共聚焦显微镜预约和使用注意事项
1、仪器繁忙，至多提前14天，至少提前7天预约。
2、周二至周四优先对不具有独立操作资格的人员开放；其他时间优先对
具有独立操作资格的人员开放。
3、按需预约，一个月内如取消预约两次，该用户下个月内使用本仪器双
倍收费。
4、取消预约请提前一天通知管理员，否则按照预约时间收取费用。
5、第一次预约使用显微镜，请与管理员联系，沟通实验方案等。
6、请保持样本表面干燥、洁净，否则管理员有权拒绝用户使用显微镜；
7、如需使用20X以上（包括20X）镜头，样本与镜头之间只能间隔0.17mm
的玻片；
8、严禁在显微镜室内吃、喝东西；
9、实验者换拖鞋入内，与实验无关的东西请勿带入显微镜室内；
10、室内通风及温度控制等必须由工作人员进行；
11、在实验中如仪器出现问题，请向工作人员报告，严禁擅自处理或隐瞒；
12、请用户自带光盘（CD或者DVD），刻录数据只能使用光驱刻录机；
严禁使用移动设备（例如U盘、移动硬盘等），一经发现禁止使用本仪器。
德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作: 光学仪器(上海)制作:Zeiss 光学仪器(上海)国际贸易有限公司孙凯 2009 年 6 月目录:目录:1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序软件的快速使用说明2.2 软件的快速使用说明快速使用显微镜的2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图:系统组成及光路示意图: 组成及光路示意图电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站实物照片说明:实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序 )打开稳压电源(绿色按钮)(1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待 2 分钟(电压稳定)后，再开其它开关) “ ”(2)主开关 MAIN SWITC H “ON” “ ”电脑系统SYSTEMS/PC “ON” “ ”扫描硬件系统COMPONENTS “ON” )(3)打开电动显微镜开关打开荧光灯开关 (注:具有 5 档光强调节旋钮) ) 离子激光器主开关”(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约分钟，预热等待约 15 分钟，”将激光器扳钮由“Standby”扳至”状态，“Laser run”状态，即可正常使用 ) ，(5)打开电脑开关，进入操作系统注:键盘上也具有电脑开关 2.2 软件的快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件 ZEN 图标(2)进入 ZEN 界面，弹出对话框: ”——“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已”存图像数据的处理、分析。(3)软件界面: 功能界面切换:扫描取图( ) 图像处理( 、图像处
注意事项 ■持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。 ■轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，应放在距边缘10cm处，以免碰翻落地。 ■保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。 ■水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即用擦镜纸擦净。■放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。 ■要养成两眼同时睁开观察的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。 ■不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。 ■使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。 故障原因 一、检定方法把标准刻线尺放置在硬度计(或显微镜)的工作台上，检查时先调好焦距，使在目镜视野内或投影屏上能清晰地看到标准刻线尺的刻线，并调整到与目镜内的刻线重合，然后将读数显微镜的刻线与标准刻线尺的刻线进行比较，应至少在整个测量范围的5个间隔段进行测量，各间隔段比较3次，取3 次比较结果的平均值，其相对误差W按下式进行计算: W=(Li-L)/L×100% 式中:W——相对误差(mm)；Li——读数显微镜的比较段所测出的长度(mm)， (i=1～5)；L——标准刻线尺比较段的实际长度(mm)。 读数显微镜的刻度按上述方法逐段进行比较，其误差应不大于±0.5%。 二、故障原因与调修 1.显微镜混浊不清 主要原因:镜片不洁或发霉。 排除方法:当镜片上存有灰尘或污物时，应用毛刷、羽毛除去，继而用镜头纸或用脱脂棉蘸少许无水酒精或乙醚细心地沿环形轨迹擦拭，但不要让擦拭液体流失。 2.镜内不能清晰地看到压痕边缘 主要原因:部分镜片有松动现象。 排除方法:重新固紧镜片松动之处。 3.读数显微镜刻度值与标准尺刻度不重合 主要原因:物镜镜头松动或物镜镜头与镜筒连接处垫圈丢失，焦距变化所致。 排除方法:将物镜镜头紧固，若垫圈丢失，应经过反复调试其厚度，配上合适的垫圈，至刻度误差最小的位置为止。
激光共聚焦扫描显微镜简介 一、激光共聚焦显微镜的基本组成 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。 1.1 显微镜光学系统 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 1.2 扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达5帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。 1.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。 1.4 检测系统 LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。 二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用 与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性： 1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。 