实验一特殊光学显微镜的结构与使用
【实验安排】3学时教师讲解演示，学生操作
【目的要求】
1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的特殊部件；
2、掌握暗视野、相差和荧光显微镜的工作原理和使用方法；
3、熟悉暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的基本结构。
【实验用品】特殊显微镜、酵母、牙垢微生物、菠菜、离心机、匀浆机
【实验内容】
1、特殊光学显微镜特殊部件的构造及调节
2、特殊光学显微镜的使用及注意事项
一、暗视野显微镜：
【实验原理及使用】
１、特殊部件：暗视野聚光器——使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
暗视野显微镜工作原理示意图
2、用途：暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
3、使用方法：
（1）从聚光器座架上卸下明视场聚光器，换装暗视场聚光器，安装到位并固紧。
（2）把被检样品的玻片标本置于载物台上，需用油浸的暗视场聚光器，要在聚光器上透镜与载片间滴加香柏油，使之密接。
（3）聚光器光轴的调中。聚光器的光轴要与显微镜的光轴位于同一轴线上。其方法是，用低倍物镜对样品聚焦，随之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置，当在暗视场中清晰地窥见一光环或圆形光点时，停止升降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，使视场中的光环或光点，调至视场中心位置。
（4）调节聚光器焦点，使之位于被校样品处，转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一最小的圆形光点，此刻即为聚光器的焦点恰于样品处。
（5）更换需用的高倍物镜进行镜检观察。
4、注意事项：
（1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。（2）使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油浸，使两者密接。否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射，照明光线照射不到被检样品，呈现不出暗视场照明的效果。
（3）载片厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后，产生空心照明光锥，即中心为暗区，而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上很短的距离，因此，载玻片的适宜厚度应在0.8一1.2mm。
（4）载玻片和盖片应清洁无伤痕，否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照明。
（5）照明光源的照明强度要高。因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品，若照明强度过弱照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果，目前多应用高功率的溴钨灯作为照明光源以提高其照明强度。
二、相差显微镜：
1、原理：在显微镜下镜检时，视场内的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化．即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。
相差方法法应用于生物学的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚于失真。因此才使相差法显得异常重要。
相差是指同—光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某—时间上光的波动所达到的位置。
一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨这种差别的。只有当变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。
用肉眼看不到的相差．只要利用衍射和干涉现象．把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。
相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件；在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板，在圆形相板的平面上．有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分；
（1）共轭面：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。
(2)补偿面(comPIemQtagy are3)：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。
在相板的共扼面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变．从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。在后焦面上装有种类不同的相板的物镜称为相差物镜。
2、相差显微镜特殊附件：相差物镜、带环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜、绿色滤色镜。
（1）相差物镜：相差物镜是显微镜特有重要装置。相位板涂有氟化镁，可将直射光或衍射光相位推迟1/4λ。
A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。
明反差或负反差：是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，直射光被相板的共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质)推迟1／4波长，同时吸收80％一90％，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟l／4波长，两者(直射光与衍射光)有完全相同的相位，合成波P等于直射光s与衍射光D之合，即P＝s十D，故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。
B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，结构比周围介质更加变暗，形成暗反差（或称正反差）。
暗反差或正反差是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面(因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质)的衍射光推迟1／4波长，使衍射光与直射光的相位相差1／2波长，同时，直射光在共轭面(上涂吸光物质)被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波(P＝s—D)振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。
根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜，聚光镜下面设有环状光阑．物镜后焦面装有相板。
（2）带环状光阑的转盘聚光器：位于镜台之下。普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用。环状光阐的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转换前端朝向使用者一面有标示窗(孔)，转盘上的不同部位标有0、l、2、3和4或0、10、20、40和100字样，通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40、4或l00，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入标示窗内之数字．表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。
（3）合轴调中望远镜：合轴调中望远镜简称CT，又名合铀调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有较长焦距的一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔(亮环)与相差物镜相板的共
扼面环孔(暗环)的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差物镜必须匹配，且环状光阑的环孔与相差物镜相板共扼面的环孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠。以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光路中前述两环的影像较小、一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，需借助合轴调中望远镜。
（4）绿色滤色镜：相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜或PL物镜，消色差物镜最佳清晰范围的光谱区为510-630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。所以，使用相差物镜时在光路上加用透射光线波长为500一600nm左右的绿色滤色镜．使照明光线中的红光和蓝光被吸收。只放过绿光，可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。
3、使用方法：
（1）打开光源
（2）在明视野下对光、调焦。观察透明标本时要缩小光阑。
（3）旋转转盘聚光器，使环状光阑直径和孔宽和所使用的相差物镜相匹配，并充分开大虹彩光圈。
（4）合轴调中：拔出一目镜，换上合轴调中望远镜，用左手固定其外筒，一边看望远镜，一边用右手升降内筒调焦，准焦时即可看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可固定望远镜。升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，再左右前后调节光阑的侧边，使亮环和暗环完全重合。
（5）取下望远镜，换上目镜，即可进行观察。
4、注意事项：
（1）载物片必须平整、均匀；标本不能太厚，否则相差显微镜成像效果不好。
（2）标本在有水的环境中，要用水封片等，成像效果明显。
（3）载物片表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑，影响观察效果。
（4）光路上最好加单色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。
（6）注意当换不同倍率的物镜时，都要选用相一致的相板和相环，并重新调中。否则，相差显微镜成像效果不佳。
