园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1079；http：//www. ahs. ac. cn 1285
番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析
赵先炎，庞明利，赵强，任怡然，郝玉金，由春香*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，国家苹果工程技术研究中心，山东泰安 271018）
摘 要：通过BLAST分析，获得了番茄漆酶（Laccase，LAC）基因相关的15个EST片段，并对这些EST进行了同源比较和序列拼接，得到1个含有小分子RNA miR397识别位点的LAC片段，命名为
LeLAC miR397。根据蛋白质结构域推测，LeLAC miR397蛋白存在1个Cu–氧化酶结构域。LeLAC miR397时空表
达分析表明，其在番茄根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达，而在叶中不表达。根据该片段的核苷
酸序列信息进行5′-和3′-RACE扩增，得到了番茄LAC基因的全长cDNA（LeLAC miR397，登录号EU503151），其在番茄基因组中对应的基因为Solyc07g049460.2.1。通过在番茄中过表达miR397a基因，发现转基因番
茄中LeLAC miR397表达量降低，同时其PPO、POD、SOD含量也有所下降。用丁香酸和芥子酸处理转基因
植株幼苗，其根系比非转基因植株更长，抗性增强，表明LeLAC miR397与番茄植株的抗性反应有关。
关键词：番茄；漆酶；LAC；克隆；抗性
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）07-1285-14 Cloning and Expression Analysis of Tomato LeLAC miR397 Gene
ZHAO Xian-yan，PANG Ming-li，ZHAO Qiang，REN Yi-ran，HAO Yu-jin，and YOU Chun-xiang *（State Key Laboratory of Crop Biology，National Research Center for Apple Engineering and Technology，College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：Laccases are glycoproteins with polyphenol oxidase acitivity depending on copper. They ubiquitously exist in plants，fungi，insects，bacteria and other organisms，playing crucial roles in lignin synthesis，ion absorption and stress responses. It has been documented that several LAC genes were regulated by microRNAs at post–transcriptional level. In this study，homology BLAST was conducted in GenBank for LAC ESTs. Resultly，15 tomato ESTs highly similar with LAC genes were obtained，and spliced into a LAC fragment named as LeLAC miR397 containing a recognition site of miR397. In addition，a Cu-oxidase domain was predicted to be in the deduced LeLAC miR397 protein. To check the temporal and spatial expression of LeLAC miR397，semi-quantitative RT-PCR was performed. It was found that LeLAC miR397 specifically expressed in roots，flowers，ripe fruit and callus，but not in leaves. Then，its full length cDNA was cloned with RT-PCR and 5′- and 3′-RACEs，and registered as EU503151 in GenBank，corresponding to Solyc07g049460.2.1 in tomato genome. The data showed that LeLAC miR397 expression was down-regulated in the transgenic tomato overexpressing miR397a，and the contents of PPO，POD and SOD were reduced too. When being treated with Syringic acid and Sinapic acid，transgenic tomato
收稿日期：2015–03–16；修回日期：2015–06–23
基金项目：国家自然科学基金项目（31171946）；教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1155）
* 通信作者Author for correspondence（E-mail：youchunxiang@https://www.doczj.com/doc/b23224368.html,）
Zhao Xian-yan，Pang Ming-li，Zhao Qiang，Ren Yi-ran，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene. 1286Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298. seedlings overexpressing LeLAC miR397 had longer root system and showed stronger resistance than WT. These results suggested that LeLAC miR397 was related to resistance to Syringic acid and Sinapic acid in tomato.
