacteria of Firmicutes， Proteobacteria， Actinobacteria were identified 4 species， 6 species， and 3 species，respectively. According to fungal rDNA ITS sequencing analysis， 9 fungi strains were identified，which were belonged to 1 phylum （Ascomycota）， 2 classes， 2 orders， 2 families， 3 genuses， 5 species. Among the three genuses， the fungi of Penicillium， Aspergillus， and Aureobasidium were identified 3 species， 1 species， and 1 species， respectively. Key words： garden waste； strains； isolation； identification 随着城市绿化建设的飞速发展以及人们对生态环境要求的提高，园林废弃物的数量快速增加，焚烧、填埋、粉碎粗回收等非资源化的处理方式既带来了严重的环境问题[1]，同时也造 成了资源的浪费。大多数园林废弃物含有丰富的有机质，部分地区通过堆肥使其形成基质重新应用于园林和城市绿化，对土壤有很好的改良作用，是一种变废为宝的科学手段，一方面降低了对自然环境的污染，另一方面也节约了资源，是一种适合可持续发展的处置方式。 目前，处理园林废弃物堆肥的主要模式是参照农业废弃物的堆肥方式，然而，相较于一般的农业废弃物，园林废弃物中有更加丰富的、难以降解的木质纤维素，主要存在于植物细胞壁的微管组织中，纤维素分子链聚集成的微纤丝相互交织镶嵌排列形成结晶相和非结晶相，该结构具有超强的防御作用，化学试剂难以有效接触纤维素表面[2]，降解速率低，严重阻碍以园 林废弃物为原料的堆肥处理进程。
第26卷第9期 2006年9月 环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circu m stantiae Vol .26,No .9Sep.,2006 基金项目:国家自然科学基金项目(No .20277001);安徽省优秀青年基金项目(No .04041067) Supported by the Nati onal Natural Science Foundati on of China (No .20771001)and Excellent Youth Foundati on of Anhui Pr ovince (No .04041067) 作者简介:吴祥为(1978—),男,讲师(硕士),E 2mail:wx wahau@ahau .edu .cn ;3通讯作者(责任作者),E 2mail:ri m aohua@ahau .edu .cn B i ography:WU Xiang wei (1978—),male,lecturer,E 2mail:wx wahau@ahau .edu .cn;3Correspond i n g author ,E 2mail:ri m aohua@ahau .edu .cn 吴祥为,花日茂,操海群,等.2006.毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定[J ].环境科学学报,26(9):1433-1439 W u X W ,Hua R M ,Cao H Q,et al .2006.Is olati on,identificati on and degradati on 2efficiency measure ment of chl or pyrifos 2degradaing bacteria [J ].Acta Scientiae Circum stantiae,26(9):1433-1439 毒死蜱降解菌的分离鉴定与降解效能测定 吴祥为1 ,花日茂 1,3 ,操海群1,汤 锋1,李学德1,岳永德 2 1.安徽农业大学资源与环境学院,安徽省“农产品安全”重点实验室,合肥230036 2.国际竹藤网络中心,北京100102 收稿日期:2005208201 修回日期:2006204214 录用日期:2006204229 摘要:取毒死蜱废水处理系统出口处的污泥进行驯化培养,分离出能降解毒死蜱的3株高效降解菌株B 、D 1和D 3,对降解效果最好的D 3菌株经中科院微生物研究所鉴定为玫瑰红红球菌(R hodococcus rhodochrous );3株菌株的生长情况及对毒死蜱的降解动力学研究表明,B 菌株在第3天繁殖增量达到最大,D 1、D 3菌株在第4天繁殖增量达到最大,B 、D 1和D 3菌株的最适宜生长温度都是在30℃;采用10mg ?L -1毒死蜱作为唯一碳源时,B 、D 1和D 3菌株对毒死蜱的降解速率分别为0.0543、0.0479和0.0620h -1;对于浓度为10mg ?L -1的毒死蜱,D 3菌投入的初始菌量 OD 223为0.4是最适宜的;D 3菌对不同初始浓度的毒死蜱降解表明,初始浓度增大,降解速率降低,半衰期延长. 