分子克隆技术:指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术
克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来
DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子
SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始
启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位
基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。
转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。
转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。
感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程
选择：转化子的初步筛选：通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。
筛选：进一步检测目的重组子：通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。
启动子：DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列
SD序列：核糖体结合位点
终止子：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3 ’ 端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子
融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA 的完整序列编码。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程
重组子：含有重组DNA分子的转化子
转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞
供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件
DNA体外重组的基本步骤1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记的载体分子上。3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
基因工程的基本操作步骤：1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2. 重组体的制备将目的基因的DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物
载体应具备的条件： 1.具有对受体细胞的可转移 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记。
限制性内切酶的命名原则前3个字母代表来源的生物,随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株,最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序
star activity高浓度的酶（>100U/g）、高浓度的甘油（>5%）、低离子强度（<25mM）、极端pH值(>pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的star activity现象.
抑制star activity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③提高离子强度到100～150mM ④降低反应pH至pH7.0 ⑤使用Mg2+作为二价阳离子
DNA连接酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA 链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。
体外连接DNA片段的方式黏性末端同种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端的连接。平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连杆（linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接，DNA接头(adapter)连接法。
平末端DNA片段的连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。
载体应具备的条件1. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3. 具有多种单一的酶切位点4. 具有合适的选择性标记自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力
质粒DNA的复制类型严谨型质粒松弛型质粒
天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想
构建质粒克隆载体的基本策略1能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。2含多克
隆位点3含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4 DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。5根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。
质粒克隆载体的构建1选择合适的出发质粒2正确获得构建质粒克隆载体的元件3组装合适的选择标记基因4选用合适的启动子5构建过程力求简单
DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
蓝白斑筛选Ampicillin 抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝
Ti质粒介导转化的过程①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化④vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中
TA克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
TA克隆注意事项1. 要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2. PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3. 在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
真核生物的启动子：真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。
1.RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。
2.RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂；
3.RNA聚合酶III转录tRNA和5S rRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称为下游启动子。