三、荧光显微镜
1、实验原理：荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。
某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热能或用于光化学反应外．相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。
某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等．经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、丫叮橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。
2、荧光显微镜的基本装置
( 1 )光源：采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。
(2)滤色镜系统：按用途或功能，主要分为下列两类；
激发滤色镜：激发滤色镜的作用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱(激发峰值)，利用滤色镜对光线选择吸收的能力．选用其透射光谱。恰为荧光染料的最大吸收光谱(激发高峰)的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中选择透过最宜波段的光线供使用。激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。
阻断滤色镜：阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间．用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线．以防伤害眼睛，使荧光透过。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光。
荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一重要的分色镜系统——二向色镜，位于汞灯和激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的垂直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45o，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能。在荧光显微术中承当色光的“分流“作用。
3、荧光显微镜的光路：荧光显微术按激发光对样品的激发方向或方式区分为透射式和反射（落射）式两类。实际应用上多用反射式。
透射荧光显微术光路：透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。其具体光路如下：
汞灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
反射荧光显微术光路又称落射荧光显微术光路：因激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品．激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。其光路如图2—10。
4、使用方法：
①经荧光染料染色的样品放在载物台上，先用溴钨灯透射照明，用低倍物镜聚焦，待寻找到最佳影像后，熄灭溴
钨灯，改用汞灯。
②点亮汞灯，观察。
5、注意事项：使用汞灯严禁频繁开闭，点亮后欲暂停使用时，不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭后．不能立刻点亮，经5一l0min待汞灯冷却后再通电点亮。
使用油浸物镜时，应用无荧光浸油。
6、作业：
（1）为什么暗视场照明的视场暗黑，样品影像明亮?
（2）使用暗视场照明时，为什么必领在聚光器与载玻片间进行油浸?
（3）相差显微镜有哪些特有的附件，其构造如何？
（4）相差显微镜镜检时．为什么要用绿色滤色镜?
（5）为什么相差显微镜可以直接观察活体样品？
（6）什么是荧光?它是怎佯发生的?
（7）荧光显微术为什么要以汞灯当光源？
（8）激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及其区别?两者有何关系?
（9）二向色镜的作用原理?如何选用?
实验二血涂片的制作和细胞形态观察及细胞计数
【实验安排】 ( 共 3学时 ) ：
1、教师讲解实习内容，示范血涂片制作、染色 ( 约 30 分钟 ) 。
2、同学两人一组，相互采血，各自独立完成血涂片制作、染色、红细胞计数 ( 约 120分钟 ) 。
3、书写实验报告
【目的要求】
1、掌握血涂片的制备染色方法
2、认识各种血细胞的典型形态，了解细胞形态的多样性
3、掌握细胞计数板的结构和细胞计数方法
一、血涂片的制备与血细胞形态观察
【实验原理】
1、血涂片的制备：
涂片是一种基本的临时制片技术。血涂片是血液学研究中最基本的技术。血涂片的制作就是将血液样品制成单层细胞的涂片标本的过程。经过瑞氏染色，对各种血细胞形态进行观察。
2、瑞氏染色原理：
瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
美蓝(又名亚甲蓝mehylene blue)，通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为天青.
伊红(又名曙红cosin)通常为钠盐即伊红钠。
美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀, 即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后, 又重新解离为带正电的美蓝（蓝色）和带负电的伊红离子（红色）。
细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用. 各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样. 因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩
嗜酸性颗粒与酸性染料伊红结合染粉红色;
嗜碱性物质与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色;
中性物质成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色;
M+CL–+ Na+E– ME + NaCL
【实验用品】
1、器材：显微镜、医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、染色缸
2、试剂：瑞氏染液、蒸馏水、pH6.4－6.8 PBS缓冲液
【方法与步骤】
1、血涂片的制备与染色观察
(1)、采血：先用75%酒精棉球消毒左手无名指局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。
待血液从针孔流出，用干棉花擦去第一滴血。
(2)、涂片：轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。将血滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的
推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后使推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜。
（3）、待干：血涂片制成后可手持玻片在空中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.
（4）、染色：将血膜平放在染色架上. 加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定1～3分钟. 滴加等量缓冲液或新鲜蒸馏水,与染料混匀染色5-10（2～5）分钟. 用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。
（5）、观察：分别在低倍镜、高倍镜、油镜下观察血细胞的形态。
二、红细胞计数
【实验原理】
1、血细胞计数板的结构血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板，在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格，每个大方格的容积为0.1ul。
四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。
中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。
2、血细胞计数：用相应的稀释液将血液稀释若干倍，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。稀释血液有血细胞吸管法和试管法，本实验采用后者。
计算公式：
5个中方格内红细胞数×5×10×106×200（稀释倍数）= 红细胞数/L血液
【实验用品】
1、器材：显微镜、血细胞计数板、移液管
2、试剂：生理盐水、抗凝全血
【方法与步骤】
1、血液稀释：用移液管量取0.1ml抗凝全血，加入19.9ml生理盐水中稀释，混匀。
2、充液：取干洁的计数板，置于水平的桌面上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，
将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃，再重新充液。
3、计数：找到计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺
依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。
4、计算：按计数室构造及血液稀释倍数,将红细胞计数结果换算成每升血液
中红细胞的个数。
【实验注意事项】
1、使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干
燥,中性、无油腻。
2、细胞染色对氢离子浓度十分敏感,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异
常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。
3、推片时用力要均匀，否则容易形成波浪状，厚薄不匀。
4、一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。
5、血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落, 因此血膜必需充分干燥. 血片制好后最好立即
固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。
6、染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长，或应适当增
加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.