Key words：tomato；laccase；LAC；cloning；LeLAC miR397gene；resistance
漆酶（laccase，LAC）最先发现于漆树的树液中，可将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌，是酚氧化酶的一种，亦被称为对苯二酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族（万云洋和杜予民，2007；王祎宁等，2009）。漆酶能催化多种芳香族化合物特别是酚类的氧化，能催化酚酸类物质转化成毒性较小的寡聚物（王国栋和陈晓亚，2003；曹立芳和冯有胜，2008；王祎宁等，2009）。目前已经在植物、真菌、昆虫和细菌中发现了漆酶（Martins et al.，2002；王国栋和陈晓亚，2003；赵敏等，2008；左斌等，2009）。漆酶基因LAC在木质化的组织中表达量较高，参与木质素的生物合成（O’Malley et al.，1993；Dean et al.，1998；Gavnholt et al.，2002），并且能使木质素单体聚合成木质素（Gavnholt & Larsen，2002；Mayer & Staples，2002）。在已知的17个拟南芥漆酶基因中（McCaig et al.，2005；Turlapati et al.，2011），有４个漆酶基因（LAC4、LAC11、LAC15和LAC17）与木质素的合成有关（Liang et al.，2006；Wang et al.，2008；Berthet et al.，2011；Zhao et al.，2013）。另外，植物漆酶除了参与木质素的生物合成外，还与水分胁迫有关（路运才，2004）。
LAC基因家族受到多种microRNA介导的转录后调控。已知的microRNA中，miR408、miR398、miR397和miR857的靶基因是拟南芥LAC基因家族的成员，其中miR397在拟南芥中存在3个靶基因，分别是AtLAC2、AtLAC4和AtLAC17（Abdel-Ghany & Pilon，2008；Yamasaki et al.，2009）。杨树中Ptr-miR397a基因过表达会引起杨树体内17个漆酶基因的表达量下调，从而影响杨树中木质素的含量（Lu et al.，2013）。拟南芥AtmiRNA397b基因过量表达会使AtLAC4基因的表达量降低，减少木质素的含量（Wang et al.，2014）。
番茄和茄子等多种具有叶表皮毛的植物富含多酚类物质（Kowalski et al.，1992；Yu et al.，1992；Thipyapong et al.，1997）。LAC负责聚合生成这些多酚化合物，保护植物免受病菌和昆虫攻击（Lavid et al.，2001）。在拟南芥中过量表达棉花的一个LAC基因后，转基因拟南芥对酚类物质的抗性增强，并且漆酶活性的高低与它对酚酸类物质的抗性大小呈正相关，表明漆酶基因的表达提高了植物的抗性（Wang et al.，2003）。另外，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中提高白腐菌（Trametes versicolor）漆酶的表达能使转基因菌株对芥子酸的抗性增强（Larsson et al.，2001）。
研究表明，LAC基因的表达是植株产生抗性的直接原因之一。体外酶活分析表明，酵母表达的GaLAC1底物广泛，对阿魏酸、芥子酸、丁香酸、香草酸等酚酸类物质都有一定的催化活性，而植物体内的酚酸类物质能破坏或阻止植物对营养物质的消化，将棉花GaLAC1在拟南芥中过量表达后主要在根部积累，提高了拟南芥对芥子酸、丁香酸的抗性，GaLAC1在植物体外可以催化酚酸类物质氧化形成毒性较小且较难进入植物体内的寡聚物（王国栋，2004）。这表明棉花GaLAC1基因增强了植株对酚酸物质的抗逆性（王国栋，2004）。
本研究从番茄中克隆了1条miR397的靶基因LeLAC miR397（GenBank注册号为EU503151），并通过遗传转化获得了miR397a和LeLAC miR397转基因番茄。已有研究表明，LAC基因可以增强植物对酚酸类物质的抗性。为了进一步研究LeLAC miR397在番茄中对酚酸类物质是否具有抗性，对转基因番茄进行丁香酸和芥子酸处理试验，为进一步鉴定该基因的功能和作用机理，并将其应用于番茄抗逆基因工程奠定理论基础。
赵先炎，庞明利，赵强，任怡然，郝玉金，由春香.