3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册 目录: 1 系统得组成 系统组成及光路示意图 实物照片说明 2 系统得使用 2、1 开机顺序 2、2 软件得快速使用说明 2、3 显微镜得触摸屏控制 2、4 关机顺序 3 系统得维护 1 系统得组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。 系统组成及光路示意图: 电脑工作站 激光器 电动荧光显微镜扫描检测单元 实物照片说明: 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO2 培养系统控制器 激光器 电脑工作站 2 系统得使用 2、1 开机顺序 (1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关 (2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON” 电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON” (3)打开[ 电动显微镜开关] 打开[ 荧光灯开关] (注:具有5 档光强调节旋钮) (4)Ar 离子激光器主开关“ON” 顺时针旋转钥匙至“—” 预热等待约15分钟, 将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至 “Laser run”状态,即可正常使用 (5)打开[ 电脑开关],进入操作系统
注:键盘上也具有[ 电脑开关] 2、2 软件得快速使用说明 (1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 (2)进入ZEN 界面,弹出对话框: “Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、 分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已 存图像数据得处理、分析。 (3)软件界面: 1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用) 2 动作按钮; 3 工具组(多维扫描控制); 4 工具详细界面; 5 状态栏; 6 视窗切换按钮; 7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块 动作按钮: Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。 Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程(1组图片,如XYZ、XYT 等)。 Stop ——暂停/结束扫描。 New ——建立一个新图像扫描窗口/文档。 激光连接状况检查 眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换(ZEN软件界面右上角): Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。(激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。) Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。 显微镜设置: “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标,选择物镜——> 样品聚焦。 透射光控制(Transmitted Light Control) 反射光光闸控制(Reflected Light Shutter) 荧光激发块选择(Reflector) 共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”(ZEN软件界面右上角),系统切换至共聚焦扫描光路: 光路设置: Smart Setup ——自动预设光路 选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法, 应用“Apply”。 (注:Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫 描。Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺 序扫描。Best promise 为兼顾速度与信号得折
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
显微镜是人类20世纪最伟大的发明物之一。在它发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。显微镜把一个全新的世界展现在人类的视野里，人们第一次看到了数以百计的"新的"微小动物和植物，以及从人体到植物纤维等各种东西的内部构造。近年来，由于科学技术的发展和人们生活水平的提高，显微镜开始在各大学校普及，越来越多的学生有机会亲自接触到显微镜了。那么关于学生在使用显微镜做实验的时候有哪些使用方法和操作注意事项呢？下面将给您详细讲解。 1.取镜 取下需替换的镜头放入镜头瓶中，镜头调整好位置，旋紧于镜头盖上，最后放置于物镜瓶中旋紧。 2.安装新镜头 将物镜通过旋转安装到物镜转换器上，安装的时候需要按着顺时针的方向旋转转换器，物镜这时候的物镜倍率是由低到高。 3.安装确认无误后，即可进行使用
显微镜安装好以后，需要检测是否齐焦，若不齐焦，检查物镜是否旋紧，安装好物镜后，即可正常使用。 4.调节 把所观察的标本放到载物台上。注意:使有盖玻片的一面朝上,且被观察的部分位于通光孔的正中央,再用压片夹夹住。转动准焦螺旋,将镜筒尽量调低。注意:从侧面观察物镜,不要让物镜压到标本上,以防镜头将标本压碎。 左眼注视目镜内,同时逆时针方向转动准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清物像为止。如果物像偏离视野,可慢慢移动标本。移动时应注意标本移动的方向与视野中看到的物像移动的方向相反。 5.观察与记录 用左眼对准镜内观察,同时右眼看桌面的记录本,并做好记录。注意:观察时,不能随便移动显微镜的位置。 6.还原