7、染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.
8、冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.
9、充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。
10、计数板、盖玻片、吸血管、血片等用过后必须立即按要求洗涤干净。
染色结果
在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚, 粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色.
【实验报告】
1、记录血涂片中各种类型细胞形态及染色结果
2、计算每升血液中红细胞的数量
实验三叶绿体的分离与观察
【实验安排】 ( 共 3学时 ) ：
1、教师讲解( 约 30 分钟 )
2、同学六人一组，分离叶绿体
3、书写实验报告
【目的要求】
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法
【实验原理】
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
【实验用品】
(一) 材料新鲜菠菜
（二）器材普通离心机、研钵、天平、光学显微镜、250m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、10m1离心管10 支、纱布若干、载玻片和盖片等。
（三）试剂 0.35mol/L NaCl 溶液，0.01%丫啶橙
【方法与步骤】
1. 游离叶绿体的制备与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。
（3）将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。
（4）取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。
（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。
（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。
（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。
（8）取叶绿体悬液1 滴滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察自发荧光。
（9）取叶绿体悬液1 滴加0.01%丫啶橙1滴混合后，滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察次生荧光。
2、菠菜叶手切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1滴0.35mol/L的NaCL,加盖片后轻压，置显微镜下观察。
（1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察。
（3）用同样方法制片，但滴加l一2滴0.01％丫啶橙染液染色染色1min，洗去余液，荧光显微镜下观察。
3. 组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。
【实验结果】
一、叶绿体的分离与观察
1.在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色自发荧光；
3.加入丫啶橙染色后，叶绿体发出桔红色次生荧光．而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
二、菠菜叶手切片观察
1、在普通光镜下可以看到3种细胞
(1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。
(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
(3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
叶绿体呈绿色檄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱，气孔发绿色荧光。两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3．用丫啶橙染色后．叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光、气孔仍为绿色，
三、组织中叶绿体的观察
1. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。
2. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野
下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。
3. 叶脉导管呈螺纹状。
4. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。
5. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。
【实验报告及作业】
1. 画出分离后的细胞组分（注明形态的放大倍数）。
2. 分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？
实验四细胞膜的通透性
实验五植物凝集素对RBC的凝集作用
【实验安排】
1、实验原理讲解；（30分钟）
2、细胞凝集反应；（40分钟）
3、细胞膜的渗透性。（50分钟）
4、实验小结：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验
作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。（15分钟）
【实验目的】
1、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
2、掌握细胞凝聚的原理；
3、熟悉凝集素；
4、了解凝集素对细胞凝集的特异性。
【实验原理】
1、细胞膜的渗透性
渗透：在半透膜隔开的两种不同浓度的溶液之间，水分子通过半透膜由低浓度一侧流向高浓度一侧的现象。
扩散：在半透膜隔开的两种不同浓度的溶液之间，溶质分子通过半透膜从高浓度一侧向低浓度一侧移动的现
象。
等渗溶液：渗透压相等的溶液。
渗透压：在渗透作用进行时，溶液中溶质所具有的吸引和保留水分子的力量称为渗透压。
当红细胞置于不同种等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，有的溶质可透入，有的不能渗入。渗入红细胞的溶质就可提高红细胞的渗透压，使细胞外水分进入红细胞，引起细胞膨胀破裂，导致溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。
2、细胞凝集反应：
细胞外被：细胞膜外表面的一层粘多糖物质。参与细胞粘着、细胞识别、细胞生长分化、免疫反应等；
凝集素：一类含糖的，并能与糖专一结合的蛋白质，具有凝集细胞，刺激细胞分裂的作用。
凝集素的特点：一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力；另一方面，凝集素具有多价结合能力。
凝集原理：与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。
凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A（ConA）、麦胚凝集素(WGA)、植物血激素(PHA)、花生凝集素(PNA)等，凝集素(Ietin)是其总称。日前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力．如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合，麦芽素与N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N—乙酰乳糖胺结合。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。
【实验用品】
（一）、材料：人血细胞、土豆。
（二）、器材：离心机、载玻片、天平、滴管、刀片、小烧杯，试管、试管架，移液管、吸耳球、秒表。
（三）、试剂：
1. 蒸馏水。
2. 0.17mol/L NaCl 溶液。
3． 0.17 mol/L NH4Cl
4． 0.17 mol/L NaNO3溶液。
5. 0.12 mol/L Na2SO4 溶液。
6. 0.32 mol/L 葡萄糖。
7. 0.32 mol/L 甘油。
8. 0.32 mol/L 乙醇。
9.0.32 mol/L 丙酮。
10.生理盐水
11.PBS缓冲液
【实验步骤】
一、细胞膜的通透性
1、血细胞悬液的制备：血液：生理盐水 = 1：10
2、低渗溶血观察： 3ml蒸馏水+ 0.3ml RBC悬液，混匀。
溶血现象的观察：透明度、离心
3、RBC对物质的渗透性观察： 3ml溶液+ 0.3ml RBC悬液
试管编号是否溶血溶血时间结果分析
1、0.17mol/LNaCI+RBC
2、0.17 mol/L NH4Cl+RBC
3、0.17 mol/L NaNO3+RBC
4、0.12 mol/L Na2SO4 +RBC
5、0.32 mol/L 葡萄糖+RBC
6、0.32 mol/L 甘油+RBC
7、0.32 mol/L乙醇+RBC
二、细胞凝集反应
1、提取植物凝集素：土豆去皮，称取20g ，切成薄片，加入100mlPBS缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶
性土豆凝集素）
2、制备2%的RBC悬液：
（1）、洗涤血细胞：2ml抗凝全血中加入8ml NS，2000r/min离心5min,弃去上清，再加入生理盐水，反复洗涤5次；
（2）、制备2%的血细胞悬液：经过洗涤的RBC，按压积用生理盐水配成2%的RBC悬液。
（3）、细胞凝集观察：载玻片上滴一滴土豆凝集素，再滴一滴2％红细胞悬液，充分混匀，静置20 min，观察血球凝集现象。
PBS缓冲液加2％血细胞悬液作为对照实验
【作业】
1、分析比较细胞膜通透性实验中所观察到的结果
2、推断下列溶液的溶血反应：
0.17mol/L KCI 、0.17mol/L KNO3、0.12mol/L MgCI2、0.12mol/L(NH4)2SO4、0.32mol/L甘露醇、0.32mol/L蔗
糖
3、绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。
表6—1 常见的凝集素一览表
实验六 DNA的Feulgen染色
【实验安排】
1、讲解实验原理、操作过程、注意事项。
2、分组实验：6人一组
【实验目的】
1、掌握Feulgen反应显示DNA的组织化学过程
2、掌握Feulgen方法的基本原理
3、了解DNA的分布部位
【实验原理】
利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显
色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。
标本经1N HCl 、60℃水解，可将DNA分子中嘌呤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色，从而显示出DNA的分布。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
Schiff试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸。
碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色。【实验用品】
1、器材显微镜、立式染色缸、水浴锅、镊子，盖玻片
2、材料用carnoy’s固定液固定的洋葱根尖。
3、试剂 1mol/L HCl、Schiff氏试剂、carnoy’s固定液、漂洗液、0.5%亮绿水
溶液
【实验步骤】
（一）、实验组
1、carnoy’s固定液固定的洋葱根尖放入蒸馏水中漂洗
2、移入1 mol/L HCl的染色缸内清洗1min
3、60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min
4、取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液
5、蒸馏水冲洗3次（使水解停止）
6、Schiff试剂中染色40min
7、用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)
8、流水冲洗5 min
9、蒸馏水洗片刻
10、1%亮绿复染数秒钟（注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）
（二）对照
省略步骤3、4，其余同实验组
【实验结果】
细胞核中的DNA呈紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为绿色。
【注意事项】
1. 对照的制做
进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假阳性反应。
2. 水解时间
Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
3、Schiff试剂的作用
Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
【实验报告】
1、绘图表示Feulgen反应的染色结果
2、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
Feulgen方法应注意的几个问题：1. 对照切片的制做
实验七细胞骨架的光学显微镜观察
【实验目的】
掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。
【实验原理】
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。
光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。
由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
【实验用品】
1、实验材料：新鲜洋葱鳞茎
2、实验器材：普通光学显微镜，小烧杯，滴管，试剂瓶．载玻片，盖玻片，镊子、吸水纸，擦镜纸
3、试剂
1） M缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：
50mmol/L咪唑(MW:68.08),
50mmol/L KCl(MW:74.55),
0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30),
1mmol/L EGTA(MW:380.36),