关键词:毒死蜱;分离鉴定;降解;高效液相色谱 文章编号:025322468(2006)0921433207 中图分类号:X172 文献标识码:A Isol a ti on,i den ti f i ca ti on and degrada ti on 2eff i c i ency m ea surem en t of chlorpyr i fos 2 degrada i n g bacter i a WU Xiang wei 1 ,HUA R i m ao 1,3 ,CAO Haiqun 1,T ANG Feng 1,L I Xuede 1,Y UE Yongde 2 1.College of Res ources and Envir onment Anhui Agricultural University,The Key Laborat ory of Anhui Agri 2f ood Safety,Hefei 230036 2.I nternati onal Centre for Ba mboo &Rattan,Beijing 100102 Rece i ved 1August 2005; rece i ved in revised f or m 14Ap ril 2006; accepted 29Ap ril 2006 Abstract:Three bacterial strains that had a capability t o utilize chl or pyrif os as the s ole carbon and energy s ourceswere is olated fr om the sludge .Based on the mor phol ogy and physi o -bi ochem ical p r operties,the strain D 3which had the best degradati on capability t o chl or pyrif os was identified as Rhodococcus rhodochrous by I nstitute of M icr obi ol ogy Chinese Academy of Sciences .The bi omass got t o the maxi m um when strain B was cultivated f or 3d,however strains D 3and D 1need 4d .The op ti m al cultivating te mperature of all the strains was 30℃.I n aqueous s oluti on of chl or pyrif os at the concentrati on of 10mg ?L -1,the degradati on rate constants of strains B,D 1and D 3utilizing chl or pyrif os as the s ole carbon s ource were 0.0479,010543and 010620h -1,res pectively .It was op ti m al that the OD 223of strain D 3s oluti on attained 0.4for the degradati on of chl or pyrifos at the concentrati on of 10mg ?L -1.The results als o showed that the degradati on efficiency of the strain D 3t o chl or pyrif os decreased with initial concentrati on of chl or pyrif os increasing .Keywords:chl or pyrif os;is olati on and identificati on;degradati on;HP LC 1 引言(I ntr oducti on ) 化学农药主要是人工合成的生物外源化学物质,许多类型通常不易被生物降解,故称之为顽固性化合物(Recalcitrants )(王保军等,1998).大量研究证实微生物对土壤和水环境中的农药降解和污染消除起着重要作用,且已分离到一些能降解或转 化农药的微生物类群. 毒死蜱(chl or pyrifos ),化学名称:O,O —二乙基—O —(3,5,62三氯—22吡啶基)硫逐磷酸酯,是美国陶氏化学公司(Dow Che m ical Co .)于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂,被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治(刘乾开,1993;吴慧明等,2003).目前,国内外关于毒死蜱的
多环芳烃(PAHs)在淡水水体中的迁移转化规律 1 概述 多环芳烃( Polycyclic Aromatic Hydrocarbons ,简称PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起的一类化合物,具有高脂溶性和相对低的水溶性,具有“致癌、致畸和致基因突变”（目前已发现的致癌性多环芳烃及其衍生物超过400 种）作用的持久性有机污染物( Persistent Organic Pollutant s ,POPs) 。这一类物质由于高毒性、低流动性和难降解性使其在环境保护领域备受关注。美国EPA优先控制名单中确定了16种PAHs作为优先控制污染物，我国也将7 种多环芳烃列入“中国环境优先控制污染物”黑名单。PAHs由于化石燃料燃烧、机动车、垃圾焚烧、精炼油、焦炭和沥青生产以及铝的生产等人类活动而广泛分布于环境中。多环芳烃在环境中大多数是以吸附态和乳化态形式存在，一旦进入环境，便受到各种自然界固有过程的影响，发生变迁。通过复杂的物理迁移、化学及生物转化反应，在大气、水体、土壤、生物体等系统中不断变化，改变分布状况。处在不同状态、不同系统中的多环芳烃则表现出不同的变化行为。多环芳烃进入大气后，可通过化学反应、降尘、降雨、降雪等过程进入土壤及水体中。人们可以通过呼吸、饮食等多种途径摄入，对人类健康产生极大危害，因此研究多环芳烃在环境中的行为具有十分重要的意义。多环芳烃在环境中，特别是水环境中的迁移转化和归宿也得到广泛关注。本文着重探讨河流、湖泊等淡水水体中多环芳烃的迁移转化研究成果，并指出存在问题和今后努力的方向。 2 PAHs在淡水水体中的迁移转化规律 2.1 PAHs 在大气-水体间迁移转化 PAHs 在大气-水体间迁移转化方式有：气态湿沉降、携带PAHs 的颗粒物湿沉降与干沉降、水-气界面PAHs 交换。