显微镜使用完后,将标本取下放回原处,然后将镜筒降到低处,一手握镜臂,一手托镜座,将显微镜放回镜箱内。 深圳市爱科学教育创新有限公司(以下简称爱科学)成立之初是 一家专注于研制新一代教学显微镜的科技型企业，公司致力于将先进的影像技术、电子信息技术及新时期的人文需求融入到传统光学仪器中，创造出一系列更加适合教学的显微镜产品。风雨中成长的几年里，爱科学掌握了数十项核心技术，于多项评比中荣获“自主创新银奖”、“中国教育装备产品创新奖”、教育装备“金奖产品”、“金点设计奖”、“红棉中国设计奖”等荣誉。这一切艰苦奋斗的成果，使得爱科学将目光由显微镜领域扩展到整个实验室装备领域中。
德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司 孙 凯 2009年6月
目录目录：： 1 系统的组成 系统组成及光路示意图 实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用 2.1 开机顺序 2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制 2.4 关机顺序 3 系统的维护
1 系统的组成 激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。 系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：： 电脑工作站 激光器 扫描检测单元 电动荧光显微镜
实物照片说明实物照片说明：： 电动荧光显微镜 扫描检测单元 CO 2培养系统控制器 激光器 电脑工作站
2 系统的使用 2.1 开机顺序 （1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮）） 等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关 （2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5档光强调节旋钮） （4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ” 顺时针旋转钥匙 至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，， 将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至 “Laser run ”状态状态，，即可正常使用 （5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统 注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]
Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月
目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)
Leica SP8 系统组成图
1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件
激光共聚焦显微镜 1．激光器： 1.1系统激光器覆盖可见光及紫外光： 1.1.1蓝光固体激光器488nm20mW； 1.1.2绿光固体激光器552nm20mW； 1.1.3红光固体激光器638nm，20mW 1.1.4紫外固体激光器405nm50mW； 1.2激光器的开闭和电压调节完全由软件控制，无需另设单根激光器的开关。并具有激光寿命保护装置。 1.3具有激光强度回馈稳定电路设计，在动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。 2．共聚焦扫描系统： 2.1激光扫描系统直接与共聚焦机身连接 2.2检测器数量 ①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器； ②扫描检测器包括2个光电倍增管（PMT）和一个磷砷化镓混合型检测器HyD。*③可以升级为五个以上独立连续光谱荧光检测器。 2.3连续分光设计系统（或其它光谱分离系统） *①三个通道，一个透射光DIC通道；二个荧光通道均为可做连续全光谱检测的荧光通道； ②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，二个荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描； ③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，精确对光谱进行分析； ④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，保证在多重荧光标记的同时检测过程中每个通道扫描光切平面和厚度的一致性和荧光精确定位。 2.4光谱扫描功能 ①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像； ②光谱分辨率2nm，可连续以1nm波长调节； ③光谱扫描范围：400-800nm；光谱扫描步进：1nm； ④高速棱镜分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料； ⑤光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设（可调节）。 2.5扫描速度及速度调节 *①扫描视野22mm下扫描速度7幅/秒（512×512pixels）；70幅/秒（512×16pixels）； ②双向扫描速度3600线/秒；扫描速度可精确调节。 2.6共聚焦针孔1个，全自动调节型，孔径50-300微米，调节步进0.5微米。
操作步骤和注意事项 （一）正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3～4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1～2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意：不应在高倍镜下直接调焦；镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距；要了解物距的临界值. 若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节：一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. （1）低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. （2）高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废.