0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24),
1mmol/L DTT(MW:154.3)
2） 6mmol/L PBS磷酸缓冲液（pH 6.5）:
KH2PO4 : Na2HPO4·2H2O = 7:3 (见附录3 查磷酸缓冲液的配置)
3） 0.9% 生理盐水
4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-缓冲液
5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL
6） 0.2% 考马斯亮蓝R250染液 200mL:
考马斯亮蓝R250 0.2g,
甲醇 46.5mL,
冰乙酸 7mL,
蒸馏水46.5 mL
各种试剂成分的作用：
1、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂，适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。
2、M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压
3、EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度。
4、戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态
5、考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）
【实验步骤】
1、撕取洋葱鳞茎近中轴内表皮约l cm2大小和靠近外层鳞片内表皮约l cm2大小做对照，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。 2．吸去磷酸盐缓冲液．用1％Triton X—100处理60min。
3．吸去Triton X—100液，用M缓冲液洗3次，每次5min左右。
4．用3％戊二醛固定30min。
5．再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min。
6．0.2％考马斯亮蓝R250染色15min(在载玻片上)。
7．用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。
【实验结果】
洋葱不同鳞茎部位光镜观察结果
1、取材
2、光镜观察结果
【结果分析】
1、洋葱不同鳞茎部位光镜观察结果
2、人口腔上皮细胞骨架观察结果【注意事项】
1、取洋葱近中轴内层中下部的内表皮细胞
2、用滴管吸取缓冲液漂洗时不要洗掉样品
3、染色、水洗均在表面皿上操作
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
细胞生物学教案 （来自https://www.doczj.com/doc/b71859863.html,）目录 前言 第一章绪论 第二章细胞结构概观 第三章研究方法 第四章细胞膜 第五章物质运输与信号传递 第六章基质与内膜 第七章线粒体与叶绿体 第八章核与染色体 第九章核糖体 第十章细胞骨架 第十一章细胞增殖及调控 第十二章细胞分化 第十三章细胞衰老与凋亡
前言 依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。 一、学科本身的重要性 要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。 二、学科发展特点 细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。 三、欲达到的目的 通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。 本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。 参考资料 1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》 2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年 3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年 4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版 6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社 7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社 8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版 9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社 10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版 11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》， 12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社 13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社 14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社 15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社 学术期刊、杂志 国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol. 国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
细胞生物学实验测试题 1、试述荧光显微镜的原理和用途。（并操作） 原理：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 （滤光镜片：获得所需波长的激发光；光源：高压汞灯） 用途：荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研 究的工具之一。 2、试述酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤。 原理：酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的标志酶，通常酸性磷酸酶在pH 为5左右时发挥作用能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸 铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，需再与黄色的硫化 铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。其反应过程如 下： β-甘油磷酸钠+酸性磷酸酶→甘油+PO43- PO43-+Pb(NO3)2 →Pb3(PO4)2↓ Pb3(PO4)2+(NH4)2S →PbS↓(棕黑色) 主要步骤： 1、前处理：获取小白鼠或大白兔腹腔液（猪肝） 2、制片： （1）、将腹腔液（肝细胞悬液）滴一滴于冰冻的干净载玻片上，用牙签涂开，自然干燥。 （2）、放入10%中性福尔马林固定液中固定30min。 （3）、蒸馏水中漂洗,3-5次。（洗去固定液） （4）、磷酸酶作用液，37°C，30Min。 （5）、蒸馏水中漂洗3次，5min一次。（洗去游离铅离子） （6）、1%硫化铵处理（3-5min）; （7）、吉姆沙染液复染15min;（使细胞核、轮廓显示出来） （8）、制片观察。 结果：阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。 对照实验：标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min，使酶失去活 性，做好标记，其他步骤相同。 3、试述DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤。 原理：DNA经稀盐酸（1mol/L HCL溶液）处理后，可使嘌呤碱与脱氧