番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298. 1287 1 材料与方法
1.1试验材料
2007年，将‘中蔬4号’番茄种植于山东农业大学园艺科学与工程学院玻璃温室内。采集根、茎、叶、花和果实，经液氮冷冻后贮于–80 ℃保存备用。番茄子叶分化后形成的愈伤组织，经液氮冷冻后贮于–80 ℃保存备用。
克隆载体为pMD18-T，表达载体为pBI121。大肠杆菌（E. coli）DH5α，农杆菌LBA4404均为本实验室保存。引物由上海生工（Sangon）合成（表1）；测序由北京博尚生物技术有限公司完成。
表1 PCR引物
Table 1 PCR primers
引物用途Usage 引物名称
Primer name
引物序列
Sequence
5′-RACE锚定引物5′-RACE adaptor primer AAP
AUAP 5′-GGCCACGCGTCGACT AGT ACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
3′-RACE锚定引物3′-RACE adaptor primer B26
B25 5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′
3′锚定引物3 sites adaptor primer 3 sites adaptor primer 5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′
参照基因 Reference gene Actin-F
Actin-R 5′-CTTCAGTCCACAATCGGTGG -3′5′-CATTCCGAGTTGAGCTGCTG -3′
扩增LAC中间片段Amplification middle fragment of LAC Lac-f：
Lac-r：5′-CAATGTTGTGGATGTGGAGAATGC-3′5′-GTTAGCCGCCATGTAGTACGAC-3′
扩增LAC 3′端序列Amplification 3 sites fragment of LAC LAC3′-F1：
LAC3′-F2：5′-CTTGACGGCCGATCAGCTAC-3′5′-GACAACACCACAACTAGAGG-3′
扩增LAC 5′端序列Amplification 5 sites fragment of LAC LAC5′-F1
LAC5′-F2 5′-GGAGCAAGGGTAAAGATCGCC-3′5′-CGCTGCATTCTCCACATCCAC-3′
扩增LAC cDNA全长序列Amplification cDNA of LAC LAC5′-F：
LAC3′-R：5′-GTTCTATAGTCTTTACACATTG-3′5′-ATGACTCACTTGTACAATTG-3′
扩增miR397a前体序列 Amplification Pre-miR397a miR397a-F
miR397a-R 5′-GCGTACATTACAAACACTTGGAC-3′5′-CCAGATTGATTACGTAAAGAACC-3′
表达载体上通用引物Universal primers of expression vector35S-F：5′-CGCACAATCCCACTATCCTT-3′
pBI121载体中抗卡那霉素的基因
PBI121 kanamycin resistant gene in the vector NPTII-F
NPTII-R
5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′
5′-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3′
1.2 LAC cDNA克隆
1.2.1 CTAB法提取RNA
RNA的提取方法参考蒋建雄和张天真（2003）的方法稍有改动：LiCl浓度由8 mol · L-1提高到10 mol · L-1，加入LiCl后冰浴6 ~ 8 h改为–20 ℃沉淀3 h，用预冷（–20 ℃）的异丙醇沉淀RNA 之前加入1/10体积2 mol · L-1 KAc（pH 5.5）以除去多糖。RNA提取缓冲液：CTAB：2%；Tris-HCl （pH 8.0）100 mmol · L-1；NaCl 1.4 mol · L-1；EDTA（pH 8.0）20 mmol · L-1；β–巯基乙醇0.2%；DEPC水定容。
1.2.2 第一链含有锚定引物的cDNA的合成
在微量离心管中配制反应液：Template RNA 2 μg；10× RNA PCR buffer 4 μL；dNTP Mixture（each 10 mmol · L-1）2 μL；Rnase Inhibitor（40 U · μL-1）1 μL；Oligo（dT）-3sites Adaptor Primer（2.5 μmol · L-1）2 μL；AMV Transcriptase XL（5 U · μL-1）1 μL；RNase-free H2O补足到20 μL。按以下条件进行反
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Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene. 1288Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.转录反应：30℃ 10 min；50℃ 30 min；95℃ 5 min；5℃ 5 min。当使用二级结构较为复杂的模板RNA时，在进行cDNA成反应之前将RNA溶液于65℃加热5 min后迅速置于冰中，利用这种办法可以减弱二级结构的影响，提高逆转录反应效率。转录产物的质量通过ACTIN序列设计的引物（Actin-F和Actin-R）来扩增检测。94℃预变性8 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，52℃煺火45 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环。最后72℃延伸10 min。