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地
进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白
金相显微镜使用注意事项 金相显微镜使用注意事项： （1）操作时必须特别谨慎，不能有任何剧烈的动作。不允许自行拆卸光学系统。 （2）严禁用手指直接接触显微镜镜头的玻璃部分和试样磨面。若镜头上落有灰尘，会影响显微镜的清晰度与分辨率。此时，应先用洗耳球吹去灰尘和砂粒，再用镜头纸或毛刷轻轻擦拭，以免直接擦试时划花镜头玻璃，影响使用效果。 （3）切勿将显微镜的灯泡（6~8V）插头直接插在220V的电源插座上，应当插在变压器上，否则会立即烧坏灯泡。观察结束后应及时关闭电源。 （4）在旋转粗调（或微调）手轮时动作要慢，碰到某种阻碍时应立即停止操作，报告指导教师查找原因，不得用力强行转动，否则会损坏机件。 3.金相显微镜仪器维护 为了使仪器在正常使用条件下，保持它的有效性能，除了必须使用恰当外，还必须注意加强维护保养，现就维护保养问题提出下列几点要求（仅供参考）。 （1）仪器应贮放在空气流通和较干燥的地方，避免过冷过热和接触腐蚀性气体，不能与化学用品（干燥剂除外）同时贮放于同一地方。使用后宜用罩子遮盖并抹擦干净。不用时,要及时移走试样（玻片），用擦镜纸擦拭镜头，并将镜头转成八字式，同时下降镜筒固定，以免物镜镜头与集光器上的透镜相击而受损。再将显微镜装放入木箱内，放置在干燥、通风处。在可能条件下，最好每隔一定的时间，选择天气好的日子，将仪器和附件从木箱中取出，一起在室内宽敞、干燥、空气流通的地方，作两、三小时的室内晾曝。在高温天气作业完毕后，应注意贮放地点的温度，如温差悬殊，用毕后即收藏会在仪器上面产生湿气，容易使仪器发潮损坏。 （2）使用后应给目镜斜管盖上防尘盖子，如没有防尘盖子亦应套上目镜，以免灰尘落入斜管内，影响镜座光具的清洁。 （3）不宜随便拆卸和揩抹光学系统内部的半反射镜。除此之外，在透镜或玻璃表面不慎接触油污尘垢，可用细洁亚麻布或洁净脱脂棉花，沾少许二甲苯拭除（但不能用酒精，以免浸入透镜内层影响质量），由镜头中心向外旋转擦拭，并用擦镜纸或软绸布轻轻拭净,否则易于脱胶，或模糊而影响检测效果。如只是沾上灰尘，可用橡皮小吹风球把灰尘吹掉（不可用口吹），或用软毛笔或用细木棒卷上棉花，轻轻擦除之。镜头表面镀有一层兰透光膜，不要误作污物擦拭，禁止用金属工具来代替棉签进行擦拭。 （4）使用油浸系物镜后，必须立即采用上述方法把油垢除去，抹擦干净，抹时千万小心，特别注意不能按压镜面，否则容易使透镜脱离镜座。 （5）仪器长期使用后，粗动滑板部分及载物台滑动部分可能出现油脂不足或干涸现象，此时应及时添加润滑油脂。粗（微）动机构宜用流动性油脂，载物台滑动部分宜用有适当粘度的（但注意不能含有酸性）油脂。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图
二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡
显微镜操作步骤和注意 事项 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
操作步骤和注意事项 （一）正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3～4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1～2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意：不应在高倍镜下直接调焦；镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距；要了解物距的临界值.
若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节：一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱；低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. （1）低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. （2）高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废. （3）油镜的观察 先用低倍镜及高倍镜将被检物体移至视野中央后,再换油镜观察.油镜观察前,应将显微镜亮度调整至最亮,光圈完全打开.