目的基因的获得:直接分离法;PCR扩增;构建基因组文库法;构建cDNA文库法;化学合成法直接分离法:限制酶酶切法(DNA分子已测序/目的基因已定位)
基因组文库的构建(DNA未测序或未定位)：
采用限制酶切割
构建基因组文库
筛选目的基因克隆
基因文库构建的一般步骤：
（1）染色体DNA大片段的制备
①酶切法
②物理切割法
（2）载体与基因组DNA大片段的连接
①粘性末端直接连接
②人工接头法
（3）转导受体
（4）筛选重组子
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。
cDNA文库的特点
优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建
缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的
序列
构建cDNA文库的一般步骤：
（1）总RNA（total RNA）提取
（2）mRNA的分离纯化
①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。
②mRNA的分离纯化Column（柱）
（3）cDNA的合成
①cDNA第一链合成
②降解mRNA模板
③cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）
（4）cDNA与载体连接：
（5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）
基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成
目的基因的分离：
目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因
目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法
基因克隆的方法：
一、目的基因的功能克隆
二、序列克隆法
三、差别杂交法
四、减法杂交技术
五、mRNA差别显示技术
功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因
表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等
无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆
目的基因的功能克隆：在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因
1、根据特异蛋白分离目的基因
分离、纯化目的蛋白
测定特异的氨基酸顺序
推测编码该蛋白的核苷酸序列
人工合成一段寡核苷酸探针
从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因
分离、纯化目的蛋白
目的蛋白免疫动物，制备抗体
从cDNA表达文库中筛选目的基因
根据特异蛋白分离目的基因局限性：
特异蛋白已鉴定并分离纯化
某些基因产物，难以分离纯化
非所有基因有蛋白质产物
遗传密码的简并性
2、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段与宿主细胞染色体DNA具有功能互补。筛选营养缺陷型互补基因
序列克隆法：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因；采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离
差别杂交法：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因；受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因
应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。
基本过程：制备两种细胞群体的的mRNA提取物；以两种总mRNA或cDNA为探针；以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库
局限性：
灵敏度比较低，不适于低丰度mRNA目的基因分离
需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑
差别杂交重复性较差
不同滤膜间DNA保有量不均一
杂交信号强度不一致
重新点杂交
减法杂交技术：又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交
本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性
mRNA减法杂交；基因组减法杂交
感受态细胞的制备：
1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜
2、按1％的接种量接种于3 mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状)
3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000 rpm离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干
4、加入1mL 预冷的无菌0.1mol·L-1 CaCl2溶液涡旋，4℃下12,000 rpm离心30秒,尽量去除上清
5、沉淀以50-100μL 预冷的0.1mol·L-1 CaCl2重悬，4℃保存备用，7d内可用。
大肠杆菌的转化方法：
1.Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法
CaCl2 的诱导原因：在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca 2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态
Ca 2＋能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。
对照试验：转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性
2.电穿孔转化法
基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。
影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度
3.三亲本杂交接合转化大肠杆菌
重组DNA分子导入植物细胞
（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
作用机制：将待转移的目的基因组入农杆菌中的Ti质粒载体；农杆菌识别敏感植物，将Ti 质粒的T-DNA转移到植物细胞内部
基本程序：选择合适的外植体；农杆菌的接种操作；洗菌并筛选培养
常用方法：
1.创伤植株感染法
2.共培养感染法：叶盘转化法；植物愈伤组织共培养转化法；植物悬浮细胞共培养转化法；原生质体共培养转化法
（2）DNA的直接转移法：多聚物介导法；电穿孔转化法；激光微束穿孔转化法；显微注射法；超声波介导转化法；基因枪法；脂质体介导法；花粉管通道法
重组DNA分子导入哺乳动物细胞
病毒介导的转染：病毒颗粒转导法
生化转染：磷酸钙转染法；DEAE－葡聚糖转染法；聚阳离子－DMSO转染法；脂质体介导法
物理转染：显微注射法；电穿孔法
常见的筛选重组子方法
1 遗传表型直接筛选：抗药性筛选；插入失活筛选法；插入表达筛选法；显色互补筛选法
2 PCR法鉴定
3 酶切法鉴定
4 杂交法鉴定：Southern blot；Northern blot；Western blot 等
5 测序
原核生物基因表达的特点
