棉花学报Cotton Science2014，26（1）：18~24
1株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴定
巩元勇1，郭书巧1，束红梅1，何林池2，倪万潮1*
（1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花和油菜重点实验室，江苏南京210014；
2.江苏沿江地区农业科学研究所，江苏如皋226541）
摘要：目的在于探明1株新的草甘膦抗性棉花突变体是否能用于发掘新的草甘膦抗性基因以及在农业生产中作为抗草甘膦种质的选育和利用的潜在价值。本文采用PCR的方法，在基因组和转录水平上排除了CP4-EP-SPS基因对该突变棉株的污染；通过测定莽草酸含量，鉴定了该突变体草甘膦抗性的典型生理特征；通过盆栽试验研究了该突变体苗期对草甘膦抗性的表型。结果显示：不论草甘膦处理与否，突变棉株莽草酸的含量都没有显著的积累，在生理水平上显示出草甘膦抗性植株的显著特点；2叶期时草甘膦处理结果显示，突变棉株的草甘膦抗性表型同孟山都的品种对草甘膦的抗性表型基本一致。在基因组和转录水平的PCR检测结果都排除了突变棉株草甘膦抗性的获得是CP4-EPSPS基因污染造成的。结合对其他已报道的草甘膦抗性基因的类似排除，说明该抗性突变存在着自身特有的分子机理。
关键词：棉花；草甘膦抗性；CP4-EPSPS基因
中图分类号：S562.01文献标志码：A
文章编号：1002-7807（2014）01-0018-07
Preliminary Identification of Glyphosate Resistance of a New Cotton Mutant
Gong Yuanyong1,Guo Shuqiao1,Shu Hongmei1,He Linchi2,Ni Wanchao1*
（1.Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed,Ministry of Agriculture,China,Nanjing,Jiangsu210014,China;2.Institute of Agricultural Sciences of Jiangsu Changjiang River Bank District,Rugao,Jiangsu226541,China）
Abstract:The purpose of this paper was to identify the potential value of a novel glyphosate-resistant cotton mutant comprising a new glyphosate resistance gene and to evaluate its agricultural production as glyphosate-resistant germplasm for breeding and u-tilization.At genomic and transcriptional levels,polymerase chain reaction(PCR)assay was used to exclude possible contami-nation by the CP4-EPSPS gene in this mutant cotton.The relative content of shikimic acid was determined to evaluate the typical physical characteristics of glyphosate resistance of this mutant.The phenotype of this cotton mutant under glyphosate treatment was observed at the seedling stage in pot cultures.No significant accumulation of shikimic acid was detected with different con-centration or without glyphosate treatment in the mutant treated leaves,which indicated the typical physical characteristic of
glyphosate resistance.The glyphosate-resistant phenotype of this cotton mutant was consistent with glyphosate-resistant cotton of Monsanto at the two-leave stage during glyphosate treatment.PCR showed that the CP4-EPSPS gene was not present in the genomic DNA or RNA of this mutant;thus,the glyphosate resistance of this mutant was not caused by the CP4-EPSPS gene. The results of similar exclusion tests for other reported glyphosate-resistant genes,indicated a new molecular mechanism existed in this mutant cotton.
Key words:cotton;glyphosate resistance;CP4-EPSPS gene
收稿日期：2013-06-25
作者简介：巩元勇（1982-），男，博士，助研，gongyuanyong1982@https://www.doczj.com/doc/b82926337.html,；*通讯作者，nwchao2002@https://www.doczj.com/doc/b82926337.html,
基金项目：江苏省博士后科研资助计划（1201031B）；国家自然科学基金（31301682）；江苏省农业科技自主创新基金（CX
(12)3068）；江苏省自然科学基金（BK2010465）；国家转基因重大专项（2011ZX08005-001）
1996年全球转基因作物种植面积只有170
万hm 2，在全球转基因作物种植面积持续增长的态势下，16年后的2012年这个数字增长了100倍，达到1.7亿hm 2
[1]
。2012年有28个国家的
1730万农民从转基因作物中获益，不仅如此，转
基因作物还在社会经济和环境效益方面发挥着越来越重要的作用[1]。转基因作物中不管是单一性状，还是复合性状，耐除草剂始终是主要性状，约有80%的转基因作物具有草甘膦抗性[2]。当前用于商品化抗草甘膦转基因作物的基因主要有2种：一种是美国孟山都公司拥有自主知识产权的来自农杆菌菌株CP4（Agrobacterium sp.CP4）的
EPSPS 基因，包括1996年上市的抗草甘膦大豆、
油菜和棉花，2001年上市的抗草甘膦玉米，2005年和2006年上市的抗草甘膦苜蓿和棉花，都有
CP 4-EPSPS 基因的插入；另一种是美国迪卡
（Dekalb ）遗传公司的修饰过的玉米EPSPS 基因，
1998年上市的抗草甘膦玉米便是插入该基因产
生的抗性[3]。
近几年，我国抗草甘膦作物研发也有了一些进展。何鸣等通过基因优化技术获得草甘膦抗性基因aroAM 12[4]。随后的相关研究表明，该基因在转入烟草[5]、甘蓝型油菜湘汕15号[6]和棉花品种石远321[7]中都能稳定表达，并且都表现出对草甘膦很强的抗性。朱玉从受草甘膦污染土壤的自然环境中筛选的荧光假单胞菌G2（Pseudomonas
fluorescens G2）中克隆获得EPSPS 酶的aroA G 2基
因，该基因的草甘膦耐受浓度最大可达150
mmol ·
L -1，其推导出的氨基酸序列与Class-I 的EPSPS 酶同源性约为30%，与Class-II 的EPSPS
酶同源性低于25%，和孟山都公司的CP4-EPSPS 酶同源性仅为24.5%，显示出较好的开发应用潜力[8]。刘锡娟等将aroA G 2基因通过双子叶植物偏爱密码子进行人工改造为EPSPS 酶的aroA G 2M 基因，将改造后的基因分别转入烟草和棉花，得到的转基因植株具有良好的草甘膦抗性[9]。赫福霞等同样将aroA G 2基因经植物偏爱密码子优化后改造为2mG 2-epsps 基因，将该基因转入玉米，获得了玉米转化系，表现出较好的草甘膦抗性[10]；
2009年，将该基因转入烟草并成功表达，转化后
的烟草表现出具有较高的草甘膦耐受性
[11]
。Lin
等从假单胞杆菌（Pesudomonas putida ）中克隆了抗草甘膦的EPSPS-G 6基因[12]，该基因随后被转入水稻和棉花中，在2011年的抗性验证中都显示出很好的草甘膦抗性[13-14]。
此外，还有一些研究人员通过非转基因的方法获得抗草甘膦作物。早在1995年，中国科学院上海植物生理研究所通过辐射育种的方法，获得了1个耐草甘膦的棉花种质系，其抗草甘膦能力达到田间用药浓度的90%[15]，不过之后再也没有关于该材料的后续报道。浙江大学的祝水金等采用体细胞连续定向筛选技术，结合体细胞诱变技术，获得1个高抗草甘膦的棉花突变体-R1098；研究发现，R1098植株抗草甘膦性状稳定，其抗性为单基因显性遗传，杂种F 1仍具有草甘膦抗性且表现有较强的杂种优势，对于杂交棉制种和生产应用具有重要的利用价值[16]。
前期研究中，江苏沿江地区农业科学研究所的研究人员在棉田偶然发现1株高抗草甘膦自然突变棉株，经过继代培养均表现出稳定的草甘膦抗性，该突变棉株被命名为TRC98-33；后续的遗传试验结果表明，该突变体的草甘膦抗性由一对显性基因控制，无细胞质效应。本论文通过对该突变体棉株CP 4-EPSPS 基因的排除、生理水平莽草酸含量的测定以及苗期植株抗性表型做初步研究，以期为新的抗草甘膦基因的发掘及该草甘膦抗性棉株的生产应用提供理论依据。
1
材料和方法
1.1
实验材料
1.1.1棉花种子。陆地棉（Gossypium hirsutum
L.）品种苏棉18（Sumian18）和草甘膦抗性棉花突
变体TRC98-33由江苏沿江地区农业科学研究所何林池研究员提供，草甘膦抗性棉花DP555为孟山都品种，由本实验室保存。
1.1.2主要试剂。一般化学试剂购自南京化学试
剂有限公司，为分析纯级别；95%草甘膦原粉购于成都格雷西亚化学技术有限公司；BU-SuperScript
RT KIT （Biouniquer ）和DNA Marker 购自南京天
为生物科技有限公司；EasyTaq DNA 聚合酶是北京全式金生物技术有限公司产品；引物合成在英潍捷基（上海）贸易有限公司（Invitrogen ）完成。