激光共聚焦显微镜操作规程 一、准备工作 a)打开计算机。依次打开激光器电源、钥匙开关。多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) ON、氦氖绿(543 nm) ON、 氦氖红(633 nm) ON。打开汞灯电源开关。 b)登陆Windows XP系统。双击快捷方式：FV10-ASW 1.1。User ID: Administrator ; Passeword: Administrator。注 意区分大小写。 二、显微镜镜下观察 １.微分干涉差观察 a)使用手控面板选择物镜。插入起偏镜。插入微分干涉滑块。 b)点击FV10-ASW软件中的图标。标本聚焦. ２.荧光观察： c)使用手控面板选择物镜。 d)打开汞灯的机械快门，拉出DIC滑块，点击FV10-ASW软件中的图标 e)使用手控面板选择荧光滤色片。标本聚焦。 ３.获取单张荧光图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮。 b)关闭汞灯快门，点击按钮，关闭卤素灯快门。 c)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV,，并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像:右图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像。(保存为“xml”类型是击FV10-ASW 软件专用的图像格式。) ４.获得单张（荧光+微分干涉）图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮，关闭汞灯快门。点击按钮，关闭卤素灯快门。 b)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 c)选择TD1。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节绿色(FITC)图像和微分干涉差的图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV, 并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像。 ５.获取3D图像 例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光(Rhodamine)双标（这里介绍线序列扫描取图的过程.）
激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别
........ 显微镜使用过程（每个过程应注意的方法） ①取镜和安放： 一手握镜臂，一手托镜座【右握左托，保持镜身直立，防目镜、反光镜脱落】， 把显微镜放在距离试验台边缘10cm处【避免碰翻落地】，略偏左,装好目镜和物镜。 ②对光：转动转换器，使低倍物镜正对通光孔。注意：不要板着目镜，使目镜松动。 转动遮光器，选择最大光圈对准通光孔。左眼注视物镜、右眼睁开， 转动反光镜【直对或斜对光源】，将光线反射到镜筒里。 使光线通过光圈、通光孔、标本、物镜、镜筒、目镜，可看到白亮的视野。 注意：转动反光镜，先用平面镜，视野太暗换凹面镜【可避免强光刺眼】。 外界光线过强，可调小光圈。 ③安放装片：把制作的玻片标本放在载物台上，并用压片夹压住，标本要正对通光孔中心。 ④调焦：从侧面看着物镜！顺时针转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降 至接近玻片标本为止【约0.2－0.5cm，免物镜和玻片相挤压】。 注意：物镜不要碰到标本。 ⑤观察：左眼向物镜内观察、右眼睁开【以便绘图】， 逆时针转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓【太快，物像来不及看到就闪过】上升 直到看到物像为止。再略微转动细准焦螺旋使物像更清晰。 ⑥清洁收放：观察完毕，先升镜筒，取下玻片标本。 用洁净纱布将显微镜外表擦净。如需擦拭镜头，要用擦镜纸轻擦。 转动转换器，使两个物镜伸向前方， 将镜筒缓缓降到最低处。【防止因重力作用使镜筒自然下降，引起滑丝】 将反光镜放在直立或水平位置。把显微镜放进镜箱，锁好箱门，放回原处。 注意事项：1、物象的放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数 2、物像是实物的倒像【上下倒、左右倒】。（旋转1800）例如：b在显微镜里是q 。 3、物像移到视野中央的方法：物像在视野的右上方，载玻片向右上方移动。 物像的移动方向与玻片标本的移动方向相反。 4、如何确定污点(花斑)位置？目镜、物镜、玻片标本。 5、放大倍数越大或低倍镜换成高倍镜： 视野越暗、视野范围越小、细胞体积越大、细胞数目越少）【可调成大光圈、凹面镜】。 试题试卷