李军等利用双膜理论计算多环芳烃在麓湖水面上的交换通量，除萘、苊、二氢苊的通量方向是从湖水到大气外，其它多环芳烃都是从大气进入水体。每年大气向麓湖中输送约1 300 g 多环芳烃，主要以菲为主，占总量的60%以上；湖水向大气挥发约220 g多环芳烃，主要以萘为主，占总挥发量的95%，这显然是由于萘挥发性很强的缘故。Gigliotti 等自1997 年开始，研究Patapsco 河自巴尔的摩断面至北部的切萨皮克断面的大气-水交换通量，发现PAHs 中芴在刮大风时中交换通量最高，单位交换通量为14 200 ng/(m2?d)，菲最低，为11 400 ng/(m2?d)。 2.2 PAHs 在水中光化学降解 光化学降解是水环境中PAHs 降解的重要方式之一，PAHs 可以吸收太阳光中的可见（400~700 nm）和紫外（290~400 nm）光，发生分解。1981 年，Mill 等
多环芳烃的处理方法探究 摘要:本文介绍了多环芳烃检测技术的现状，包括分光光度法、反相高效液相色谱法、固相微萃取、超临界流体，介绍了多环芳烃降解技术的方法，最后总结了多环芳烃的污染现状，并对其发展前景进行了展望。 关键词：多环芳烃；灵敏度；降解 Stdy on the processing method of polycyclic aromatic hydrocarbons Abstract:This paper introduces the Polycyclic aromatic hydrocarbons the present situation of detection technology,including spectrophotometry,reverse phase high performance liquid chromatography(HPLC)method,solid phase microextraction and supercritical fluid,this paper introduces the methods of polycyclic aromatic hydrocarbons degradation technology,finally summarizes the pollution status of polycyclic aromatic hydrocarbons,and its development prospect were also discussed. Key words:rate Polycyclic aromatic hydrocarbons;sensitivity;the degradation 多环芳烃（PAHs）是煤,石油,木材,烟草,有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物,迄今已发现有400多种PAHs,其中有相当部分具有致癌性,占被发现致癌物质总数的三分之一。其中16种PAHs（萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并（a）芘、茚苯（1,2,3-cd）芘、二苯并（a,n）蒽、苯并（ghi）北）由于存在显著的致畸、致癌、致突变作用，被美国环保署列为优先控制污染物。目前，中国只将7种列为优先污染控制物。 多环芳烃大部分是无色或淡黄色的结晶，个别具深色，熔点及沸点较高，蒸气压很小，大多不溶于水，易溶于苯类芳香性溶剂中，微溶于其他有机溶剂中。多环芳烃大多具有大的共扼体系，因此其溶液具有一定荧光。一般说来，随多环芳烃分子量的增加，熔沸点升高，蒸气压减小。多环芳烃的颜色、荧光性和溶解性主要与多环芳烃的共扼体系和分子苯环的排列方式有关。 PAHs的来源包括自然源和人为源两大类。其中，自然源又分为：燃烧类（森林大火和火山喷发）；生物合成（沉积物成岩过程、生物转化过程、焦油矿坑内气体）。人为源分为：流动源（交通、香烟）；固定源（垃圾焚烧、家庭燃烧、工业活动、其它）。多环芳烃在大气中、水体中、土壤和作物中，食品中和人体中均有相应的分布、迁移与转化。 因此，多环芳烃对于人类健康有着巨大的影响，PHAs的激素作用，造成的致癌、致畸、致突变（肺癌，阴囊癌，呼吸道癌）；基因毒性（对DNA合成的抑制作用）；对免疫系统的破坏（烹饪油烟冷凝物对小鼠免疫系统的影响，对T淋巴细胞的破坏比B淋巴细胞更明显）；破坏造血和淋巴系统（能使脾、胸腺和隔膜淋巴结退化，抑制骨骼的形成，动物实验）。因此，对于多环芳烃进行有效的处理，并对其处理效果进行探究是有着极其重要的。
目录 目录 (1) 摘要 (2) Abstract (3) 第一章绪论 (4) 1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4) 1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4) 1.3苯酚降解的研究现状 (5) 1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6) 1.5本课题的研究思路及意义 (6) 第二章材料与方法 (7) 2.1试验材料 (7) 2.2试验方法 (8) 2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8) 2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9) 2.2.4最优菌种的鉴定 (9) 3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11) 3.11筛选结果 (11) 3.1.1.1初步筛选的结果 (11) 3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11) 3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13) 3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13) 第四章结论 (14) 4.1菌种的筛选结果 (14) 4.2菌种的鉴定 (14) 参考文献 (15) 致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定 摘要 为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力. 