1.2.3 LAC cDNA扩增与全长序列的获得
根据番茄LAC基因EST片段设计特异引物Lac-f和Lac-r。94 ℃预变性5 min，然后进行以下循环，94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
5′端cDNA序列的扩增：首先根据试剂盒说明纯化反转录产物与末端加尾，根据已知的中间片段序列，设计嵌套式PCR引物，LAC外侧引物为LAC5′-F1，内侧引物为LAC5′-F2。第一轮PCR：加尾纯化产物15 μL；10× LA PCR buffer 5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1 LAC5-F1/3 2.0 μL；10 μmol · L-1 AAP 2.0 μL；25 mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq E（5 U · μL-1）0.5 μL；ddH2O 加到50 μL。94℃预变性5 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，60℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。第二轮PCR：第一轮扩增产物 2 μL；10× LA PCR buffer 5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1 LAC5-F2/4 2.0 μL；10 μmol · L-1 AUAP 2.0 μL；25 mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq酶（5U · μL-1）0.5 μL；ddH2O加到50 μL。94 ℃预变性5 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。第三轮PCR以2 μL第二轮扩增产物为模板，其它条件和反应程序同第二轮。
3′端cDNA序列的扩增：根据获得的中间片段的序列设计嵌套PCR引物，LAC扩增所用外测引物为LAC3′-F1，内侧引物为LAC3′-F2序列。3′端接头引物为3 sites adaptor primer。PCR扩增条件为：AMV反转录产物 2 μL；10× LA PCR buffer 5 μL；2.5 mmol · L-1 dNTP 6 μL；10 μmol · L-1正向引物2.0 μL；10 μmol · L-1 3 site adaptor 2.0 μL；25 mmol · L-1 MgCl2 5 μL；LA Taq酶（5U · μL-1）0.5 μL；ddH2O加到50 μL。94℃预变性5 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物的回收根据TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒操作。
利用正向引物LAC5′-F和反向引物LAC3′-R扩增获得LAC cDNA全长序列。LAC PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后进行以下循环，94℃变性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
以幼嫩叶片为植物材料，为检测转基因植株，利用SDS法提取DNA（孙鑫等，2004）。
1.3 序列测定及分析
用试剂盒将PCR产物回收，连接pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α，选取一个阳性重组子，利用pMD18-T载体多克隆位点两侧的M13-48和M13-47引物对目的基因序列进行自动测序，序列测定由北京博尚生物技术有限公司完成。测序结果用以下软件进行分析：
序列的ORF查找，翻译，酶切位点分析由http：//us. expasy. org/ tools/ protparam. html完成。序列同源性比较由GenBank的BLAST程序进行（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/）。氨基酸一级结构（等电点、分子量）的预测由Computer pI/MW完成（http：//www. expasy. ch/ tools/ pi_tool. html）。蛋白质特性分析和氨基酸的多序列比较、同源树分析由DNAMAN 5.2程序完成。蛋白质结构域预测由TMHMM2.0 program（http：//myhits. isb-sib. ch/ cgi-bin/ motif_scan）实现。
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番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298. 1289
图2 LAC 时空表达分析 Fig. 2 Temporal and spatial expression of LeLAC miR397
图1 存在识别位点的番茄EST 序列与拟南芥AtLAC2和miR397a 序列比较 Fig. 1 Sequences comparison between miR397a recognition site ，tomato EST sequence containing miR397 recognition site and AtLAC2
1.4 表达载体构建
将带有LeLAC miR397基因序列的pMD18-T 载体质粒用Bam H Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，
得到LeLAC miR397基因片段。将此片段与经Bam H Ⅰ和Sal Ⅰ酶切的pBI121连接，得到pBI121-LeLAC miR397表达载体。