巩元勇等：1株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴定1期
19
棉花学报26卷
1.2实验方法
1.2.1植物培养及处理。棉花的催芽和育苗按照巩元勇等[17]的操作过程进行，分别将小苗移到Hoagland营养液和塑料花盆（长×宽×高=10cm×10cm×12cm）中培养，每3d更换一次新的营养液，待棉苗生长至2叶期时，不同浓度草甘膦（0，5，10，20，40mmol·L-1）处理第二片真叶，72h 后收取被处理的叶片测定莽草酸的相对含量；盆栽棉苗生长到两叶期时，分别对2片真叶涂抹10 mmol·L-1的草甘膦，处理10d后观察棉苗的生长情况，测量株高，观察分析叶片受胁迫反应（每个处理设置3～4个重复）。
1.2.2基因组DNA提取、总RNA提取及反转录合成cDNA第一链。基因组DNA提取采用孙志栋等[18]改良的CTAB法，从棉花新鲜的幼嫩叶片中提取DNA；总RNA提取运用胡根海等[19]的方法，同样从棉花新鲜的幼嫩叶片中提取获得；cD-NA第一链合成操作步骤按照BU-SuperScript RT KIT说明书进行，反应结束后的终产物稀释5倍用于后续的扩增模板。
1.2.3CP4-EPSPS基因的扩增。根据已公布的CP4-EPSPS基因序列（GeneBank登录号：AF464188），用Primer Premier5.0设计特异性引物CP4-EPSPS-F（CCTTCATGTTCGGCGGTCT CG）和CP4-EPSPS-R（GCGTCATGATCGGCTC-GATG）用于对基因组DNA和cDNA中CP4-EP-SPS基因的扩增。棉花GhHis3作为内参基因，所用引物是GhHis3-F（TCAAGACTGATTTGCGTT TCCA）和GhHis3-R（GCGCAAAGGTTGGTGTC TTC）。用EasyTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，94℃预变性3min后，按以下程序进行PCR扩增，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸5min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.2.4莽草酸的提取及测定。莽草酸的提取按照Pline等[20]方法，稍加改进。在研钵中用液氮充分研磨植物样品，称取0.2g样品加入2mL eppen-dorf管中；每管加入800μL0.01mol·L-1H2SO4，在摇床中混匀60min；加入250μL0.4mol·L-1 Na2CO3，用1.2×104g在4℃下离心10min；吸取上清液，可直接检测，也可在-30℃中保存直到检测。莽草酸的测定采用分光光度法[21]。取50μL提取液，加入500μL1%（W/V）高碘酸反应3h；加入500μL1mol·L-1NaOH，然后迅速加入300μL 0.1mol·L-1甘氨酸用于颜色固定；用分光光度计在380nm检测吸光值。
2结果与分析
2.1TRC98-33草甘膦抗性棉花突变体CP4-EPSPS基因的排除
用根据已公布的CP4-EPSPS基因序列设计的特异引物CP4-EPSPS-F和CP4-EPSPS-R，分别在基因组层面和转录水平对草甘膦抗性棉花突变体TRC98-33进行PCR扩增，以确定该突变体所具有的草甘膦抗性不是CP4-EPSPS基因污染所致。选取6株TRC98-33棉株分别提取基因组DNA作为模板，以DP555的基因组作为阳性对照模板，检测结果如图1所示，DP555在500bp 附近有PCR产物出现，而TRC98-33的6个棉株都没有可见PCR产物，由此表明TRC98-33的基因组不存在CP4-EPSPS基因。分别提取4株TRC98-33棉株的RNA，以反转录后的cDNA为模板，以DP555作为阳性对照，检测结果如图2所示，DP555的泳道有产物，而4个来源TRC98-33的泳道没有条带，因此在转录水平的结果进一步验证了TRC98-33棉株不存在CP4-EPSPS基因。
2.2草甘膦处理叶片莽草酸含量的测定
草甘膦处理后，短期内植物体是否有莽草酸积累，是判断植物是否具有草甘膦抗性的重要生理指标。营养液培养棉花幼苗至2叶期时，不同浓度草甘膦处理第二片真叶72h，检测该处理叶片莽草酸含量变化。如图3所示，经不同浓度草甘膦处理后，TRC98-33的真叶内莽草酸含量没有变化，同DP555变化趋势一致；而Sumian18因不具有草甘膦抗性，莽草酸含量在10mmol·L-1草甘膦处理下达到未经草甘膦处理时的5倍左右。该结果表明，TRC98-33品系在生理层面上也具备草甘膦抗性的典型特征。
20
图3
不同浓度草甘膦处理棉花叶片莽草酸相对含量变
化趋势
Fig.3The changing trend of the relative contents of
shikimic acid in cotton leaves by different oncentrations
of glyphosate treatment
2.3棉花苗期草甘膦抗性鉴定
为了进一步研究TRC98-33品系在草甘膦抗
性方面的表现，本文通过盆栽实验分析了该突变体苗期对草甘膦的抗性。同样以Sumian 18和
DP555为对照，在棉苗生长到两叶期时，对2片
真叶用10mmol ·L -1草甘膦处理，处理10d 后观察棉苗的生长情况。结果（图4）：Sumian 18第一、二片真叶出现黄化，伴随萎蔫，叶片边缘有坏死，而TRC98-33的这2片真叶同未处理的棉苗的表现一样，生长正常，这也同DP555处理的叶片表现一致（图4-B ）；Sumian 18第三片真叶出现萎蔫和坏死更为严重，几乎停止生长，而TRC98-33同
DP555第三片真叶表现一样，没有萎蔫和坏死，
叶片表现为边缘向中间卷曲（图4-B ）；Sumian18的茎端生长点完全坏死，停止生长，表现为株高不再增加，而TRC98-33同DP555一样，植株生
长高度同未处理的棉株没有差异（图4-A 、图
4-C ）。由此表明，TRC98-33品系在苗期对草甘膦
的抗性表现同DP555一致，为更深入地研究该突变体在全生育期对草甘膦的抗性提供了依据。
3讨论
已经商业化并在全球种植最广的抗草甘膦棉
花品种是孟山都的MON1445和MON88913[3]。
MON1445是第一个商业化具有草甘膦抗性的棉
花品种，该品种的抗性来自一个CP 4-EPSPS 基
M ：DL2000marker ；DP555：阳性对照；1-6：TRC98-33突变棉株。M:DL2000marker;DP555:Positive control;1-6:TRC98-33mutant cotton.
图1
CP 4-EPSPS 基因基因组PCR 扩增结果
Fig.1Genomic PCR amplification result of CP 4-EPSPS gene
DP555：阳性对照；1-4：TRC98-33突变棉株。DP555:Positive control;1-4:TRC98-33mutant cotton.
图2
转录水平CP 4-EPSPS 基因PCR 扩增结果
Fig.2PCR amplification result of CP 4-EPSPS gene at transcriptional level
巩元勇等：1株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴定1
期
21
棉花学报26卷
因，驱动该基因表达的CoMVB 启动子来源于修饰过的FMV 和拟南芥的CTP2转运肽[3]；
CP 4-EPSPS 基因在发育的花粉和绒毡层缺乏有
效的表达[22]，限制了草甘膦在该生长期的喷施。
MON88913含有2个CP 4-EPSPS 基因，用嵌合启
动子驱动该基因在4-12叶营养生长期以及敏感的生殖组织中能够更强的表达；这2个CP 4-EP-
SPS 基因分属于2个不同的DNA 组件，第一个CP 4-EPSPS 基因由拟南芥的tsf 1启动子和FMV 35S 启动子的增强子序列构成的FMV/TSF1嵌合
启动子调控基因的表达，第二个CP 4-EPSPS 基因由拟南芥的act 8基因启动子和CaMV 35S 启动子构成的CaMV 35S/ACT8嵌合启动子调控基因表达[22]。因在喷施草甘膦时MON88913表现出更强的安全性和稳定性，所以一上市就被广大的种植户所接受[3]。本研究所用的阳性对照材料DP555就是孟山都的MON88913品种。排除TRC98-33对草甘膦的抗性不是由已知的抗性基因，尤其是
CP 4-EPSPS 基因的污染而获得，成为深入研究该
突变体抗性机理的前提。本论文的研究结果以及
southern 和northern 的检测结果（将另文发表）在
基因组和转录水平都排除了CP 4-EPSPS 基因的干扰，且对其他已报道的草甘膦抗性基因也进行了类似的排除（本文结果中未显示），这为发掘新的草甘膦抗性基因提供了可能。
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolp-yruvylshikimate-3-phosphate Synthase ，EPSPS ）是
植物和微生物芳香族氨基酸生物合成重要途径———莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenol pyruvate ，PEP ）和3-磷酸莽草酸（3-Phosphoshikimate ，S3P ）合成5-烯醇式丙酮酸
-3-磷酸莽草酸（5-enolpyruvylshikimate-3-phos phate ，EPSP ）的关键酶[23]，草甘膦的作用方式是通
过竞争性抑制PEP 与EPSPS 结合，从而阻断
PEP 与S3P 反应生成EPSP [24]，其最直接的结果是
导致莽草酸的积累。因此，在草甘膦处理时，检测莽草酸是否积累是鉴定植物是否具有草甘膦抗性的重要生理指标[20]。在草甘膦处理后，叶片莽草
BT ：处理前，Before treatment ；NT ：未处理，No treatment ；AT ：处理后，After treatment.
图4
草甘膦处理对不同棉株的影响
Fig.4Effects of glyphosate treatment on different cotton
seedlings
22
酸含量不存在积累，在生理层面上显示出草甘膦抗性植株所具有的显著特征。另外，在苗期草甘膦处理后，TRC98-33的表型同DP555基本一致，这为整个生育期的田间观察研究提供了基础，同时也为TRC98-33突变体在农业生产中作为抗草甘膦种质的选育和利用提供重要的依据。
参考文献：
[1]James C.2012年全球生物技术／
转基因作物商业化发展态势[J].中国生物工程杂志,2013,33(2):1-8.