①只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。
②基因的表达是以操纵子为单位的。
③原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。
④原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。
⑥mRNA的核糖体结合位点上，含有一个S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。
启动子的特性：列特异性；向性；置特异性；属特异性
几种类型的原核表达载体
非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白
优点：它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。
缺点：易被细菌蛋白酶破坏。
融合蛋白：由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起。
优点：大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；于分离纯化
影响基因表达效率的因素：启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等
提高基因表达效率的途径：
1.采用强启动子；35和-10区之间保持的距离（16～19bp）
2.确定合适的SD序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游的碱基成分
3.起始密码子和S-D序列之间的距离必须接近到一定程度（7个核苷酸时最合适）
4.在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基因的表达效率)控制在一个正常的水平上。
5.提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上）
6.轻细胞的代谢负荷：
（1）诱导表达：细菌的生长与外源基因的表达分开，是减轻宿主细胞代谢负荷的最为常用的一个方法
(2) 表达载体的诱导复制：将宿主菌的生长和质粒的复制分开
7.高表达蛋白的稳定性，防止其降解
(1)克隆一段原核序列，表达融合蛋白
(2)采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解
(3)表达分泌蛋白
基因工程的应用：
医药业：疾病的预防;病的诊断;病的治疗
农业及食品工业:提高作物抗性;良作物品质;长果实货架期;用农作物生产药物
畜牧业;工食品
环境:环境检测;环境净化
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
选修3——基因工程高考题 1．（2017?新课标Ⅰ卷.38）（15分） 真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________________________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用______________作为载体，其原因是_______________________________________________________________。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_____________________________________________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A 的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_______________________________________________________________________________。2．（2017?新课标Ⅱ卷.38）（15分） 几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题： （1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是______________________________________。 （2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________。 （3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________（答出两点即可）。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。 （5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是____________________________________________。 3.（2017?新课标Ⅲ卷.38）（15分）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。 回答下列问题： （1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________________________________。（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________________，加入了________________作为合成DNA的原料。 （3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。 ①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是________________________。 ②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。 4．（2017·天津理综卷9）（20分）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性质，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤I、II试验。 Ⅰ．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。 （1）为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是______（单选）。 ①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点 ②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA 分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基 生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA 连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30 多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有
基因工程原理复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章 DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ● 1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ● 2．真核生物中转录和翻译分开进行； ● 3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ● 4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