利用CaMV 35S 启动子和miR397a 基因的前体序列构建番茄部分miR397a 基因序列的超表达载体。构建过程为：将带有拟南芥miR397a 基因前体序列的pMD18-T 质粒用Bam H Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，得到miR397a 基因片段，将此片段与经 Bam H Ⅰ和Sal Ⅰ酶切的pBI121连接，得到pBI121-miR397a 表达载体。
1.5 农杆菌介导的番茄转化与逆境胁迫下转基因植株的生理生化测定
根据文献（陈珍和朱诚，2008），用农杆菌介导法转化番茄。
SOD 活性的测定采用NBT 还原法（Ginnopolitis & Ries ，1977），POD 活性测定参照Maehly 和Chance （1954）的方法，PPO 活性测定参照Wissemann 和Lee （1980）的方法。
2 结果与分析
2.1 番茄中miR397靶基因LeLAC miR397片段的分子克隆
在GenBank 进行BLAST 分析，共获得15
个番茄LAC 基因相关的EST 片段。对这些EST
进行同源比较和序列拼接，最后得到5个较长
的无重叠的EST 片段。对这5个较长的EST
片段序列进行microRNA 识别位点预测分析，
在其中一个长度为350 bp 的EST 片段上（图1）
发现长度为21 bp 的miR397a 的识别序列，其
成熟序列与该识别序列的匹配性很好，只有两
个碱基不匹配；与之相似，在拟南芥中，
miR397a 靶基因LAC 的识别序列中有3个碱基与miR397a 成熟序列不匹配（Abdel-Ghany & Pilon ，2008）；表明该基因可能是miR397a 的靶基因，并将此基因命名为LeLAC miR397。
2.2 LeLAC miR397基因的表达分析
在进行LeLAC miR397基因的5′-和3′-RACE
扩增时发现，番茄叶片cDNA 中扩增不到LAC
基因，而从愈伤组织cDNA 中则可以。为了进
一步检测番茄LeLAC miR397基因的时空表达特
性，从番茄不同组织和器官中提取总RNA ，反
转录cDNA 为摸板，用半定量PCR 的方法检测
了LeLAC miR397在不同组织和器官中的表达模
式（图2）。
用LeLAC miR397基因特异引物LAC5′-F 和LAC3′-R 检测 LeLAC miR397基因在不同组织和器官中的表达强度。结果显示，LeLAC miR397基因在根中的表达水平最高，其次是愈伤组织，在花和成熟果实
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Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene. 1290Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.中也有低水平表达，而在叶片中几乎没有检测到表达产物，表明LeLAC miR397基因在番茄的根中可能发挥重要作用。
2.3 RT-PCR和RACE扩增获得LeLAC miR397的全长cDNA
根据电子克隆的EST片段，设计了分子克隆该基因的特异引物，通过RT-PCR获得了该基因片段。5′-RACE扩增后，得到1条长度约为600 bp的特异性片段（图3，A），测序后发现其长度为612 bp，并能够和EST片段正确拼接，拼接后的片段包括1个含有起始密码子ATG的长ORF（开放阅读框），且翻译后得到的多肽为LAC类蛋白，表明得到的5′-RACE扩增产物为目的基因片段，且已经包含部分5′-UTR。
3′-RACE扩增后，得到1条长度约为1 000 bp的特异性片段（图3，B），测序后发现其长度为1 047 bp，含有Poly-A序列，并能够和5′-RACE拼接产物正确拼接，拼接后的片段包括1个含有终止密码子TAG的长ORF，翻译后得到的多肽为LAC类蛋白，表明得到的3′-RACE扩增产物为目的基因片段，且已经包含3′-UTR。
通过DNA数据库搜索、EST拼接和RACE扩增，得到了含有miR397a识别位点的LAC基因片段。使用DNAMAN软件，把RACE扩增产物和EST中间序列进行拼接，获得了番茄LAC基因全长cDNA序列，序列分析表明，该LAC基因全长为1 952 bp，起始密码子ATG和终止密码子TAG 分别始于第47和1 763个核苷酸处，全长cDNA包括46 bp的5′-UTR（非翻译区）、1 719 bp的ORF 和187 bp的3′-UTR，ORF编码1条572 aa的多肽，推测分子量为63 306 Da。
为了克隆该基因，根据其碱基序列设计了LAC基因全长特异引物LAC5′-F和LAC3′-R，并从番茄愈伤组织的cDNA中扩增到了全长LAC基因（图3，C），则该基因为LeLAC miR397，并在GenBank 登录注册，注册号为EU503151。另外将LeLAC miR397在番茄网上（http：//solgenomics. net/）blast，找到其对应的基因为Solyc07g049460.2.1。
图3 番茄LeLAC miR397基因的克隆
Fig. 3 The clone of tomato LeLAC miR397gene
2.4 LeLAC miR397蛋白序列分析及结构域预测
利用GenBank的BLAST程序对LeLAC miR397基因序列的同源性进行了在线分析，并利用分析软件DNAMAN 5.2进行氨基酸多序列比对（图4），用MEGA6进行同源树分析（图5）。结果显示，在不同植物中，与LeLAC miR397基因编码蛋白氨基酸同源性较高的基因都属于LAC基因家族成员，其中拟南芥AtLAC7和豌豆PsLAC与LeLAC miR397的氨基酸同源性最高，分别为64%和60%，其次是拟南芥AtLAC9（NM_120182）和AtLAC8，同源性均为55%。这说明克隆的含有miR397a识别位点的LeLAC miR397基因属于番茄LAC基因家族成员。
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番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析.