James C.2012global biotech /GM crops commercialized devel-opment trend[J].China Biotechnology,2013,33(2):1-8.[2]Service R F.A growing threat down on the farm [J].Science,2007,316:1114-1117.
[3]Green J M.Evolution of glyphosate-resistant crop technology[J].Weed Science,2009,57:108-117.
[4]何鸣,曾海燕,徐培林，等.aroA 基因的克隆和优化[J].中山大学
学报:自然科学版.2002,41(2):76-79.
He Ming,Zeng Haiyan,Xu Peilin,et al.Clonging and mutagene-sis of the aroA gene[J].Acta Scientiarum Naturalium Universi-tatis Sunyatseni,2002,41(2):76-79.
[5]谢龙旭,徐培林,聂燕芳，等.抗草甘膦抗虫植物表达载体的构
建及其转基因烟草的分析[J].生物工程学报,2003,19(5):545-
550.
Xie Longxu,Xu Peilin,Nie Yanfang,et al.Construction of a vec-tor conferring herbicide and pest resistance in tobacco plant [J].Chinese Journal of Biotechonology,2003,19(5):545-550.[6]王景雪,赵福永,徐培林，等.油菜转抗草甘膦、抗虫基因获得双
抗植株[J].遗传学报,2005,32(12):1293-1300.
Wang Jingfu,Zhao Fuyong,Xu Peilin,et al.Development of transgenic oilseed plants resistant to glyphosate and insects [J].Acta Genetica Sinica,2005,32(12):1293-1300.
[7]赵福永,谢龙旭,田颖川，等.抗草甘膦基因aroAM l2及抗虫基
因Btslm 的转基因棉株[J].作物学报,2005,31(1):108-113.
Zhao Fuyong,Xie Longxu,Tian Yingchuan,et al.Glyphosate-re-sistant and bollworm-resistant transgenic cotton plants with the
aroAM 12and Btslm genes[J].Acta Agronomica Sinica,2005,31
(1):108-113.
[8]朱玉.极端污染环境下草甘膦耐受菌株荧光假单胞菌G2的鉴
定及其EPSP 合成酶基因的克隆[D].北京:中国农业科学院,
2002.
Zhu Yu.Identification of glyphosate-tolerant Psedomonas fluo-rescens strain G2from extremely polluted environment and cloning of its EPSP synthase gene[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2002.
[9]刘锡娟,刘昱辉,王志兴，等.转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷
酸合酶(EPSPS )基因抗草甘膦烟草和棉花的获得[J].农业生物技术学报,2007,15(6):958-963.
Liu Xijuan,Liu Yuhui,Wang Zhixing,et al.Generation of glyphosate-tolerant transgenic tobacco and cotton by transforma-tion with a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EP-
SPS )gene [J].Journal of Agricultural Biotechnology,2007,15
(6):958-963.,
[10]赫福霞,郎志宏,陆伟，等.以耐草甘膦2mG 2-epsps 基因为选
择标记的玉米转化体系的建立[J].生物技术通报,2008(5):
92-97.
He Fuxia,Lang Zhihong,Lu Wei,et al.The establishment of maize transformation system with a glyphosate-tolerant 2mG 2-epsps gene as a selectable marker[J].Biotechnology Bul-letin,2008(5):92-97.
[11]孙鹤,郎志宏,陆伟，等.转2mG 2-epsps 基因烟草的草甘膦耐
受性分析[J].中国农业科技导报,2009(4):100-106.
Sun He,Lang Zhihong,Lu Wei,et al.Analysis of glyphosate tolerance in transgenic tobacco with 2mG 2-epsps gene[J].Jour-nal of Agricultural Science and Technology,2009(4):100-106.[12]Lin Chao,Fang Junxu,Zhao Xiaoli,et al.A built-in strategy for
containment of transgenic plants:creation of selectively ter-minable transgenic rice[J].PLoS ONE,2008,3(3):e1818.[13]燕树锋,陈进红,梅磊，等.市售草甘膦除草剂对转基因抗草甘
膦棉花幼苗生长的影响[J].棉花学报,2011,23(5):408-413.
Yan Shufeng,Chen Jinhong,Mei Lei,et al.The effects of com-mercial glyphosate herbicide on the seedlings of transgenic cot-ton with glyphosate resistance[J].Cotton Science,2011,23(5):408-413.
[14]Zhao Te,Lin Chaoyang,Shen Zhicheng ．Development of
transgenic glyphosate-resistant rice with G6gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase [J]．Agricultural Sciences in China,2011,10(9):1307-1312.
[15]何卓培,周庆祺.耐受草甘膦抗枯萎病棉花新种质PI39l0[J].
作物品种资源,1995(4):26.
He Zhuopei,Zhou Qingqi.New germplasm with glyphosate re-sistance and resistance to fusarium wilt of cotton PI39l0[J].Crop Germplasm Resources,1995(4):26.
[16]祝水金,汪静儿,俞志华，等.棉花抗草甘膦突变体筛选及其在
杂种优势利用中的应用[J].棉花学报,2003,15(4):227-230.
Zhu Shuijin,Wang Jinger,Yu Zhihua,et al.A cotton mutant re-sist to glyphosate and its utilization in cotton heterosis[J].Cot-ton Science,2003,15(4):227-230.
[17]巩元勇,郭书巧,束红梅，等.陆地棉水通道蛋白GhNIP 6.1基
因的克隆及表达分析[J].棉花学报,2013,25(1):1-8.
Gong Yuanyong,Guo Shuqiao,Shu Hongmei,et al.Cloning of aquaporin gene GhNIP 6.1from the upland cotton and its ex-pression in different cotton tissues[J].Cotton Science,2013,25(1):1-8.
巩元勇等：1株抗草甘膦棉花突变体草甘膦抗性的初步鉴定1期
23
棉花学报26卷
[18]孙志栋,王学德,倪西源,等.棉花DNA提取方法的探讨[J].浙
江农业学报,2004,16(4):177-181.
Sun Zhidong,Wang Xuede,Ni Xiyuan,et al.Primarily study on isolation of genomic DNA from cotton[J].Acta Agriculturae Zhejiangensis,2004,16(4):177-181.
[19]胡根海,喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA
[J].棉花学报,2007,19(1):69-70.
Hu Genhai,Yu Shuxun.Extraction of high-quality total RNA n cotton leaf with improved CTAB method[J].Cotton Science, 2007,19(1):69-70.
[20]Pline W A,Wilcut J W,Duke S O,et al.Tolerance and accumu-
lation of shikimic acid in response to glyphosate applications in glyphosate-resistant and nonglyphosate-resistant cotton (Gossypium hirsutum L.)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(3):506-512.[21]Tong X H,Daud M K,Sun Y Q,et al.Physiological and molec-
ular mechanisms of glyphosate tolerance in an in vitro selected cotton mutant[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2009，94(2/3):100-106.
[22]Dill G M,Cajacob C A,Padgette S R.Glyphosate-resistant
crops:adoption,use and future considerations[J].Pest Manage-ment Science,2008,64:326-331.
[23]Hermann K M,Weaver L M.The shikimate pathway[J].Annual
Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1999, 50:473-503.