《基因工程》 一、选择题（每小题1.5分，共15分） 1．基因工程的创始人是( )。 A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 A 由作用于同一DNA序列的两种酶构成 B 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 C 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 D 不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 3．在DNA的3’-5’链上，基因的起始密码子是( ) A ATG（或GTG） B AGT C TAG D TGA 4．II限制性内切核酸酶可以特异性地识别( )。 A 双链DNA的特定碱基对 B 双链DNA的特定碱基序列 C 特定的三联密码 D 以上都正确 5．末端转移酶是合成酶类，具有( )活性。 A 3’5’DNA聚合酶 B 5’3’DNA聚合酶 C 5’3’DNA内切酶 D 5’3’DNA外切酶 6．下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的。 A 质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，因而有较多的拷贝数。 B 可以在氯霉素作用下进行扩增。 C 通常带有抗药性标记。 D 同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子。 7．关于cDNA的最正确的说法是( )。 A 同mRNA互补的单链DNA B 同mRNA互补的双链DNA C 以mRNA为模板合成的双链DNA D 以上都正确 8．关于T4 DNA Ligase，下列说法中哪一项不正确? ( ) A 是最常用的DNA连接酶。 B 不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。 C 不但能连接粘性末端。 D 最适温度37 ℃。 9．下列关于建立cDNA文库的叙述中，( )是错误的? A 从特定组织或细胞中提取DNA或RNA B 用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA C 以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA D 新合成的双链DNA克隆到载体上，并导入受体细胞 10．用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。 A Southem blot B Northem blot C Western印迹 D 原位菌落杂交
基因工程试题及答案 【篇一：基因工程题库以及答案】 因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是： (1)____________， (2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和 __________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。 8．限制性内切核酸酶bsuri和haeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．dna聚合酶i的klenow大片段是用_____________切割dna聚合酶i得到的分子量为76kda的大片段，具有两种酶活性： (1)____________； (2)________________的活性。 10．为了防止dna的自身环化，可用_____________去双链 dna__________________。 11．egta是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的t7 dna聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记dna的基本原理在于利用 _________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链dna分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。 15．反转录酶除了催化dna的合成外，还具有____________的作用，可以将dna- rna杂种双链中的___________水解掉。
学习-----好资料 2008─2009学年 第 2学期 《基因工程原理》课程考试试卷(A 卷)参考答案 专业: 生物技术 年级:2006 考试方式:闭卷 学分:4 考试时间:120分钟 一、名词解释(每小题2.5分，共15分) 1、 基因工程：是指在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物提（供体）的基因 或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 2、 星活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶 的识别和切割序列发生低特异性，即Star activity 现象。 3、 插入型载体：只具有一个可供外源DNA 插入的克隆位点。 4、 反转录PCR ：在逆转录酶的作用下、以mRNA 为模板合成互补的cDNA ，再以cDNA 为 模板进行PCR 反应。 5、 感受态：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细 胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞。 6、 考斯质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos 序列和质粒复制子的特殊类型的载 体 二、填空题(每小题1分，共10分) 1、用酚—氯仿抽提DNA 时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇，这是因为异戊醇可以 防止气泡 ；分离DNA 时要使用金属离子螯合剂，如EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是 抑制了DNase 。 2、按照质粒拷贝数的多少，质粒可以分为 严谨型质粒 。和 松弛型质粒 。 3、λ 噬菌体在感染大肠杆菌以后，可以进入 Lytic growth 也可以进入 Lysogenic state 。如果其基因组 DNA 通过专一性重组整合到宿主染色体中，则其进入 融源状态 。；它也可以选择进入 融菌状态 ，大量复制并组装子代噬菌体颗粒。 4、ddNTP 与普通的 dNTP 的不同之处在于 ddNTP 2’和3’双脱氧 ，它们可以在 DNA 聚合酶的作用下，通过其 5’ 掺入到正在增长的 DNA 链中，导致链延伸反应终止。 5、Klenow DNA 聚合酶是 DNA 聚合酶Ⅰ 经蛋白酶裂解而从全酶中除去 5’—3’外切酶 活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。 三、选择题(每小题1.5分，共15分) 1、限制性内切核酸酶可以特异性地识别（ C ）。 A 、特定的三联密码； B 、双链 DNA 的特定碱基对； C 、双链 DNA 的特定碱基序列； D 、单链 DNA 的特定碱基序列。 2、在切口平移方法标记 DNA 探针时只能使用（ B ）。 