该菌菌落较小，菌落呈微黄色。菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。不产芽孢。对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。参照东秀珠,蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》等文献方法，以形态和培养特征为主，生理生化特性及生态特性为辅，经初步鉴定为假单胞菌属，命名为H-1，具体确定到种则需要进一步的研究。 【关键词】：筛选苯酚降解鉴定
第23卷 第3期海洋环境科学V ol.23,N o.3 2004年8月MARI NE E NVIRONME NA L SCIE NCE Aug.2004 PAH s降解菌的分离、鉴定及降解能力测定 徐 虹1,章 军1,刘陈立1,邵宗泽2 (1.厦门大学 生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建厦门 361005;2.国家海洋局 第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室,福建 厦门 361005) 摘 要:以芴、菲、蒽、芘为碳源和能源筛选、分离PAHs降解菌。14株能降解利用PAHs的菌株被分离。通过HP LC分析,在 含芴、菲、蒽、芘的混合培养基质中10号菌的降解能力最强。研究它的降解性能和生长情况,表明该菌在混合反应体系中培 养30d后对芴、菲、蒽、芘的降解率分别为95.27、90.46、28和80%;在只含一种PAH的单反应体系中该菌对芴、菲、蒽的降解 能力提高,降解率分别可达98.91、94.32和52.17%,而对芘的降解能力则降低,降解率仅为62.47%。与混合PAHs培养体系 相比,在单一PAH培养体系中,细菌的对数生长期缩短1/3。经生理生化鉴定和16S rDNA序列对比分析,确定10号菌株属 于假单胞菌,命名为P seudomonas sp FAP10。 关键词:生物降解;多环芳烃;假单胞菌 中图分类号:O625.15;X55 文献标识码:A 文章编号:100726336(2004)0320061204 Isolation and identification of PAH2degradating strains and their degradation capability X U H ong1,ZH ANGJun1,LI U Chen2li1,SH AO Z ong2ze2 (1.The K ey Laboratory of M inistry of Education for Cell Bilogy and Tum or Cell Engineering,School of Life Science,X iamen Univer2 sity,X iamen 361005,China;2.The Third Institute of Oceanography,S OA,X iamen 361005,China) Abstract:Fluorenen,phenathalene,anthracene and pyrene were used as carbon and energey s ource to is olate and screen PAHs2degrading strains.F ourteen strains capable of degrading PAHs were is olated from the petroleum in seawater contaminated.Analyses was done by HP LC,strain N o.10showed the strongest degrading ability in the mixing system of fluorene、phenathalene、anthracene and pyrene.Its degradation performance and growth curve were tested. The degradation rates of fluorenen,phenathalene,anthracene and pyrene were95.27%、90.46%、28%and80%respectively in the mixing system within 30d.Under the condition of single PAH existence,the degradation rates of fluorene、phenathalene and anthracene by strain N o.10increased to98.91%、94.32%、52.17%respectively while the degradation rate of pyrene decreased to62.47%.C om pared to the mixing system,the logarithmic growth phase of strain N o.10was shortened one third in single PAH system..Based on the results of physio-biochemical identification and phylogenetical analyses of 16S rDNA sequence,strain N o.10was belonged to P seudomonas sp,named as P seudomonas sp FAP10. K ey w ords:biodegradation;polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs);P seudomonas 目前对于海洋油污染的清除方法主要有物理方法、化学方法和生物修复方法。