[24]Schonbrunn E,Eschenburg S,Shuttleworth W A,et al.Interac-
tion of the herbicide glyphosate with its target enzyme5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase in atomic detail[J].Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98:1376-1380.●
24
本技术涉及二代测序分析领域的基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。该方法包括：获取新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；过滤与正常样本变异位点集重合的位点；过滤未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点；过滤生殖细胞突变和高频突变位点。本技术以PON、以基于石蜡切片组织特征的特异性训练体细胞突变位点过滤阈值以及以已有数据库过滤生殖细胞突变和高频突变位点作为体细胞突变检测的过滤条件，能够快速剔除大部分由石蜡切片制备造成的假阳性结果，提高检测效率和特异性，快速精准检测石蜡切片体细胞突变。 权利要求书 1.基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取正常组织石蜡切片样本的测序结果，将所述测序结果与人类参考基因组比对，所得比对数据构建正常组织石蜡切片样本的正常样本变异位点集； 分别获取同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的测序结果，基于测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿
瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变； 对比所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值； 分别获取待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，得到原始变异结果； 过滤所述原始变异结果中与正常样本变异位点集重合的位点，得到第一体细胞突变结果； 过滤所述第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突变结果； 过滤所述第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，即得待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变结果； 所述过滤参数包括体细胞变异位点的测序深度总和、变异等位基因频率、链偏好性、Read 朝向偏好性、测序质量值、胚系突变干扰值、污染物干扰值、碱基质量值中位数、平均比对质量值、片段长度中位数、reads末端距离中位数、假阳性优势对数、覆盖reads总数、位点杂合纯合性优势对数、短片段重复次数、链偏好质量值、聚合酶滑动质量值中的一种或一种以上；针对所述过滤参数设定阈值。 2.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述过滤参数包括变异等位基因频率、链偏好性和Read朝向偏好性中的一种或一种以上。 3.根据权利要求2所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述链偏好性的计算公式为：链偏好性 = 正向读长深度 / 所有读长深度； 所述Read朝向偏好性的计算公式为： 其中，SOB表示Read朝向偏好性；
植物转基因育种概述 https://www.doczj.com/doc/b82926337.html, 来源：中学生物学 作者：李志翔 日期：2007-10-1 为了培育高产、优质、抗逆性强的作物新品种，需将一种植物的优良遗传性状转移到另一种植物体中。若采用传统的杂交育种法进行随机筛选或通过组织培养、理化诱变、细胞融合等方法定向筛选优良性状培育新品种，其盲目性较大，筛选效率低，又有明显的种属界限而产生一定的生殖障碍，成功率不高。目前发展起来的植物基因工程技术则能有效地解决上述难题。通过特定目的基因的定向转移，其遗传变异频率比自发突变高出102～104倍，选择效率高，大大地避免了盲目性；又由于基因来源广泛，打破了种属界限，可以克服杂交育种过程中的生殖障碍，成功率提高。因此，植物基因工程技术已成为作物遗传育种的有效新途径，倍受重视。通过基因工程技术定向转移基因后获得的植物，称为转基因植物。 自1983年世界上首次成功获得第一株转基因植物以来，植物基因工程技术已广泛应用于作物品质改良、抗病性、抗虫性、抗病毒性、抗除草剂、杂种优势的利用等方面。迄今，全世界至少有300多种基因（性状）用于转化植物、微生物和动物。许多转基因产品已陆续投放全球市场，经济效益显著。 1 抗病毒转基因植物 植物病毒病是我国农业生产上最主要的病害之一，对我国的粮食作物、经济作物及果树蔬菜均造成严重危害， 经济损失巨大，但迄今缺少有效的化学防治方法。目前
人们已经可以通过植物基因工程技术，获得抗病毒转基因植物，以控制植物病毒的危害。其原理是： 一是利用植物生物技术，将病毒外壳蛋白基因或卫星RNA基因转入到植物基因组中，并获得转基因植株。这些植株叶片细胞中就会有病毒外壳蛋白或卫星RNA的表达和积累，就能够抑制相应的侵染病毒的RNA复制，从而可以减弱病毒病的症状或推迟病毒病发生时间，即具有一定的抗病毒能力。二是将病毒的反义RNA的相应DNA序列重组到植物的基因组里，使其合成反义的RNA。当植物被相应的病毒感染时，病毒的mRNA就可能与植物细胞中合成、积累的病毒反义RNA结合而无法反向复制和转录，从而控制病毒对植物的危害。 1.1 抗烟草花叶病毒的转基因植物 烟草花叶病毒（TMV）是一种RNA病毒，由单链RNA及外壳蛋白组成。研究证明，TMV侵染植物后，其外壳蛋白具有抑制新侵染相应病毒释放mRNA的作用。目前已成功地将TMV外壳蛋白基因转入到烟草细胞中，表达了病毒蛋白并对该病毒产生了抗性。 1.2 抗黄瓜花叶病毒转基因植物 黄瓜花叶病毒（CMV）对农作物危害极为严重，可侵染上千种植物。目前人们已成功地将CMV的卫星RNA基因转入到烟草、辣椒、甜瓜、番茄和矮牵牛等植物中，在植物体内合成、累积的卫星RNA，可以抑制相应的病毒RNA的复制，能显著减轻病毒的危害。 此外，人们还培育出了抗苜蓿花叶病毒（AMV）、抗烟草环斑病毒（TobRV）的转基因植物，抗病毒效应都非常显著。
棉铃虫是棉花生产的主要害虫之一，在抗虫棉没有推广应用前，当棉铃虫大发生时，均会给农民以及棉花产业带来严重的损失。由于棉铃虫防治只能依靠农药，而棉铃虫也逐渐对农药产生抗性，致使1992年棉铃虫在我国棉区大爆发，我国当年杀虫剂纯农药的生产量只有20万t，其中为防止棉铃虫就消耗15万t左右。出现了农药打不死棉铃虫，反而还威胁到人畜及生态的安全，也导致整个国家出现“棉荒”现象，造成严重的经济损失。1991年国家“863”计划开始启动转基因抗虫棉的研究，充分利用生物分子技术来解决常规育种技术难以解决的问题。经过二十多年的努力，我国已初步形成了基础研究、应用研究到产品开发的较为完整的技术体系，目前我国转基因抗虫棉整体发展处于国际先进水平。 1转基因抗虫棉创新与发展 1.1 转基因抗虫棉研究与创新 转基因抗虫棉是利用分子生物学技术将外援基因或经修饰的基因转移到棉株中，从中分离得到所需要的基因。常规杂交育种也属于一种转基因技术，但是它只能在有限的范围内对作物的遗传基因进行改良，并不能做到针对某一优良性状进行定向改造。因此，转基因技术是传统遗传育种技术的发展与创新，也将是我国未来农业发展的必然趋势。 1983年，世界首例转基因烟草培育成功；1986年，抗虫和抗除草剂的转基因棉花进入田间试验阶段；1990 《种子法》规定：销售的种子必须进行包装，而且要附有标签。购种时一看种子袋表面是否印有“作物种类、品种名称、生产商、质量指标、净含量、生产年月、警示标志(一般是对包衣种子而言)和‘转基因’标准”等内容(这些项目必须外标)，如果没有可认为是假种子；二看种子袋内是否装有内标牌，标牌上是否印有种子经营许可证、生产许可证、检疫证编号、生产商地址、联系方式和使用说明，如果没有、不全或与实物不符，说明种子来历不明或者是假种子。 3.3 注意检查种子包装是否规范 查看包装物的质地、印刷质量、字迹是否清楚、有无粘贴等。代销点不能随意拆袋，以防混入假劣种子。有的包装袋上注明严禁拆口销售。 3.4 仔细查看种子 正常的当年种子大小一致、籽粒饱满、色泽鲜亮，近闻有正常的谷香味。谷物类种子还要摸一摸、看一看含水量是否超标。双手插到种子袋中间感到凉、不粘手、掰开后茬口齐的种子含水量较低，反之含水量高，贮存时容易霉变。注意种子的生产年月，避免购买超过一个生长周期的种子，种子保存的时间长短，将影响其发芽率。 3.5 选择适宜品种 要根据当地气候、茬口选择适宜品种。不可只注重品质、产量等因素，盲目选择。 3.6 索取销售发票 购买时与商家索取销售发票，并在发票上注明品种名称、数量、价格、地点及时间，妥善保管。销售发票是购种的凭证，是有效的证据。播种开始时保存少量购买的种子作为样本，以备用。如果种子质量有问题，可以委托种子质量监督检验部门检验，凭检验报告要求种子经营单位予以赔偿，或到种子管理部门投诉。 3.7 仔细阅读种子使用说明和注意事项 仔细阅读种子使用说明和注意事项，不明事项要及时咨询，以免操作失误，影响产量和品质。对于瓜菜类及反季节栽培用的种子，一定要注意适宜的栽培时间(温度)和地点(气候类型)。 （收稿日期：2013—12—15） （本栏责任编辑：刘中漱） 徐福海1 许 泉1，2 王元慧1 康 勇1，2 张 莉1 金夏红1，2 （1 南京神州种业有限公司 210095 2 南京农业大学） 摘 要 转基因抗虫棉是我国唯一获准商品化生产的转基因作物，本文对抗虫基因的分离与转基因棉株的获得及抗虫棉的抗性原理进行了探讨。转Bt基因抗虫棉不同生育阶段，不同部位对棉铃虫的抗性，抗虫棉的研制成功与大规模产业化保障我国棉花稳步发展，增加农民收入保护环境作出了重要贡献。 关键词 转基因抗虫棉 抗性研究 利用技术 doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.011