医学细胞生物学实验课教学大纲 (供临床医学专业七年制使用) 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年6月
前言 细胞生物学是生命科学中最重要的基础学科和前沿学科，细胞生物学课程是培养医学生基础理论知识、实践能力、创新能力的关键环节。优秀的细胞生物学课程高等医学院校课程体系建设的重要内容。结合汕头大学医学院人才培养目标，我们将锻造理论与实践、临床与基础重组渗透，能力培养贯穿始终的、特色鲜明的医学细胞生物学课程体系作为本课程建设的目标，力争通过本课程的学习使临床医学专业学生掌握细胞生物学的基本原理、研究方法，掌握相关疾病的分子机制，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践、科学研究奠定良好基础。 实验课教学是理论教学的重要补充，是人才培养的关键环节。在实验教学上我们以科研与教学相结合、科研应用于教学为指导思想，坚持实验内容的先进性和综合性，创造条件改善和提高学生的动手能力，为培养学生基本科研技能奠定基础。力争通过实验课学习使学生掌握医学细胞生物学的基本理论和实验技能，提高学生独立分析问题和解决问题的能力，培养学生学习的主动性，使其具备一定的科研思维和科研能力，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践和科学研究奠定良好基础。 七年制细胞生物学实验课程包括基础性实验-综合设计性实验-科研活动三个层次的实验课课程体系。通过该课程体系对七年制学生实验能力进行全程培养。本教学大纲规定基础性实验和综合设计性性实验的内容。科研活动的内容和要求由学生和教师讨论后自行确定。 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年5月
七年制医学细胞生物学实验课内容 实验项目名称学时层次教学手段 实验一数码互动系统使用及细胞 基本形态观察4 基础实验 数码互动系统讲授 示教讨论 实验二细胞生理活动观察 4 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验三细胞染色体标本制备 与观察4 基础实验 数码互动系统 讲授、示教讨论 实验四细胞的原代与传代培养 6 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验五细胞组分的分离与鉴定>12 综合实验讨论多媒体 实验六细胞骨架对细胞、细胞器的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验七药物对细胞增殖与凋亡 的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验八定位信号与蛋白亚细胞 定位>12 综合实验 讨论 多媒体 大学生科研活动项目科研活动综合应用多种教学手段
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
辽东学院本科教案 课程教案（ 2010—2011学年第二学期） 课程名称：细胞生物学实验 周学时：2 教学周数：16 授课班级：农业B0902 任课教师：王丹丹 农学院
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实验一显微镜的使用及显微摄影技术 授课时数：（本次课学时数——2） 教学课型：实验课 一、教学目的与要求 1．了解显微镜各部分的名称，结构和功能，学习普通光学显微镜，荧光显微镜，倒置显微镜等的构造和使用方法. 2．掌握显微摄影的基本方法，学会显微镜的视差校正，曝光控制。 二、教学重点与难点 1．了解显微镜各部分的名称，结构和功能，学习普通光学显微镜，荧光显微镜，倒置显微镜等的构造和使用方法. 2．掌握显微摄影的基本方法，学会显微镜的视差校正，曝光控制。 三、实验原理： 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 四、作业、讨论、实验（实训）、案例 1.简述使用显微镜的注意事项； 2.简述使用油镜的具体步骤？ 五、参考资料 中国生物论坛https://www.doczj.com/doc/b71859863.html,/ 六、教学内容与教学过程（教学设计） 提出本学期的学习计划及上课要求 讲授本节内容 一、课前准备 二、讲解原理、步骤、注意事项及演示 三、学生操作：实验方法与步骤 1、普通光学显微镜的基本构造及使用方法； 2、荧光显微镜的基本构造及使用方法；
3、倒置显微镜的基本构造及使用方法； 4、自动曝光显微摄影的方法。 七、课后小结 实验二植物细胞骨架的光学显微镜观察授课时数：（本次课学时数——2） 教学课型：实验课 一、教学目的与要求 通过对洋葱内皮细胞的处理，了解植物细胞骨架的结构特征及其制备技术与显微形态观察。 二、教学重点与难点 了解植物细胞骨架的结构特征及其制备技术与显微形态观察。 三、实验原理： 细胞骨架在细胞中呈由蛋白纤丝交织成的立体网状结构，并且处于动态变化中。细胞骨架在胞质、细胞核、质膜、胞壁中都有分布，参与细胞形态维持、物质运输、信号转导等作用。处于不同生理状态的细胞其细胞骨架有变化，可根据细胞骨架推测细胞所处生理阶段。 四、作业、讨论、实验（实训）、案例 3.绘制你所观察到的植物细胞骨架图象； 4.戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作 用？ 五、参考资料
细胞生物学实验 Cell Biology Experiment 目录 1.显微镜的结构及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定 2.液泡系和线粒体的活体染色 3.叶绿体的分离与观察 4.DNA的细胞化学——Feulgen反应 5.多糖的显示——PAS反应 6.细胞内碱性蛋白和总体蛋白的原位显示 7.细胞骨架的光学显微观察和永久制片技术 8.植物原生质体的制备与融合 9.蚕豆根尖微核试验 10.膜的通透性 11.血细胞的分化和不同类型血细胞的观察 实验报告要求 1．注意页面四边留白，不要挤到页边！ 2．抬头填写完整。 3．注意事项自己总结，不要抄袭！ 4．组长检查后上交存档。 生物绘图注意事项 1．2H 以上绘图铅笔削尖、绘图橡皮、直尺 2．边看显微镜边按视野中实际情况绘图，以精确为主，不能艺术加工。 3．应找到最典型、最能说明绘图目的的物像来绘图。先轻勾出轮廓，检查无误后，再以准确清晰的线作最后描绘。