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图4 LeLAC miR397与其它植物LAC氨基酸序列比对
Fig. 4 Alignment of inferred aa sequences of LeLAC miR397 and LACs in other plants
从进化树中可以看到，拟南芥AtLAC基因家族的各个成员之间同源性并不是最高的，它们在进化树中相当分散，分别与不同物种的LAC具有就较高的同源性。拟南芥AtLAC基因家族的17个成
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Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene. 1292Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.员功能上不存在冗余，它们分别起不同的作用，说明不同植物中同源性较高的LAC基因可能发挥着相似的功能。
对LeLAC miR397基因推测蛋白的结构域进行了在线分析（http：//myhits.isb-sib.Ch/cgi-bin/motif_scan），结果显示，在番茄LeLAC miR397基因编码的蛋白中有1个LAC蛋白普遍存在的Cu–氧化酶结构域（109 ~ 221氨基酸）。这预示了LeLAC蛋白的功能与已报道的其他植物中的漆酶蛋白功能类似。
图5 LeLAC miR397进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic tree of LeLAC miR397
2.5 pBI121-miR397a转基因番茄的获得以及miR397对番茄中LAC基因表达的调控
由于各物种间小分子RNA的序列高度保守，miR397家族包括两个基因：miR397a和miR397b。为了鉴定miR397a对番茄中LAC基因的转录后调控，将拟南芥中的miR397a序列克隆并插入到植物过表达载体中转化农杆菌，然后转化番茄（图6）。
为进一步鉴定抗卡那霉素番茄植株确实为转基因植株，根据pBI121载体中抗卡那霉素的基因设计了1对能扩增600 bp产物的专一引物NPTII-F和NPTII-R，对转基因番茄进行PCR检测，确定确实得到转基因植株（图7）。将其生根后移至田间大棚种植，与对照植株相比，没有表现出生长异常，在田间能够正常结果（图6）。
选取果实和根，探究LeLAC miR397基因表达的转录后调控。结果表明，在非转基因番茄的果实和根中都检测到了LeLAC miR397基因的表达（图8），与时空表达分析结果（图2）一致；同时，在转基因番茄的果实和根中检测不到LeLAC miR397基因的转录，表明LeLAC miR397基因在miR397a过量表达的转基因番茄中可能被特异性切割降解了，miR397a基因在番茄中的过量表达可能造成了LeLAC miR397基因的转录后沉默。
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番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析.
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图7 转基因番茄PCR检测
Fig. 7 PCR detection of transgenic tomato
图8 LeLAC miR397基因的表达量Fig. 8 Transcripts of LeLAC miR397
图6 转miR397a基因番茄的获得
A：Kan生根培养基上筛选的幼苗；B：移栽的转基因幼苗；C：转基因（左）和非转基因（右）植株；
D：转基因（左）和非转基因（右）果实。
Fig. 6 Detection of transgenic tomato of miR397a
A：Tomato seedling on rooting medium with Kanamycin；B：A transgenic seedling in soil；C：The growth situation of transgenic（left）and non-transgenetic（right）tomatos；D：Transgenic（left）and non-transgenetic（right）
fruits.
如图9所示，对转基因和非转基因番茄中的多酚氧化酶（PPO）活性进行了检测，转基因番茄低于非转基因对照，进一步证明了LeLAC miR397基因在miR397a过量表达的转基因番茄中被沉默。转基因植株中SOD和POD酶活性均比非转基因植株中相应的酶活性降低。相同质量蛋白质的粗酶液中，转基因植株的SOD和POD酶活性分别占非转基因植株的70%和59%。SOD、PPO和POD均
图9 野生型和转基因番茄中氧化酶活的分析
Fig. 9 Analysis of oxidases activity in wild type and transgenic tomato
Zhao Xian-yan ，Pang Ming-li ，Zhao Qiang ，Ren Yi-ran ，Hao Yu-jin ，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene.