实验一主要农作物有性杂交技术 适用对象——本科农学专业 实验学时——3学时 实验类型：技术验证性实验 一、实验目的 l.以水稻为练习材料，熟悉水稻的花器构造和开花习性 2. 通过练习，掌握水稻有性杂交的方法与技术 3. 熟悉水稻杂交育种的一般程序 4.了解玉米、小麦、花生、大豆等作物的开花生物学特性和有性杂交关键技术 二、实验原理 1.花器构造 水稻(Oryza sativa，L．)属禾本科(Gramineae)稻属(Oryza)，是雌雄同花的自花授粉作物。稻穗属复总状圆锥花序，由主轴、枝梗、小枝粳组成。在小枝梗上着生小穗，每个小穗由基部的两片退化颖片（通常称为副护颖）、小穗轴和3朵小花构成。3朵小花中，顶端一朵为完全花，其下两朵均退化，仅见两片不孕外稃(通称为护颖)。可育小花有外稃（通称外颖），内稃(通称内颖)，2个浆片(通称鳞被)、6枚雄蕊和1枚雌蕊。雌蕊位于颖花基部的中央，子房一室，内藏一个胚珠；花柱先端分开成羽毛状柱头。雄蕊6枚，花丝从子房的基部生出，花药四室，长形，每个花药内约有1000粒花粉。子房与外颖间有两个小鳞片，鳞片呈圆形、白色、肉质，起着调控颖花开放的作用。 玉米（Zea mays L.）属禾本科（Gramineae）、玉米属（Zea），雌雄同株异花授粉作物。雄穗由植株顶端的的生长锥分化而成，为圆锥花序，由主轴和侧枝组成。主轴上着生4～11行成对排列的小穗，侧枝仅有2行成对小穗。每对小穗中，有柄小穗位于上方，无柄小穗位于下方。每个小穗有2枚成对护颖，护颖间着生2朵雄花，每朵雄花含有内外颖、鳞被各2枚，雄蕊3枚，雌蕊退化。 雌穗一般由从上向下的第6～7节的腋芽发育而成，为肉状花序。雌穗外被苞叶，中部为一肉质穗轴，在穗轴上着生成对的无柄雌小穗，一般有14～18行，每小穗有2枚颖片，颖片内有2朵雌花，基部的1朵不育，另1朵含雌蕊1枚，花柱丝状细长，伸出苞叶之外，先端二裂，整条花柱（俗称花丝）长满茸毛，有接受花粉能力。 小麦(T. aestivum L.)属禾本科（Gramineae）、小麦属（Triticum），是雌雄同花的自花授粉作物。麦穗属复穗状花序，由许多互生的小穗组成，小穗基部着生两个护颖和3-9朵小花，但正常发育的都是基部的2-5朵小花，小穗上部的小花往往退化。每朵小花自外向里有外颖、内颖各1片；鳞片2个；雄蕊（花丝、花药）3个；雌蕊（子房、柱头、花柱）1个，呈羽毛状分裂。外颖顶端有芒或无芒。 花生（Arachis hypogaea）属豆科（Fabaceae），蝶形花亚科（Faboideae），落花生属(Arachis)，落花生（ A. hypogaea），自花授粉作物。花生的花是两性完全花，总状花序，着生在主茎或侧枝叶
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 ［５６］ＸｕＨ，ＣａｉＺＣ，ＪｉａＺＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎｗｉｎｔｅｒ ｃｒｏｐｓｅａｓｏｎｏｎＣＨ４ｅｍｉｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｆｌｏｏｄｅｄａｎｄｒｉｃｅ－ｇｒｏｗｉｎｇｐｅｒｉｏｄ［Ｊ］．ＮｕｔｒｉｅｎｔＣｙｃｌｉｎｇｉｎＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，２０００，５８（１／２／３）：３２７－３３２． ［５７］熊正琴，邢光熹，鹤田治雄，等．豆科绿肥和化肥氮对双季稻稻 田氧化亚氮排放贡献的研究［Ｊ］．土壤学报，２００３，４０（５）：７０４－７１０． ［５８］徐昌旭，谢志坚，曹卫东，等．翻压绿肥后不同施肥方法对水稻 养分吸收及产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（３）：３５－３９． ［５９］黄 晶，高菊生，刘淑军，等．冬种紫云英对水稻产量及其养分 吸收的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１３（１）：８８－９２． ［６０］徐昌旭，谢志坚，许政良，等．等量紫云英条件下化肥用量对早 稻养分吸收和干物质积累的影响［Ｊ］．江西农业学报，２０１０，２２（１０）：１３－１４，２３． ［６１］郭晓彦，宋晓华，刘春增，等．紫云英翻压量和化肥用量对水稻 生长、产量及经济效益的影响［Ｊ］．山地农业生物学报，２０１４，３３（５）：７－１２． ［６２］高菊生，曹卫东，董春华，等．长期稻－稻－绿肥轮作对水稻产 量的影响［Ｊ］．中国水稻科学，２０１０，２４（６）：６７２－６７６．［６３］曾庆利，龚春华，徐永士，等．紫云英不同翻压量对水稻产量和 产值的影响［Ｊ］．湖南农业科学，２００９（６）：７６－７７，８８．［６４］谢志坚，徐昌旭，许政良，等．翻压等量紫云英条件下不同化肥 用量对土壤养分有效性及水稻产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（４）：７９－８２． ［６５］李双来，李登荣，胡 诚，等．减施化肥条件下翻压不同量紫云 英对双季稻生长和产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１２（１）：６９－７３． ［６６］卢 萍，杨林章，单玉华，等．绿肥和秸秆还田对稻田土壤供氮 能力及产量的影响［Ｊ］．土壤通报，２００７，３８（１）：３９－４２． 陈银竹，丁 伟，刘胜男，等．草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１６）：５６－５９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１６．０１３ 草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究 陈银竹１，丁 伟１，刘胜男１，ＭｕｈａｍｍａｄＳｈａｈｉｄｋｈａｎ １，２ （１．东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨１５００００；２．白沙瓦农业大学，巴基斯坦白沙瓦１５９９１０７） 摘要：采用草甘膦种子和茎叶处理研究转基因抗草甘膦大豆的安全性，为减少草甘膦用量和转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。以转基因抗草甘膦大豆为试材，采用田间随机区组设计方法，测定转基因大豆的生理指标 和杂草防除效果。结果表明，５６２．５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２草甘膦种子处理和１１２５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２ 草甘膦茎叶处理后，除莽草酸含 量不受影响，转基因大豆的株高、鲜质量、干质量、叶绿素含量以及光合速率各项生理指标均在施药初期受到抑制，茎叶处理后２８ｄ、种子处理播种后６１ｄ时各生理指标均可恢复正常；草甘膦茎叶处理对杂草具有显著的防除效果，草甘膦施用后７ｄ，杂草防效为９４．６７％，２８ｄ，杂草防效为７２．３３％，且对大豆安全。草甘膦种子和茎叶处理对转基因抗草甘膦大豆均具有较好的安全性，且茎叶处理能有效控制杂草。 关键词：草甘膦；转基因抗草甘膦大豆；安全性；杂草防除效果；生理生化 中图分类号：Ｓ４５１．２２＋４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１６－００５６－０４ 收稿日期：２０１７－０３－０７ 基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：２０１５ＺＸ０８０１１－００３）；黑龙江省留学归国人员基金（编号：ＬＣ２０１１Ｃ０１）。 作者简介：陈银竹（１９９２—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事杂草生物学与转基因作物安全评价研究。