①实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，线粗细应均匀有规律 ②圆点的疏密表示明暗、凹凸（越暗的地方点越多）点点时笔尖直立，点大小、疏密要均匀、整齐、浑圆，不能像“，”。 4．用尺向右侧引出水平指示线，线右端平齐字注在右侧。图下方写上所画图的名称及放大倍数。图的右侧和下方需写文字说明，所以图应绘在绘图纸上偏左上方的位置。 5．一幅图只要详细画出部分结构，其余勾画出轮廓即可。 规范不规范 实验一普通显微镜的使用及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定 一、实验目的 1．熟悉普通光学显微镜的基本构造和性能，掌握使用方法。 2．了解细胞的一般形态和基本结构。 3．掌握显微测微尺的使用，对细胞大小有一直观认识。 4．了解鉴定死活细胞的方法。 二、实验原理 1．显微测微尺的使用 镜台测微尺：表示绝对长度，长1 mm，分成100小格，每小格为0.01mm。不被用来直接测量，而是用它来校正目镜测微尺，故其质量对所测微体影响极大。 目镜测微尺：是一块比目镜筒内径稍小的有标尺的圆形玻璃片，标尺长10毫米、分为100格。需要镜台测微尺校正为绝对长度再测定细胞大小。 2．死活细胞鉴定:台盼蓝是一种低毒的活体染色剂，只能透过质膜受损的细胞或死细胞。 三、实验用品 1．试验材料： 洋葱内表皮细胞口腔上皮细胞、 （人的口腔上皮细胞是扁平、 多边形的，形状不很规） 2．试剂 0.2%台盼蓝溶液 3．仪器
细胞生物学实验教案 【经典学习资料，收藏必备】
实验一、细胞形态结构与几种细胞器的观察 【实验目的】 在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。 【实验原理】 细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等，一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。 （自拍图） （a）（b） （c）（d） 图 1 细胞形态结构 a. 柿胚乳细胞示胞间连丝； b. 马蛔虫受精卵分裂中期示中心粒； c. 兔的神经细胞中高尔基体； d.小鼠肝细胞线粒体 【实验仪器、材料和试剂】 1. 仪器：复式显微镜、擦镜纸 2．材料：洋葱根尖切片、小白鼠肝切片、兔神经节切片、马蛔虫受精卵切片3．香柏油或石蜡油、二甲苯 【方法与步骤】
一、洋葱根尖切片细胞的观察 先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。 二、兔神经节细胞切片高尔基体的观察 先在低倍镜下找到兔神经节细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞内淡黄色的背景上有黄褐色的细胞核，核的周围分布着许多深褐色的（硝酸银镀染）高尔基体，呈弯曲的线状，颗粒状，少量分散在细胞质。 三、小白鼠肝细胞切片线粒体的观察 先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被苏木精染成深紫色的线粒体，呈颗粒状和线状。 四、马蛔虫受精卵切片中心体的观察 1．取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。 实验一、细胞的显微测量 【实验目的】 掌握显微测微计的基本原理及使用方法。 【实验原理】 细胞长度、面积、体积的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。在显微镜下用来测量细胞长度的工具叫显微测量计，由目镜测微尺（ocular micrometer）和镜台测微尺（stage micrometer）组成，两尺要配合使用。目镜测微尺是放在目镜内的一直径为2cm圆形玻片上，里面有100等分格的刻度尺。每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而不同。镜台测微尺是一块特制的载玻片，在它的中央由一片圆形盖片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺全长为lmm，分为100等份的小格，每小格的长度为0.01 mm（10μm），标尺的外围有一小黑环，便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、解剖剪、解剖镊、注射器、载玻片、盖玻片、试管、无菌采血针 （二）材料：血涂片 （三）试剂：生理盐水、瑞氏（Wright）染色液 【方法与步骤】
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
植物组织培养 一、实验目的 1、掌握植物细胞无菌培养技术。 2、了解不同激素对细胞的不同诱导作用。 二、实验原理 植物组织培养是20世纪60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官，组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整的再生植株。 植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种，幼胚培养与试管受精，抗体突变体的筛选于体细胞无体系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究与实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。 三、实验用品 1、材料 半夏无菌苗。 2、仪器 卧式灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。 3、用具 镊子、刀、牛皮纸、marker笔、棉线。 4、器皿 试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9～11cm)。 1、药品与试剂 1).药品(见下表) 2).70％酒精 四、实验方法 1、培养基的配制 配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。(各类成分浓度、用量详见下表)。 表1 MS培养基母液配制(单位：mg) 类别成分规定量称取量母液体积(ml) 扩大倍数 配1升培养基 的吸取量(ml) 大量KNO3 1900 19000 1000 10 100 NH4NO3 1650 16500
元素MgSO4·7H2O 370 3700 KH2PO4170 1700 CaCl2·2H2O 440 4400 微量元素MgSO4·4H2O 22.30 2230 1000 100 10 ZnSO4·7H2O 8.6 860 H3BO3 6.2 620 KI 0.83 83 Na2MoO4·2H2O 0.25 25 CuSO4·5H2O 0.025 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 2.5 铁盐Na2-EDTA 37.25 3725 1000 100 10 FeSO4·7H2O 27.85 2785 有机物质甘氨酸 2.0 100 500 100 10 盐酸硫胺素0.4 20 盐酸吡哆素0.5 25 烟酸0.5 25 肌醇100 5000 1).大量元素母液(10倍液) 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的(60～80℃)蒸馏水中。一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。 2).微量元素母液(100倍液) 分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容至1000ml。 3).铁盐母液(100倍液) 称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。 4).