1294 Acta Horticulturae Sinica ，2015，42 (7)：1285–1298. 图10 转基因和野生型番茄LeLAC miR397的半定量RT-PCR 分析 Fig. 10 Analysis of LeLAC miR397 expression in transgenic tomato and wild tomato with semi-quantitative RT-PCR
与植物抗逆性相关，在转基因番茄中它们的活性都有所降低，但在正常生长条件下，转基因与非转基因番茄之间没有出现明显的表型差异（图6）。
2.6 LeLAC miR397转基因番茄的植株获得及抗性研究
将拟南芥LeLAC miR397基因序列PCR 产物与克隆载体pMD18-T 连接，
选择正向连入克隆载体的目的片段，通过Sal Ⅰ和Bam H Ⅰ双酶切后经T 4 DNA 连接酶连入用同样两种酶切的表达载体pBI121，得到含LeLAC miR397嵌合基因的pBI121-LeLAC miR397植物表达载体。在pBI121-LeLAC miR397中，原本
在pBI121上的GUS 基因被LeLAC miR397基因取代，
这样miR397a 基因的表达直接受CaMV 35S 启动子和NOS 转录终止序列（NOS-T ）的调控。
为了进一步验证LeLAC miR397参与番茄植
株的抗性反应，将构建的植物表达载体转化农
杆菌，侵染番茄叶片，对野生型和获得的转基
因番茄分别提RNA ，反转录，半定量RT-PCR
检测发现，L1、L3、L4株系表达量较低，L2、
L6株系表达量较高，L5株系未检测到
LeLAC miR397的表达（图10）
。 获得转LeLAC miR397基因的番茄株系后，分
别用1/2MS 、1/2MS + 0.5 mmol · L -1丁香酸、1/2MS + 2 mmol · L -1芥子酸处理，结果显示，无论1/2 MS 还是其添加0.5 mmol · L -1丁香酸、2 mmol · L -1芥子酸处理，转基因番茄根系比野生型更长，长势更好（图11），说明转LeLAC miR397基因的番茄株系增强了对丁香酸和芥子酸的伤害抗性，这表明LeLAC miR397基因参与番茄植株的抗性响应。
图11 野生型（WT ）和转基因番茄（L4，L6）株系在1/2MS 及其添加丁香酸和芥子酸培养基上的生长状态
Fig. 11 The growth phenotypes of transgenic tomato （L4 and L6）and wild tomato in medium 1/2MS ，
1/2MS + 0.5 mmol · L -1 syringic acid and 1/2MS + 2 mmol · L -1 sinapic acid
赵先炎，庞明利，赵强，任怡然，郝玉金，由春香.
番茄漆酶基因LeLAC miR397的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (7)：1285–1298. 1295 3 讨论
3.1 番茄LeLAC miR397的基因特征
本文根据具有miR397a识别位点的番茄LAC基因相关的EST片段，进行5′-和3′-RACE扩增，从‘中蔬四号’番茄的愈伤组织中克隆到了番茄LeLAC miR397基因的全长cDNA，该基因编码漆酶类（Laccases）蛋白，并具有miR397的识别序列。为了判明该基因是否属于番茄LAC基因家族，首先根据推测氨基酸序列构建番茄LeLAC miR397系统发育进化树。在进化树上，与LeLAC miR397相近的都是不同植物的LAC蛋白，其中，关系最近的是拟南芥AtLAC7和豌豆PsLAC，对番茄LeLAC miR397、拟南芥AtLAC7和豌豆PsLAC进行氨基酸同源性比较分析，它们的同源性都在60％以上。
拟南芥LAC蛋白结构中含有4个Cu离子，铜离子在LAC把底物氧化成水和低聚物的过程中起关键作用（LaFayette et al.，1999）。在液体培养条件下，铜离子能够诱导除vv‐lac2、vv‐lac3和vv‐lac7之外的其余8个草菇漆酶基因的表达，且适宜浓度的铜离子有助于草菇漆酶活性的增加（吴林等，2014）。对LeLAC miR397的氨基酸序列进行蛋白质结构域预测发现，其蛋白质结构中存在1个Cu–氧化酶结构域，在其它植物上的研究表明，LAC/漆酶是一种含铜的糖蛋白（多酚氧化酶），都具有Cu–氧化酶结构域（109 ~ 221氨基酸）。这表明番茄LeLAC miR397基因和拟南芥LAC基因编码的蛋白质具有相似的结构域，在植物中可能发挥着相似的作用。