Ｅ－ｍａｉｌ：９４００８１８２２＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：丁 伟，博士，教授，研究方向为农药生态安全与转基因作物安全评价。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｗｅｉ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 近年来，基因工程技术发展势头迅猛，种植业中以转基因抗草甘膦大豆的发展最为迅速。而大豆为我国重要的粮食作物，杂草防除一直是大豆种植过程中的重点问题。化学除草是大豆田防除杂草的重要手段，近几年大豆田化学除草面积 已达其播种面积的９０％以上［１］ 。转基因抗草甘膦大豆的出 现便为人们提供了一种能有效控制杂草的新途径，不仅大大降低了除草成本和劳动强度，并且有效延缓了大豆田抗性杂草的出现，除草剂药害的发生也明显降低，已成为美洲地区大 豆田杂草防除的重要方法之一。草甘膦由美国孟山都公司研 制开发，目前是世界上除草剂使用量最大的品种之一［ ２］ 。草甘膦通过抑制莽草酸途径中的５－烯醇式丙酮莽草酸－３－磷酸合成酶（ＥＰＳＰＳ），使微生物和植物不能合成生存必需的 芳香族氨基酸而导致死亡［３－４］ 。其特点是杀草谱广、传导性 好、残效低，在转基因抗草甘膦大豆整个生育期都可以使用。国内外普遍将草甘膦应用于茎叶处理，而对应用草甘膦进行种子处理的安全性和杂草防除效果鲜有研究。本试验通过草甘膦种子处理和茎叶处理研究草甘膦的安全性，为减少草甘膦的用量和我国当前自主研发的转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。 已有的研究表明，一定浓度的草甘膦会造成转基因大豆叶片的叶绿素含量降低、叶绿体结构变化和光合速率下降，叶绿素恢复过程需要２周左右， 莽草酸含量几乎没有变化［ ５－１１］ 。Ｂｅｌｌａｏｕｉ等研究表明，草甘膦会影响转基因抗草甘膦大豆的碳代谢和氮代谢［１２］ 。种子用草甘膦溶液浸泡后播 于土壤中，敏感的大豆种子浸泡４ｈ后不能发芽，而转基因种 —６５—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１６期
转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组 后的草甘膦抗性分析 水稻是世界上重要的粮食作物,在我国国民经济中占有重要地位。稻田除草贯穿于水稻的整个生产过程中,增加了相当一部分劳动力和经济投入。 化学除草剂的使用为降低水稻生产成本具有非常重要的意义,草甘膦是广谱、高效、低毒、廉价的内吸传导型除草剂,但因其对水稻也具有致死作用而无法在稻田大面积使用。通过基因工程手段培育具有草甘膦抗性的转基因水稻不仅能够节约稻田除草的成本、减少劳动力投入、降低除草剂使用量还能提高农民收入具有非常好的应用前景。 但是随着转基因技术的不断发展,转基因安全性问题也受到广泛关注,尤其 是花粉介导的的外源基因飘流问题,一直是公众和部分科研界人士的关注热点, 通过基因拆分技术能够在很大程度上降低转基因飘流的频率。因此,本研究将表达G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因转入水稻,培育抗草甘膦转基因水稻,探索转 G2-aroA基因水稻对草甘膦的抗性。 并通过基因拆分技术研究通过Intein介导拆分的G2-EPSPS蛋白在转基因水稻杂交后代中重新组装后的草甘膦抗性与转完整G2-aroA基因水稻抗性的区别,研究拆分后蛋白质重新组装效率,为基因拆分技术限控水稻基因飘流的应用提供数据支撑。研究结果如下:1.抗草甘膦水稻的培育及转化事件特异性检测方法的建立1)将转基因水稻G2-6、G2-7与非转基因对照中花11分别浸入到0、50、100 ppm草甘膦溶液中,进行萌芽期草甘膦耐受程度测试,发现50 ppm下中花11的萌发受到明显抑制,在100 ppm下,萌出的胚芽很快腐烂。 与之相比,G2-6和G2-7在50 ppm和100 ppm下的生长均与对照组无明显差
现代分子植物育种与粮食安全研讨会论文集 1 Pi-ta、Pi-b基因在江苏粳稻穗颈瘟抗性育种中的价值分析王军，杨杰，范方军，朱金燕，杨金欢，仲维功《华北农学报》, 2012, 27(6):141-145 2 利用CSIL改良新疆陆地棉品系纤维品质的研究曹志斌，郭旺珍，张天真 3 转基因高油酸甘蓝型油菜新种质研究陈松，张洁夫，浦惠明，申爱娟，陈峰，龙卫华，胡茂龙，周晓婴 4 优质高产早熟糯玉米杂交种选育方法研究陈艳萍，袁建华，孟庆长，赵文明，孔令杰，郑飞 5 应用亲缘系数分析江苏花生品种的遗传多样性陈志德，沈一，刘永惠 6 水稻重组自交系分子遗传图谱构建及分蘖角的QTL检测董少玲，张颖慧，张亚东，陈涛，赵庆勇，朱镇，周丽慧，姚姝，王《江苏农业学报》2012年02期 7 水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病的抗性与籼粳分化的关系范方军，杨杰，王军，朱金燕，杨金欢，仲维功，《中国水稻科学》2013年05期 8 小麦-加州野大麦异染色体的选育和鉴定方宇辉，袁静娅，王海燕，曹爱忠，赵彦，陈佩度，王秀娥， 9 油菜β-CT亚基编码基因accD的SNPs分析及其分子进化付三雄，张洁夫，陈锋，顾慧，陈松，浦惠明，龙卫华，胡茂龙，高 10 玉米功能性insertion/deletion(Indel)分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用葛敏，张体付，韦玉才，赵涵 11 SRAP标记预测甘蓝型油菜常规品种间杂种优势顾慧，付三雄，戚存扣，张洁夫，浦惠明，陈松 12 小麦黄花叶病抗性QTLQYm.nau-2D的精细定位郭娇，吴真真，朱晓彪，王海燕，曹爱忠，肖进，游明安，别同德 13 油菜2个谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达胡茂龙，龙卫华，高建芹，陈新军，张洁夫，陈松，浦惠明，戚存扣 14 利用水稻花药培养技术创新种质资源胡婷婷，刘超，王健康，丁成伟，郭荣良，吴玉玲，徐家安，王友霜 15 甘薯AFLP分析改进的PAGE银染方法靳容，后猛，闫会，李强，马代夫 16 玉米转录因子基因ZmWRKY33的克隆及功能分析黎华，高勇，张娟，张媛，陈建民
第八章被子植物习题 一、名词解释 1、合蕊柱：兰科植物花中1或2枚雄蕊和花柱(包括柱头)完全愈合而成一柱体，称合蕊柱。 2、单体雄蕊：雄蕊多数，花药分离，花丝彼此连台成一束或管状，这样的雄蕊群称单体雄蕊。 3、蝶形花冠：蝶形花冠即为由旗瓣、翼瓣和龙骨瓣按下降覆瓦状排列的两侧以称的离瓣 花冠，是蝶形花科的主要特征之一。 4、双悬果：双悬果由二心皮二室有棱或有翅的子房发育而来，成熟时沿两个心皮合生面 分离成两个分果片，顶部悬挂于细长丝状的心皮柄上，称为双悬果，也称双瘦果。 5、舌状花：舌状花是菊科头状花序中一种花冠成舌状、两侧对称的小花。 二、判断题 1、配子体进二步退化是被子植物的一个进化特征。( √) 2、裸子植物和被子植物的胚乳都具有相同的功能和来源。( ×)- } 3、被子植物大多为草本、灌木，而裸子植物大多为高大乔木。所以裸子植物孢子体更为发达，被子植物的进化趋势是孢子体逐渐退化。 (×)- 4、植物的各种性状中，辐射对称的花是原始的，两侧对称及不对的花是次生的；常绿比落叶原始。(√) 5、毛莨科植物多为有毒植物和药用植物，因其含有多种生物碱。 ( √) 6、毛莨属花瓣基部有一蜜腺穴，为虫媒传粉的标志之—。( √) 7、木兰目花被多3基数，显示了与单子叶植物的联系。( √) 8、木兰科植物花各部均螺旋旋状排列。( ×)- 9、三出脉是樟科植物共有的一种特征。( ×) – 10、有无乳汁是判断是否为桑科植物的一个关键性特征。( ×) - 11、胡萝卜属于十字花科，为一种蔬菜。( ×) － 12、扶桑不属桑科，玉竹不属禾本科竹亚科，巴豆不属豆目。( √) [ 13、木瓜不属葫芦科，罗汉果不属罗汉松科。( √) 14、合欢花的观赏价值在于其花丝长而呈淡红色。( √) 15、绣线菊亚科植物多具蔷荚果，少为蒴果，菩英果由离生心皮发育而来，是初生性状(或原始性状)，蒴果由合生心皮(复雌蕊)发育而来，是次生性状(或称进化性状)。( √) 16、两体雄蕊就是10枚雄蕊中9枚合生，1枚单独着生。( ×) -- 17、荚果由单心皮子房发育而来，而角果是由二心皮子房发育而来。( √) 18、龙眼、荔枝为无患子科的著名水果。( √)
抗草甘膦转基因大豆的操作步骤 转基因大豆可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这种大豆被称为转基因大豆。而这种转基因技术终于走出实验室和试验田，进入像玉米、大豆和棉花作物的日常耕作。 抗草甘膦转基因大豆针对草甘膦的作用机理，导入能够使植物表达更多的4252合成酶的基因，使植株对草甘膦不敏感从而能够忍受正常剂量或更高剂量的草甘膦而不被杀死。从鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌中可以直接分离出抗草甘膦的4252编码AroA，美国Monsonto公司利用该机制将该抗性基因导入大豆中成功地获得了抗草甘膦转基因大豆。这种转基因大豆对草甘膦的忍耐能力是普通大豆的69倍，从而使大豆田中的绝大部分一年生或多年生杂草得到控制而大豆本身不受伤害。除了抗草甘膦作物之外，还有抗草丁膦除草剂的作物，不过草丁膦与草甘膦杀灭植物的原理并不相同，而培养这两类作物所转的基因也不同。而当前转基因大豆主要用来提炼大豆油。 抗草甘膦转基因大豆的操作步骤;（1）分离克隆基因，搞清楚基因功能。（2）构建表达载体，也就是运输工具，即质粒或载体。（3）遗传转化，也就是所说的转基因，利用各种方法，把备转移的质粒DNA转移到植物细胞的细胞核中，让外源DNA在细胞中复制。本次使用的转基因方法是根癌农杆菌法。根癌农杆