有机物质母液(100倍液) 分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。 除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。 5).生长素 如2，4－D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml 95％乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 6).细胞分裂素 如激动素(Kt)、6-卞基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。 2、1L培养基的配制与分装 1).取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。然后加水至800ml，加蔗糖30g，NAA终浓度0.25mg/L,6-BA0.75mg/L。待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8-6.0。 2).取一个250mL的烧杯，加200mL蒸馏水。煮沸后加8g琼脂条，待煮到一定境界后，液体为白色，
第五章物质的跨膜运输与信号传递 一．教学目标：1深刻理解被动运输、主动运输和内吞外排的概念，以及物质跨膜运输的重要意义；2．理解细胞信号传递的主要特点，掌握甾类激素信号 通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路和EGF受体信号通路的主 要环节。 二．重点：跨膜运输的方式和细胞通讯的信号通路。 三．难点：跨膜运输的机制。 四．授课方式与教学方法：讲授、讨论、多媒体辅助教学。 五．教学内容: 细胞膜是细胞与细胞外环境之间的一种选择性通透屏障，物质的跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要。多细胞生物是一个繁忙而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢与能量代谢，还有赖于细胞通讯与信号传递，以协调细胞的行为。 第一节物质的跨膜运输 一.被动运输（passive transport） ◆定义：通过简单扩散或协助扩散实现物质由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。转运的动力来自物质的浓度梯 度，不需要细胞提供能量。 ◆类型：简单扩散（simple diffusion）、协助扩散（facilitated diffusion） ◆膜转运蛋白： ?1.载体蛋白（carrier proteins）——通透酶（permease）性质； 介导被动运输与主动运输。 ?2.通道蛋白（channel proteins）——具有离子选择性，转运速率高；离子通道是门控的；只介导被动运输膜转运蛋白通道蛋白(被动运输)膜转运蛋白 载体蛋白单运输 (被动运输+主动运输) 共运输 协同运输 对向运输 细胞膜上的运输蛋白： 载体蛋白：通过构象变化运输物质 通道蛋白：形成通道、运输物质 载体蛋白:膜上一类转运蛋白，可特异的、可逆的与某物质结合，通过构象变化将物质从膜的一侧运到另一侧。又称通透酶，与运输物质的结合与酶的动力学相似。 通道蛋白:形成亲水的通道，允许一定大小和一定电荷的离子通过。因运转的几乎都是离子，又称离子通道. 通道蛋白形成通道：
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
医学细胞生物学实验教学大纲 实验一显微镜的操作与使用 3学时 实验二有丝分裂 3学时 实验三鸡血细胞融合 3学时 实验二有丝分裂 【目的要求】 (1)掌握动、植物细胞有丝分裂过程各期的特点及主要区别。 (2)掌握有丝分裂标本临时压片技术。 【实验原理】 细胞经过生长和分裂而完成增殖的全过程称细胞增殖周期。不同分裂方式的细胞其增殖周期表现形式不同。 无丝分裂是低等生物增殖的主要方式，由于其过程简单而迅速，没有染色体组装、纺锤体形成等一系列变化，故又称直接分裂。在高等动物体内可发生在某些迅速增殖的组织f如口腔上皮)、体外培养细胞，创伤修复、病理性代偿组织(伤口附近、炎症)中。有丝分裂是高等生物体细胞增殖的主要方式，由于其过程较为复杂，细胞内发生一系列复杂的丝状结构变化(染色体组装、有丝分裂器的形成)后，细胞才进行分裂，故又称为间接分裂。 【实验用品】
(1)器材：显微镜、载玻片、盖玻片、眼科镊、培养皿、刀片。 (2)试剂：Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)，70％乙醇溶液，1mol／L HCl苯酚品红染液。 (3)标本：马蛔虫子宫切片、洋葱根尖纵切片。 (4)材料：洋葱根尖或水仙根尖。 【内容与方法】 (一)动物细胞有丝分裂观察 (1)标本制备：马蛔虫子宫石蜡切片，铁苏木精染色。 (2)观察：先在低倍镜下观察。在马蛔虫子宫切面上可见子宫腔内有许多近圆形的受精卵细胞，大多处于不同的分 裂时期。每个受精卵细胞外均围有一层厚的受精卵膜，它与受精卵细胞间的空隙为围卵腔。在有些受精卵细胞外表面或受精卵膜内可见有极体附着。注意在切片标本的几个子宫切片中寻找和观察处于间期和有丝分裂不同时期的细胞，转换高倍镜仔细观察它们的形态变化(图6---2)。 间期(interphase)：细胞质内有两个近圆形的细胞核，二为雌原核，一为雄原核。两个原核形态相似，不易分辨。细胞核内染色质分布比较均匀，核膜完整，细胞核附近胞质中有中心体(central body)存在。 前期(prophase)：雌雄原核相互靠近，核仁(nucleolus)消失，染色质逐渐浓缩成扭曲细丝状染色丝(chromatin fiber)，进一步缩短变粗，形成短棒状染色体(chromosomc)。前期核膜消失，两对中心粒(centri0le)分离，周围出现星射线并分别向细胞的两极移动。 中期(metaphase)：染色体排列在细胞中央，形成赤道板(equatorialplate)。由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观两种不同图像。侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，其周围有星射线。中心体之间纺锤丝与染色体着丝点相连，这些结构总称为有丝分裂器。极面观可见六条染色体平排于赤道面上，此时染色体已纵裂为二，但尚未分离。 后期(anaphase)：纵裂后形成的子染色体在纺锤丝的牵引下分别向两极移动，成为相等的两群。细胞拉长，中部的细胞膜开始凹陷。 末期(telophase)：两极的子染色体逐渐解体、模糊，变成染色质态。核膜、核仁也相继重新出现，纺锤丝星射线消失，细胞膜的凹陷加深，最后横缢成两个子细胞。 (二)植物细胞有丝分裂观察 1．洋葱根尖纵切片的观察 (1)标本制备：洋葱根尖石蜡纵切片，铁苏木精染色。 (2)观察：取洋葱根尖纵切片标本．在低倍镜下观察，洋葱根尖由尖端向上可分为三个区域。 1)根冠区：位于尖端，细胞排列较疏松的区域。 2)生长区：位于根冠区上方，细胞方形或扁方形，排列紧密，细胞有强烈的分裂增生能力，大都处于分 裂期的各个不同时期。 3)延长区：位于生长区上方，细胞延长成长方形，细胞多处于分裂间期。先在低倍镜下找到生长区，换 高倍镜观察，辨认处于不同分裂时期的细胞。 间期：细胞核内染色质分布均匀，核形态明显，核内可见l一2个染色很深的核仁。
细胞生物学实验汇总
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实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。