A 、Klenow 酶； B 、DNA 聚合酶 Ⅰ； C 、DNA 聚合酶 Ⅱ； D 、DNA 聚合酶 Ⅲ。 3、在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制哪一项最好（ C ）。 A 、反应体积； B 、酶反应温度； C 、反应时间； D 、酶量。 4、PCR 扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是（ B ）。 A 、退火温度过低； B 、退火温度过高； C 、dNTP 浓度过高； D 、循环次数过多。 5、以下不属于 PCR 的应用的为（ D ）。 A 、随机扩增多态性 DNA （RAPD ）； B 、扩增片段长度多态性（AFLP ）； C 、RACE ； D 、S1 酶作图。 6、pUC18 与 pUC19 的区别在于（ B ）。 A 、二者的选择标记不同； B 、二者的多克隆位点方向相反； C 、pUC18 无 lacZ 基因； D 、pUC19 无 lacZ 基因。 7、有关 DNA 序列自动化测定的不正确叙述是（ D ）。 A 、用荧光代替了同位素标记； B 、激光扫描分析代替人工读序 基； C 、本原理与手工测序相同； D 、不再需要引物。
作业一： 一、名词解释： 1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子 3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。 4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。 5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp 的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。 6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。 二、简答题 1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体. 2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性受哪些因素影向 答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(>5％, v／v)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)； ；L)／mmol(<25 低离子强度(3)． (4)高pH以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等； (6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些 答：（1）DNA的纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）核酸内切限制酶的缓冲液 4、什么是Klenow酶有哪些活性在基因工程中有什么作用 答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在
基因工程试题 一、选择题（每题1分，共15分） 1、下列有关基因的叙述，错误的是【 A 】 A蛋白质是基因表达的唯一产物 B 基因是DNA 链上具有编码功能的片段 C 基因也可以是RNA D 基因突变不一定导致其表达产物改变结构 2、基因工程的单元操作顺序是【 B 】 A 增，转，检，切，接 B 切，接，转，增，检 C 接，转，增，检，切 D 切，接，增，转，检 3、生物工程的上游技术是【 A 】 A 基因工程及分离工程 B 基因工程及发酵工程 C 基因工程及酶工程 D 基因工程及细胞工程 4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是【 C 】 A终止子与终止密码子B基因表达与基因转译 C DNA 退火与 DNA 复性D重组子与转化子 5、根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成【 B 】 A 2 大类 B 3 大类 C 4 大类 D 5 大类 6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA 片段连接在一起， 其底物的关键基团是【 D 】 A 2' -OH 和5' –P B 2' -OH 和3' -P C 3' -OH 和2' –P D 5' -OH 和3' -P 7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【 A 】 A 连接反应的最佳温度为37 ℃ B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10% C 连接反应缓冲体系的ATP 浓度不能高于1mM D 连接酶通常应过量2-5 倍 8、原生质体转化方法不大适用于【 A 】 A 大肠杆菌 B 枯草杆菌 C 酵母菌 D 链霉菌 9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【 A 】 A Cosmid >λ-DNA > Plasmid B λ -DNA > Cosmid > Plasmid C Plasmid >λ -DNA > Cosmid D Cosmid > Plasmid >λ-DNA 10、若某质粒带有lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培 养基中加入【 D 】 A 半乳糖 B 异丙基巯基-β- 半乳糖苷（IPTG ） C 蔗糖 D 5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基- β -D- 半乳糖苷（X-gal ） 11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的 是【 C 】 A 大肠杆菌－繁殖迅速 B 枯草杆菌－分泌机制健全 C 链霉菌－遗传稳定 D 酵母菌－表达产物具有真核性 12、分子杂交的化学原理是形成【D 】
高中生物基因工程基础考点训练试题 1.农田中广泛栽种抗虫棉会使棉铃虫抗毒蛋白基因频率下降 2.将ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒Pet28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada 3.细菌细胞内的限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵 4.切割目的基因和载体DNA时为获得相同的黏性末端，必须用相同的限制性核酸内切酶切割 5.将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 6.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因 7.用DNA连接酶连接平末端和黏性末端的效率一样 8.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 9.下列关于核酸分子杂交和抗原－抗体杂交的叙述，正确的是 A.核酸分子杂交是指两条脱氧核苷酸链的杂交 B.抗原－抗体杂交的原理为碱基互补配对原则 C.核酸分子杂交可检测目的基因的存在和转录 D.抗原－抗体杂交中目的基因产物常作为抗体 1.将重组DNA分子导入受体细胞，常用的受体细胞有＿＿＿＿、枯草杆菌、酵母菌和＿＿＿＿等。例如用质粒为载体，受体细胞应选择＿＿＿＿＿，为增加细菌＿＿＿＿＿的通透性，可用＿＿＿＿＿处理受体细胞。 2.基因工程在医药工业和医学领域的应用主要包括基因工程药物和＿＿＿＿＿＿，基因工程药物如＿＿＿＿、干扰素、人生长激素和乙型肝炎疫苗等糖蛋白，其中干扰素是病毒侵入细胞后产生的。