菌是一种土壤农杆菌，在它的细胞中有一个环形的质粒，叫Ti 质粒，质粒上有一段可转移的DNA，叫T-DNA。这段T-DNA 上带有编码肿瘤的基因，根癌农杆菌侵染大豆后，这段T-DNA 可以切下来，转移到大豆的细胞中，是植物中产生肿瘤。把T-DNA 编码肿瘤的基因切除，插入所需转移的目的基因上，使大豆具有新的特性。转入目的基因的同时，还需转入一个选择标记基因，以便后面筛选和鉴定出转化的细胞。即获得目的基因的细胞是少数，大多数仍是非转基因的细胞，要筛选出转化的细胞，需要在转化后把非转基因细胞杀死。本次使用的标记基因是除草剂抗性标记基因，在培养大豆细胞阶段，在培养基中加入抗草甘膦除草剂，没有转入的基因的细胞不具有抗除草剂。在转基因大豆幼苗期，使用飞机或大型机动喷雾器对转基因大豆直接喷洒草甘膦，大豆苗长高封行后，收割前五十天左右不用再喷洒，等待收割即可。草甘膦杀死了除抗除草剂转基因大豆以外的杂草，使产量提高。转基因大豆的草甘膦残留一般很低，或者根本检测不出，五十天时间草甘膦残留几乎为零。 抗草甘膦转基因大豆的优缺点：优点（1）增加粮食生产、减少生产的投入，有助于解决世界范围的粮食问题（2）转基因大豆具有抗病虫害、抗除草剂的特性，可减少杀虫剂、除草剂的使用，有利于环境保护。（3）通过利用某些基因，增加食物品种，改善食物品质，使食物更加可口。缺点（1）转基因技术使不同物种的基因相互融合，而对其后果却无法控制，因而可能造成基因污
从总体上讲，组织培养后植株变异的原因有三：一是由源植株中预先存在的变异的表达，二是组织培养过程中引起的可遗传的变异（DNA改变），三是由外遗传及生理作用引起。 （一）外植体中预先存在变异的表达 研究表明，某些体细胞无性系变异是由于外植体中细胞预先存在的变异的表达。一般说来，除非采用单细胞或原生质体，否则，对由不同类型细胞组成的多细胞外植体进行培养会导致再生植株表型的不一致性。预先存在变异包括内复制造成的细胞间染色体倍性差异，体细胞突变及DNA甲基化状态的变化等。由不定芽再生导致的嵌合体的分离（破坏、丢失或重排）是最明显的预先存在变异的表现。嵌合体一般可分为扇形嵌合体、部分周缘嵌合体和周缘嵌合体三种。前两种在常规繁殖中不稳定，而周缘嵌合体在常规繁殖中较为稳定，但即使是周缘嵌合体，利用组织培养进行快速繁殖或不定繁殖时，也会引起大部分嵌合体破坏（＞30%）。颜色、形态和生理习性嵌合体是可见的，而细胞嵌合体（染色体或染色体组不同的细胞）通常是难以直接观察到的，只对植株的营养价值、同工酶谱等表现有很小的影响。另一方面，由于病毒在植物体内不均匀分布，利用植物组织培养手段（分生组织培养、不定芽再生或原生质体培养等）可脱除植物病毒，从而也可引起性状的改变。 通常植物（指二倍体植物）的分生组织中都是二倍体细胞，所以采用顶端分生组织或幼嫩组织或器官作外植体进行启动培养，再生植株表型和倍性水平的稳定性远大于其他类型外植体培养获得的植株。 （二）培养中诱导产生的变异 培养中诱导产生的变异主要受培养类型（或植株再生方式）、外植体类型（或组织来源）、生长调节物质、培养物的年龄（或继代培养时间）、遗传组成（或基因型）等因素的影响。 1. 培养类型（或植株再生方式） 一般而言，一个已分化的细胞经历变化剧烈的脱分化和再分化很容易产生变异，因而愈伤组织培养常与体细胞无性系变异联系在一起；另一方面，愈伤组织通常从切口处产生，因而与活体中的伤口反应极为类似，容易激发转座子的活动，以及胁迫刺激诱导产生某种酶类或特异性附产物。因而商业微繁殖中尽量避免愈伤组织培养。体细胞无性系变异并不局限于愈伤组织培养，其它如直接不定芽发生和体细胞胚胎发生都可导致变异产生。 2. 外植体类型（或组织来源） 不同外植体类型产生的再生植株上的体细胞无性系变异频率和性质存在差异。一般而言，越衰老的、远离器官化分生组织生长程度高的或高度特化的组织进行培养，产生变异的机会越大，而幼龄的、预先存在分生组织或细胞的外植体（如顶芽、腋芽、分生组织）则很少发生，这是由于植物正常生长发育过程中常会伴随体细胞分化而使染色体组发生变化，如内多倍性、多线性、扩增或DNA序列的缩减等。但这并非绝对，例如从云杉胚性细胞系游离到的原生质体再生植株就没有产生变异。基于体细胞中染色体组变异程度，D’Amato（1985）将植物分为多体细胞（polysomatic）和非多体细胞（non-polysomatic）两种类型。在后一种植物类型中，已分化的体细胞与合子细胞的倍性水平一致，而前后一种植物类型则不同，会包含多倍性、甚至非整倍体细胞等。这种划分虽有理论上的意义，但在实际组织培养中很难区分，例如在Solanum brevidens组织培养中，从子叶再生的70%的植株为四倍体，而从叶片片段中再生的仅有20%为四倍体；而菊科植物花瓣再生的植株比花梗再生的植株更为多花，异常频率也更高；芳香的天竺葵植物从茎干再生植株的表型与对照无差异，而从根和叶柄再生的植株在形态上更易产生变异；马铃薯悬浮培养原生质体再生植株产生的变异要比叶肉原生质体再生植株产生的变异多。 3. 生长调节物质 生长调节物质的种类和浓度影响体细胞无性系变异的发生。生长调节物质可能起一种诱变剂的作用，但更多的证据表明其作用是通过细胞分裂、非器官化生长程度及特异细胞类型的优先增殖实现的。研究表明，生长调节物质可以影响DNA生物化学及有丝分裂器（纺缍丝）的功能，以及产生体外培养环境的选择压，并进一步引起有丝分裂异步。 组织培养中常用的几种调节物质都对DNA合成与多倍化有作用。2,4,5-T可在活体上诱导产生多倍体，2,4-D也可刺激DNA合成并引起内复制。内复制不稳定，容易发生核碎裂。2,4-D还可降低有丝分裂指数，并增加有丝分裂交
草甘膦与转基因作物 草甘膦与转基因作物有关系么？有，也没有。1970年，孟山都公司的化学家John E. Franz合成了草甘膦。1974年，草甘膦作为除草剂在美国成功登记注册。由于除草效果超级好，草甘膦受到广大农民的热烈欢迎。在草甘膦成功商业化20多年后，1996年第一例转基因抗草甘膦大豆问世了。草甘膦比转基因大20岁。 直接关系：在生产应用上，草甘膦与转基因抗除草剂作物建立了一一对应的关系。 在技术研发上，二者没有关系。 间接关系：由于使用草甘膦，而不用其它除草剂，转基因抗草甘膦作物中草甘膦的残留量相应增加，其他除草剂残留量相应减少。 转基因作物自身安全性与草甘膦农药的安全性没有关系。 抗草甘膦作物为什么能够抗草甘膦呢？ 找一种聪明的EPSPS酶，转到植物中去，它能够分得清草甘膦和PEP，并且更喜欢与PEP在一起。即使喷上草甘膦，它也能有效地找到PEP，发挥正常EPSPS
酶的功能。 比如占美国大豆种植面积90%以上的抗草甘膦大豆，就是被转入了一个来源于土壤中常见细菌的基因，因为分离得到这个基因的菌株叫CP4，这个基因表达出来的“聪明”酶就被命名为CP4 EPSPS。 抗草甘膦作物种植面积增加了，草甘膦使用量不就变多了吗？ 没错。但是草甘膦的用量上升了，其他除草剂的用量减少了，除草剂总的用量最终减少了。1996-2013年期间，仅转基因耐除草剂棉花大规模种植就使得除草剂用量减少了两万多吨。并且，草甘膦是目前已知的对环境最友好的绿色农药,
没有之一。这么说，转基因技术和草甘膦的配套应用还促进了绿色环保。 草甘膦会残留在食物中吗？ 当然会，但残留量很低，远小于联合国粮农组织和世界卫生组织建议的摄入量。在耐草甘膦作物中，大部分草甘膦通过根系排放到土壤中，少部分留在植株中,主要被代谢为AMPA，并进一步转化为简单化合物及天然产物，并且，草甘膦残留量在作物不同部位差异很大，籽粒中的残留明显低于其他部位。 国际食品法典委员会（CODEX）对草甘膦在各类食品中的最大残留量有明确规定。玉米为每公斤5毫克，大豆为每公斤20毫克。 联合国粮农组织和世界卫生组织的下属农药残留专家联席会议（JMPR）在2011年建议，草甘膦每日最大摄入量（ADI）为每公斤体重0至1毫克。结合CODEX 最大残留量规定，成年人一天中要吃4公斤大豆，或16公斤玉米才会达到JMPR 所建议的草甘膦每日最大摄入量。 2015年11月12日，欧盟食品安全局（EFSA）和欧盟成员国完成对草甘膦的重新评估。评估小组结论是草甘膦不大可能对人类有致癌风险。按照欧盟法规（EC）1272/2008号，这些证据不支持将草甘膦归为潜在致癌性一类。2016年欧盟委员会根据欧盟实施条例（EU）2016/1056决定续登记草甘膦至2017年12月31日。
药用植物学试题 一、单项选择题(本大题共20小题，每小题1分，共20分)在每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的，请将其代码填写在题后的括号内。错选、多选或未选均无分。 1．光学显微镜的有效放大倍数一般不超过( D ) A．100倍 B．500倍 C．1000倍 D．1200倍 2．输导组织中，横壁上有穿孔的属于( B ) A．管胞 B．导管 C．筛管 D．伴胞 3．具有不均匀加厚的初生壁的细胞是( A ) A．厚角细胞 B．厚壁细胞 C．薄壁细胞 D．导管细胞 4．叶的细胞中含有大量叶绿体的是( B ) A．上表皮 B．栅栏组织 C．海绵组织 D．下表皮 5．维管束进入胚囊的通道称( B ) A．珠心 B．珠孔 C．合点 D．主脉 6．无胚乳种子通常具有发达的( D ) A．胚根 B．胚茎 C．胚芽 D．子叶