拟南芥上的研究表明，有些LAC基因的表达模式是组成型，有些则只在特异组织或特定发育时期表达（McCaig et al.，2005）。用半定量RT-PCR的方法检测LeLAC miR397在不同组织和器官中的表达发现，发现该基因在番茄的根中表达最高，其次是愈伤组织、花和成熟果实，在叶和茎中不表达。说明番茄LeLAC miR397可能只影响特定组织或器官的生长发育。
3.2 miR397a对番茄LeLAC miR397基因的转录后调控
拟南芥、水稻和杨树的LAC基因都受到microRNA介导的转录后调控（Jones-Rhoades & Bartel，2004；Sunkar & Zhu，2004；Lu et al.，2005；Sunkar et al.，2005）。miRNAs（miR408、miR397和miR957）及其靶基因mRNA的水平负相关（Abdel-Ghany & Pilon，2008），如果miRNA的表达量增高，靶基因mRNA的水平就会相应的降低。过量表达miR397a的转基因番茄中，LeLAC miR397的表达量几乎检测不到，而且转基因miR397a番茄中PPO，SOD和POD的含量也有所降低，这表明miR397可能抑制了番茄体内LeLAC miR397的转录表达，从而造成LeLAC miR397的沉默。基于LeLAC miR397的氧化物酶的作用，LeLAC miR397的沉默引起了一些氧化酶的合成减少。LeLAC miR397基因表达降低或沉默，说明LeLAC miR397基因可能是miR397a的靶基因。本研究中， miR397a在番茄中过量表达能同时影响SOD、POD和PPO酶活性，至于在番茄中是否也存在着多个被miR397a识别的LAC基因还有待进一步研究证实。
3.3番茄LeLAC miR397基因的功能分析
以前的研究表明，LAC基因在植物中的功能是多种多样的，LAC基因在高等植物中含量较高，在木质素合成（Sterjiades et al.，1992；Dean et al.，1998；Ranocha et al.，1999）、伤口愈合（Dean et al.，1998）、逆境响应（Liang et al.，2006）、细胞壁结构和完整性的维持（Ranocha et al.，1999）等方面都起到重要作用。
漆酶活性与酚酸类物质的抗性呈正相关，LAC基因的表达是植株产生抗性的直接原因之一。王
Zhao Xian-yan，Pang Ming-li，Zhao Qiang，Ren Yi-ran，Hao Yu-jin，You Chun-xiang.
Cloning and expression analysis of tomato LeLAC miR397 gene. 1296Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1285–1298.国栋（2004）将棉花GaLAC1基因在拟南芥中过量表达，发现转基因拟南芥对芥子酸、丁香酸、香草酸及芥子酸/丁香酸，芥子酸/香草酸等抗性增强。过表达miR397a造成LeLAC miR397基因沉默，能用来研究LeLAC miR397基因在番茄中的功能。本文通过在番茄中过量表达LeLAC miR397，研究了番茄中该基因的功能。LeLAC miR397基因过表达后，在丁香酸和芥子酸胁迫下转基因植株幼苗根系变长，说明LeLAC miR397基因可能提高了番茄的抗性。LeLAC miR397基因在番茄不同组织和器官中表达程度不同，说明其在不同组织和器官中发挥的作用存在差异，特别是在根中有着重要作用。
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“中国园艺学会2015年学术年会”即日起征集：①研究论文摘要，②有关园艺学进展的综述。经审查合格的摘要将收入《园艺学报》2015年增刊，综述将收入2015年第9期，均于会前出版。
征文内容：有关果树、蔬菜、西瓜甜瓜、观赏园艺植物及其它园艺植物的种质资源、遗传育种、生物技术、栽培技术与生理、采后技术与生理等方面未曾发表过的研究论文摘要和文献综述。
投稿要求：摘要稿件需将电子文件发送至本刊电子邮箱（ivfyyxb@https://www.doczj.com/doc/b23224368.html,），综述稿件需登录本刊网站（http：// www. ahs. ac. cn）在线投稿，同时均需将纸质稿件一式两份寄送到：北京中关村南大街12号《园艺学报》编辑部（邮编100081），并请交纳审理费320元（邮局汇款地址：北京中关村南大街12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所，邮编100081，收款人《园艺学报》编辑部）。对于录用的稿件，将及时通知参会作者，未录用的稿件恕不退回。联系电话：010-********。
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