基因治疗是向＿＿＿＿中引入＿＿＿＿＿的基因，以纠正或补偿＿＿＿＿的缺陷，达到＿＿＿＿的目的。 3.甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下： （1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA 后，利用＿＿＿技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的＿＿＿，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。 （2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与⑴中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与＿＿＿＿＿连接后导入宿主细胞。 提取宿主细胞的＿＿＿＿＿进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。 （3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将⑴中的重组质粒导入⑴中的转基因宿主细胞，并在补加＿＿＿＿＿＿的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是＿＿＿（单选）A.病毒的DNA聚合酶 B.宿
基因工程试题A 一、名词解释(每题2分,共20分) 1、转染: 2、质粒不亲与性: 3、cDNA 文库: 4、RACE: 5、基因工程: 6、RT-PCR 7、插入失活: 8、S-D 序列: 9、穿梭质粒载体: 10、多克隆位点: 二、选择题(每题1分,共15分) 1( )基因工程操作的三大基本元件就是:(I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体V 配体) Ａ I + II + III Ｂ I + III + IV Ｃ II + III + IV Ｄ II + IV + V Ｅ III + IV + V 2( )基因工程的单元操作顺序就是
Ａ增,转,检,切,接 Ｂ切,接,转,增,检 Ｃ接,转,增,检,切 Ｄ检,切,接,增,转 Ｅ切,接,增,转,检 3 ( )生物工程的上游技术就是 Ａ基因工程及分离工程 Ｂ基因工程及发酵工程 Ｃ基因工程及酶工程 Ｄ基因工程及细胞工程 Ｅ基因工程及蛋白质工程 4 ( )下列对逆转录酶描述正确的就是: A 依赖于RNA的DNA聚合酶或称为RNA指导的DNA聚合酶 B 依赖于cDNA的DNA聚合酶或称为cDNA指导的DNA聚合酶 C 依赖于DNA的DNA聚合酶或称为DNA指导的DNA聚合酶 D 依赖于RNA的RNA聚合酶或称为rNA指导的RNA聚合酶 5( )下列对限制性内切酶描述正确的就是 Ａ限制性内切酶可识别任一的DNA序列 Ｂ使用限制性内切酶时,有时可出现星活性 Ｃ限制性内切酶可识别碱基数不超过5个 Ｄ限制性内切酶切割碱基序列产生都就是黏性末端 6 ( )T 4 -DNA 连接酶就是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起,其底物的关键基团就是 Ａ 2' -OH 与 5' -P Ｂ 2' -OH 与 3' -P Ｃ 3' -OH 与 2' -P Ｄ 3' -OH 与 5' -P Ｅ 5' -OH 与 3' -P 7 ( )下列有关连接反应的叙述,错误的就是 Ａ连接反应的最佳温度为 12—16℃ Ｂ连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10% Ｃ连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mM Ｄ连接酶通常应过量 2-5 倍 Ｅ DTT 在反应中可加也可不加 8( )下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大? A质粒 B黏粒 C酵母人工染色体(YAC) Dλ噬菌体 9 ( )载体的功能就是(I 运送外源基因高效进入受体细胞 II 为外源基因提供复制能力 III 为外源基因提供整合能力) Ａ I Ｂ I + II
专题二十五 基因工程(含转基因生物的安全性与生物武器 ) 考点一 基因工程的工具与操作程序 1.(2015·重庆卷，6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA 反转录获得 B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点 C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 解析 本题考查基因工程的相关知识，考查识记和理解能力。难度适中。人肝细胞不能合成胰岛素，则人肝细胞中不含有胰岛素的mRNA ，不能通过反 转录获得人胰岛素基因，A 错误；表达载体的复制启动于复制起点，胰岛素 基因的表达启动于启动子，B 错误；抗生素抗性基因是标记基因，可用于筛选含胰岛素基因的受体细胞，C 正确；启动子在转录过程中起作用，终止密 码子在翻译中起作用，D 错误。 答案 C 2.(2015·广东卷，25)下图为培育转基因山羊生产人β 酪蛋白的流程图。 下列叙述正确的是( ) A.过程①所用的人β 酪蛋白基因可从人cDNA 文库中获得 B.过程②可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植 C.过程③可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体 D.过程④人β 酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译 解析 本题为现代生物技术的综合题，主要考查基因工程和胚胎工程相关知识点，难度较大。过程①为基因工程中的构建基因表达载体，人β－酪蛋白
基因即为目的基因，目的基因可从基因文库中获取，基因文库包括基因组文 库和cDNA 文库，A 正确；过程②指的是胚胎移植过程，一般选取桑椹胚时期或者囊胚期的胚胎进行胚胎移植，不选用原肠胚时期，B 错误；过程③为 加速转基因动物的繁育，可以采用超数排卵，胚胎分割移植等方法，C 正确；过程④指的是目的基因的表达，包括转录与翻译两个阶段，转录的场所是细 胞核，翻译的场所是细胞质中的核糖体，D 错误。 答案 AC 3.(2014·重庆卷，4)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述， 正确的是( ) A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA 聚合酶参与 B.③侵染植物细胞后，重组Ti 质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 解析 构建表达载体需要限制酶和DNA 连接酶，A 错误；③侵染植物细胞后， 重组Ti 质粒上的T －DNA 整合到④的染色体上，B 错误；染色体上含有目的 基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C 错误；植株表现出抗虫性状，说明含有目的基因，属于基因重 组，为可遗传变异，D 正确。 答案 D 4.(2013·广东理综，3)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和 溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多 肽药物，首先要做的是( ) A.合成编码目的肽的DNA 片段 B.构建含目的肽DNA 片段的表达载体 C.依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