7．李时珍的《本草纲目》的分类方法属于( B ) A．自然分类系统 B．人为分类系统 C．药用部位分类系统 D．主要功效分类系统 8．藻体的内部分化成表皮、皮层和髓三部分的藻类是( C ) A．水绵 B．海带 C．紫菜 D．石莼 9．啤酒酵母菌、麦角菌、冬虫夏草菌为_______植物。( B ) A．担子菌亚门 B．半知菌亚门 C．子囊菌亚门 D．藻状菌亚门 10．苔藓植物的孢子体_______在配子体上。( B ) A．腐生 B．寄生 C．共生 D．借生来源:考试大-自考 11．隐头花序是_______的特征之一。( A ) A．桑科 B．胡桃科 C．三白草科 D．蓼科 12．葫芦科植物的雌蕊由_______个心皮构成。( D ) A．1 B．2 C．3 D．4 13．唇形科的雄蕊类型为( C ) A．单体雄蕊 B．聚药雄蕊 C．二强雄蕊 D．四强雄蕊 14．金毛狗脊属于( C ) A．石松亚门 B．水韭亚门 C．真蕨亚门
两个水稻颖壳颜色突变体的遗传分析与基因定位水稻色素不仅对其自身生长发育有重要生理作用,而且在育种上及景观园艺应用等均比较广泛。在EMS诱变粳稻长粒粳(CLG)的突变体库内筛选到一个金黄色颖壳与节间突变体gh881。 与野生型相比,突变体的颖壳与节间均呈金黄色;除单株有效穗数外,gh881突变体的株高、每穗总粒数及实粒数、结实率和千粒重等主要性状均极显著降低。遗传分析和基因定位结果表明,gh881的表型受1对隐性核基因控制,位于第2号染色体短臂,并最终将该基因精细定位于标记FH-13和RH-25之间,物理距离约33.2Kb,该区域中包含四个开放阅读框(ORFs)。 序列分析结果表明,发现其中一个编码肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因 OsCAD2(Os02g0187800)的第3563bp处发生了一个单碱基突变(G转换为A),导致该基因编码区的第297位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸,由此认为该突变体表型为OsCAD2基因单碱基突变所致。qRT-PCR结果表明,突变体的节间中OsCAD2相对表达量极显著下调,而在剑叶叶鞘及穗部则基本极显著增加,其他相关基因也发生显著变化,证实OsCAD2是木质素代谢中的重要基因,且可能与其他相关基因存在反馈调节。 同时在该突变体库筛选出一个颖壳褐色与胚乳垩白突变体clg-642。与野生型相比,突变体颖壳颜色呈褐色,胚乳垩白度明显增大;胚乳扫描电镜图片及直链淀粉含量定量分析表明,突变体胚乳中淀粉颗粒排列疏松且呈圆形,直链淀粉含量较之野生型降低了17.5%;除单株有效穗数和株高与野生型没有显著差异外, 突变体clg-642的结实率、每穗总粒数、每穗实粒数和千粒重等主要农艺性状均 极显著降低。
●突变的不良后果:1.体细胞突变的而不良后果a体细胞突变与癌变b.体细胞突变与致畸c.体细胞突变的其他不良后果2.生殖细胞突变的不良后果a致死性突变b可遗传性突变 ●致畸实验的染毒时间:1.从着床到硬腭闭台期间染毒2.雌鼠妊娠的第7~15天染毒 ●外来化学物在消化道吸收的影响因素:1.当肠道蠕动降低时,吸收增加,而蠕动增强则肠道内容物加速,吸收减少2.外来物的溶解度和分散度对吸收也有影响,分散度较大的细颗粒与肠道上皮细胞接触较为密切,有利于吸收3.肠道中的酸碱度对吸收也有影响4.肠道内容物的状况能促进或阻止毒物的吸收,如果肠道内充满食物,蛋白质和黏液蛋白等可以减缓毒物的吸收 ●损害作用有哪些特点:1.机体的正常形态.生长发育过程受到严重的影响,寿命缩短2.机体的功能能量或对额外应激状态的代偿能力降低 3.机体维持内稳定的能力下降 4.机体对其他某些环境的不利影响的易感性增高 ●急性毒性试验的目的:论述题 ●LD50的局限性:1. LD50造成不必要的动物和资源的浪费2.从生物学角度, LD50没有恒定的数值3.人和动物对药物的敏感性差别很大4. LD50给予的有效信息十分有限5.新药所关注的是动物出现的毒性和剂量间的量效关系,通常没有要求出精确的LD50值 ●试验动物物种的选择:1.选择对受试物在代谢.生物化学和毒理学特征与人最接近的物种2.自然寿命不太长的物种3.易于饲养和实验操作的物种4.经济并易于获得的物种 ●致突变作用的机制:1.DNA损伤①碱基损伤.a.碱基配错b.平面大分子嵌入DNA链c.碱基类似取代物d.碱基化学结构的改变或破坏②DNA链损伤.a.二聚体的形成,b.DNA加合物形成c.DNA-蛋白质交联物的形成2.引起突变的细胞分裂过程的改变3.其他改变 ●实验动物性选择:雌雄各半和啮齿类和非啮齿类动物 ●发育毒性主要表现:生长迟缓.致畸作用.功能不全或异常.胚胎或胎仔死亡 ●独立性作用分类:速发和迟发;局部很全身;可逆和不可逆作用;过敏性反应,特异体质反应 ●毒理参数轴: ============================华丽丽分割线=============================== ●比较急性和慢性毒性试验:1.从实验目的上对比:急性毒性实验:a.求出受试化合物对一种或者几种试验动物的致死剂量,确定有无毒性,毒性大小,毒性作用特点 b.求改化合物的剂量----反应关系,为亚急性.慢性毒性试验等的剂量选择,种属选择和观察指标的选择提供依据 c.确定环境中受试化合物侵入机体的途径,研究化合物在机体的生物转化过程及毒代动力学 d.研究化合物急性中毒诊断,预防和急救治疗措施.慢性毒性实验:a.研究慢性毒性剂量-反应关系,确定长期接触造成有害作用的最低剂量和未造成有害作用的剂量b.观察慢性毒性效应普,毒作用特点和毒作用靶器官c.观察慢性毒性作用的可逆性 d.未毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据2.从实验设计上对比: 急性毒性实验:一次或者24h内多次对实验动物的高剂量染毒,①.急性毒性试验②.动物皮肤.粘膜试验③.吸入刺激或浓度试验.慢性毒性试验:至少一个月以上,甚至几代内对动物反复多次低剂量染毒①.慢性毒性试验②.致癌试验 3.从结果分析上对比:急性毒性试验:LD50.慢性毒性试验:以亚慢性毒性试验研究所提供的毒效应和靶器官为基础,重点观察在亚慢性毒试验中已经显现的阳性指标 ●化学致癌作用:化学致癌作用是一个多因素、多基因参与的多阶段过程.引发阶段:化学致
转基因棉花环境安全性研究进展 随着转基因技术的大力推广与发展．转基因产品在给人类带来巨大经济利益的同时．食品与环境安全的问题备受社会关注。其中转基因棉花大面积种植尤为重要．利益与安全应该同步发展与推广才能得到人们认可。2008年，全球共有10个国家（前5位包括：美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大）增加种植了混合型转基因棉花，其中美国种植转基因棉花达78%：印度多数种植转Bt基因棉花，种植面积占印度种植棉花总面积的82%m。种植的转基因棉花既是主要的纤维经济作物．同时也是仅次于大豆的重要油料和蛋白质作物．全球种植转基因棉花的面积为2100万hm2．位居种植转基因农作物物种的第3位，而国内种植转基因棉花的面积达到530万hm2。北美地区和澳大利亚是种植转基因抗除草剂棉花面积最大的地区与国家，在2007年孟山都第二代抗草甘膦棉花在美国与澳大利亚种植面积达80×104 hm2。抗除草剂有效解决棉花杂草的危害，并扩大除草剂施用范围，降低了除草费用．达到低投入和高产出的目的。因此，在广泛种植转基因棉花过程及生产应用中存在风险随之产生，主要包括：抗除草剂棉花有成为杂草的可能：基因漂移威胁棉花近缘物种：转基因棉花的应用会加速害虫抗性进化：转基因棉花对
非靶标有益生物的影响：转基因棉花对土壤生态环境的影响。笔者旨在对转基因棉花的研究情况进行综述、讨论及展望。 1 种植转基因棉花的优势 1.1 种植转Bt基因棉花对环境的影响 首先．经过长时间种植转Bt基因棉花对环境影响较明显：棉田中的益虫增多，周围其他农田受益，整个农田生态系统呈良性发展态势。Bt基因具有天然杀虫特性，能够杀死害虫中的蛋白质。在国内主要防治棉铃虫．对其他害虫也有间接防治效果，在转基因棉花田中瓢虫、蜘蛛和草蛉等益虫的数量都出现上升．它们会捕食蚜虫等害虫，从而间接起到防治虫害的效果。同时不仅是转基因棉花田受益，这些益虫还会进入邻近的大豆、花生、玉米等非转基因作物田．使整个地域的农田生态系统向有益方向发展。转Bt基因抗虫棉对鳞翅目靶标害虫具有良好的控制作用，减少了化学杀虫剂的使用，降低了对环境的污染，保证了人畜的安全，提高了农民的收益。Mat in等研究发现，印度转基因棉花单产相对增加34.3%．而中国只增加6.11%．美国更少．仅为2.36%。朱行等通过对印度种植转基因棉花研究发现，种植转基因棉花单产增加31%．杀虫剂使用量减少39%．利润增长88%，同时还保护环境，增进健康。Huang对农户种植Bt抗虫棉与非转基因棉的成本收益进行比较指出．农药施用量大幅度减