其中生物修复法能利用生物有机体将污染物转化为稳定、无毒的终产物和微生物自身的生物量从根本上消除环境中的油污染,具有成本低、投资少、效率高、原位降解及不易造成二次污染等优点而受到普遍重视[1,2]。因此生物修复方法已经广泛应用于油污染的研究中。对于石油中烷烃、苯、甲苯等组分,大多数种属的微生物都具较强的分解能力,但对于高脂溶性、难挥发、具致畸、致癌及致突变作用的多环芳烃(PAHs)的降解情况则不甚理想,为此,许多研究者也进行了大量研究,取得了不少成果[3～10]。本研究旨在从石油污染的海域初步筛选出对多种PAHs 组分均具较强降解能力的海洋降解菌,为将来研究PAHs生物降解的分子机制,构建能降解PAHs的基因工程菌奠定基础。 1 材料与方法 1.1 培养基 MS M培养基:NaCl24g/L,NH4NO31.0g/L, K Cl0.7g/L,KH2PO42.0g/L,Na2HPO43.0g/L, MgS O4?7H2O0.7g/L,CaCl20.02g/L,FeCl3 收稿日期:2003210217,修改稿收到日期:2003212201 基金项目:国家海洋局第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室开放基金[A97304(021)] 作者简介:徐 虹(19732),女,湖南常德人,在职博士,主要从事基因工程与分子生物学研究。
多环芳烃来源和性质 自然源 主要包括燃烧（森林大火和火山喷发）和生物合成（沉积物成岩过程、生物转化过程和焦油矿坑内气体），未开采的煤、石油中也含有大量的多环芳烃 人为源 PAHs人为源来自于工业工艺过程、缺氧燃烧、垃圾焚烧和填埋、食品制作及直接的交通排放和同时伴随的轮胎磨损、路面磨损产生的沥青颗粒以及道路扬尘中，其数量随着工业生产的发展大大增加，占环境中多环芳烃总量的绝大部分；溢油事件也成为PAHs人为源的一部分。在自然界中这类化合物存在着生物降解、水解、光作用裂解等消除方式，使得环境中的PAHs含量始终有一个动态的平衡，从而保持在一个较低的浓度水平上，但是近些年来，随着人类生产活动的加剧，破坏了其在环境中的动态平衡，使环境中的PAHs大量的增加。因此，如何加快PAHs在环境中的消除速度，减少PAHs对环境的污染等问题，日益引起人们的注意。 多环芳烃大部分是无色或淡黄色的结晶，个别具深色，熔点及沸点较高，蒸气压很小，大多不溶于水，易溶于苯类芳香性溶剂中，微溶于其他有机溶剂中，辛醇-水分配系数比较高。多环芳烃大多具有大的共扼体系，因此其溶液具有一定荧光。一般说来，随多环芳烃分子量的增加，熔沸点升高，蒸气压减小。多环芳烃的颜色、荧光性和溶解性主要与多环芳烃的共扼体系和分子苯环的排列方式有关.随p电子数的增多和p电子离域性的增强，颜色加深、荧光性增强，紫外吸收光谱中的最大吸收波长也明显向长波方向移动；对直线状的多环芳烃，苯环数增多，辛醇-水分配系数增加，对苯环数相同的多环芳烃，苯环结构越“团簇”辛醇-水分配系数越大。 多环芳烃化学性质稳定.当它们发生反应时，趋向保留它们的共扼环状系，一般多通过亲电取代反应形成衍生物并代谢为最终致癌物的活泼形式。其基本单元是苯环，但化学性质与苯并不完全相似.分为以下几类 ⑴具有稠合多苯结构的化合物 如三亚苯、二苯并 [e,i]芘、四苯并 [a,c,h,j]葱等，与苯有相似的化学稳定性， 说明：电子在这些多环芳烃中的分布是和苯类似的。 图1x电子分布与苯类似的多环芳烃 ⑵呈直线排列的多环芳烃
第七章多环芳烃与非苯芳烃1.以奈为原料合成维生素K3. O CH3 O 解：以奈为原料合成维生素K3有以下几步 (1)OH K2C2O7 H+ O O (2)O O [H] OH OH (3)OH OH 3 CH3I OH CH3 (4)OH OH CH3K 2 C2O7 H+ O CH3 O 2.由指定的原料和必要的试剂合成下列化合物 HC CH3 CH3 CH3 解。各步反应如下
CH 3CH 2CH 2Cl 3 O O O AlCl 3 CH(CH 3)2 COCH 2CH 2COOH CH(CH 3)2 CH(CH 3)2 CH 2CH 2CH 2COOH Zn-Hg HCl SOCl 2 CH(CH 3)2 CH 2CH 2CH 2COCl AlCl 3 (H 3C)2HC O CH 3MgBr (H 3C)2HC H 3 C OMgBr - (H 3C)2HC H 3C Pb-C 脱氢 (H 3C)2HC H 3C 3从2-甲基奈合成1-溴-7甲基奈。 解；合成步骤如下所示： CH 浓 H 2SO 4 Br 2Fe TM 4,完成下列反应，写出主要产物 H 2SO 4(1)NaOH (2)H + (2) (1) 解：根据奈与H2SO4磺化反应在高温下发生磺化反应，有； H 2SO 4 SO 3H OH H + 所以(1)为SO 3H ，（2）为 OH 5.完成下列反应 H 3C NO 3+ Br 2 Fe 粉
解：联苯的性质与苯的性质类类似，在此反应中，甲基是第一类定位基，硝基是第二类定位基，取代反应后，溴进入甲基的邻对位，所以得到取代产物 为 Br H3C NO3 . 6.完成下列反应； H2SO4 165℃ (1)Na2SO4 (2)NaOH,(3)H (K) (J) 解；根据奈的磺化反应可知J为SO3H ；J经过一系列反应后 可知K为OH ；K与混酸发生硝化反应，因为羟基是邻对位定 位基，在β位上，所以硝基只能取代在与它相邻的α位上，从而得到L为OH NO3 。 7.完成下列反应。 OH 2Br2 解；根据奈环的取代规律，卤代产物为OH Br 。 8.命名下列化合物； (1) OH O2N（2） N+(CH3)3Cr （3）N N (4) CH CHCOOH