金相显微镜的使用方法、注意事项和维护 金相显微镜主要用于鉴定和分析金属内部结构组织，它是金属学研究金相的重要仪器，是工业部门鉴定产品质量的关键设备，该仪器配用摄像装置，可摄取金相图谱，并对图谱进行测量分析，对图象进行编辑、输出、存储、管理等功能。 1.1使用说明 （1）将光源插头接上电源变压器，然后将变压器接上户内220V 电源即可使用。照明系统在出厂前已经经过校正。 （2）每次更换灯泡时，必须将灯座反复调校。灯泡插上灯座后，在孔径光栏上面放上滤色玻璃，然后将灯座转动及前后调节，以使光源均匀明亮地照射于滤色玻璃上，这样，灯泡已调节正确，这时则将灯座的偏心环转动一个角度，以便将灯座紧固于底盘内。灯座及偏心环上有红点樗，如卸出时，只要将红点相对即可。 （3）观察前原则上要装上各个物镜。在装上或除下物镜时，须把载物台升起，以免碰触透镜。如选用某种放大倍率，可参照总倍率表来选择目镜和物镜。 （4）试样放上载物台时，使被观察表面复置在载物台当中，如果是小试样，可用弹簧压片把它压紧。
（5）使用低倍物镜观察调焦时，注意避免镜头与试样撞击，可从侧面注视接物镜，将载物台尽量下移，直至镜头几乎与试样接触(但切不可接触)，再从目镜中观察。此时应先用粗调节手轮调节至初见物像，再改用细调节手轮调节至物像十分清楚为止。切不可用力过猛，以免损坏镜头，影响物像观察。 当使用高倍物镜观察，或使用油浸系物镜时，必须先注意极限标线，务必使支架上的标线保持在齿轮箱外面二标线的中间，使微动留有适当的升降余量。当转动粗动手轮时，要小心地将载物台缓缓下降，当目镜视野里刚出现了物像轮廓后，立即改用微动手轮作正确调焦至物像最清晰为止。 （6）使用油浸系物镜前，将载物台升起，用一支光滑洁净小棒蘸上一滴杉木油，滴在物镜的前透镜上，这时要避免小棒碰压透镜及不宜滴上过多的油，否则会弄伤或弄脏透镜。 （7）为配合各种不同数值孔径的物镜，设置了大小可调的孔径光栏和视场光栏，其目的是为了获得良好的物像和显微摄影衬度。当使用某一数值孔径的物镜时，先对试样正确调焦，之后，可调节视场光栏，这时从目镜视场里看到了视野逐渐遮蔽，然后再缓缓调节使光栏孔张开，至遮蔽部分恰到视场出现时为止，它的作用是把试样的视野范围之外的光源遮去，以消除表面反射的漫射散光。
激光共聚焦显微镜在材料领域应用初探 夏仲琦，周向群(2010-07-02 18:35:09) 一、前言 作为一种微观形态学工具，光学显微镜在工业测试方面的应用，目前主要大家比较熟悉的主要是以下方面： 首先，单独作为形态学工具，进行材料组织分析和外观缺陷检查，其典型的产品是金相显微镜和立体显微镜。 第二、光栅量测结合，进行部件的精密尺寸测量，其典型的产品是工具显微镜，测量显微镜。 近年来，随着计算机软件技术的发展，显微镜与图象处理系统的结合，产生了定量金相软件、工显测量软件、一般几何测量软件等等，使其不仅可以定性分析，更能在定量化上发挥重大作用。 但光学显微镜的局限在于，它是一种二维的形态学工具，其极限有效分辨率是0.35微米，该分辨率下的景深在1微米以下。因此如果要在高倍率下观察表面的三维形态，特别是纵向方向的形态，通常一定需要使用SEM而不是OM。SEM是这一方面非常成熟有效的标准工具，但有些样品使用SEM会碰到以下困难： 1、样品本身比较大，且不能做分割的器件组，虽然被观察的部分是微小的局部，但整个样品难 以放入SEM中。 2、非金属样品，且不适合做导电性处理。特别是一些对微小处理很敏感的样品。 3、无法测量多种尺寸数据，比如体积，面积，粗糙度等等。 针对这些问题，SEM厂家在不断推出更新的技术。同时，光学显微镜开发者也在探索如何使光学显微镜成为一种三维的微观形态学工具。 这方面目前比较有成效的技术，是激光扫描共焦显微镜（CF-LSM）。 共聚焦激光扫描显微镜的发展在国外，主要为日本。是从80年代末期开始的，目前在日本，共聚焦激光扫描显微镜已经是一种被广泛采用的技术，既用来观察样品表面亚微米程度（0.12微米）的三维形态和形貌，又可以测量多种微小的尺寸，诸如体积、面积、晶粒、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等等。 另外，它还有以下特点： 1、使用方便,与一般光学相似,且全部采用计算机直观控制。 2、基本无须制样,不损伤样品。不需要做导电处理,也容许大尺寸样品直接观察,完全不破坏样品。 3、几十秒到一两分钟即完成全部的扫描，成像，测量采样工作。该设备目前已经为吉林大学，哈 尔滨工业大学用于材料和机械加工方面的研究。