第35卷第9期2015年5月生态学报ACTA ECOLOGICA SINICA Vol.35,No.9May,2015基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目(2013CB733502);国家自然科学基金资助项目(41371268,31300447)
收稿日期:2013?06?18; 网络出版日期:2014?05?22
*通讯作者Corresponding author.E?mail:lixz@https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,
DOI :10.5846/stxb201306181726
刘驰,李家宝,芮俊鹏,安家兴,李香真.16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用.生态学报,2015,35(9):2769?2788.
Liu C,Li J B,Rui J P,An J X,Li X Z.The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology:current situation and problems.Acta Ecologica Sinica,2015,35(9):2769?2788.16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
刘 驰1,2,3,李家宝1,2,芮俊鹏1,2,安家兴1,2,李香真1,2,*
1中国科学院环境与应用微生物重点实验室,成都 610041
2环境微生物四川省重点实验室,中国科学院成都生物研究所,成都 610041
3中国科学院大学,北京 100049摘要:16S rRNA (Small subunit ribosomal RNA)基因是对原核微生物进行系统进化分类研究时最常用的分子标志物(Biomarker),广泛应用于微生物生态学研究中三近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于16S rRNA 基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展,然而使用16S rRNA 基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基因转移二多拷贝的异质性二基因扩增效率的差异二数据分析方法的选择等,这些问题影响了微生物群落组成和多样性分析时的准确性三对当前使用16S rRNA 基因分析微生物群落组成和多样性的进展情况做一总结,重点讨论当前存在的主要问题以及各种分析方法的发展,尤其是与高通量测序技术有关的实验和数据处理问题三
关键词:16S rRNA 基因;微生物群落;多样性;高通量测序;生物信息数据处理
The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology :current situation and problems
LIU Chi 1,2,3,LI Jiabao 1,2,RUI Junpeng 1,2,AN Jiaxing 1,2,LI Xiangzhen 1,2,*1Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology ,Chinese Academy of Sciences ,Chengdu 610041,China
2Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province ,Chengdu Institute of Biology ,Chinese Academy of Sciences ,Chengdu 610041,China 3University of Chinese Academy of Sciences ,Beijing 100049,China Abstract :The 16S rRNA (small subunit ribosomal RNA)gene is a universal marker for phylogenetic reconstructions to approximate the tree of life owing to its presence in all prokaryotes and its high conservation.Sequencing of 16S rRNA genes amplified directly from environmental samples is commonly used to study microbial community composition and diversity.Great advances in pyrosequencing technology and bioinformatics in recent years enable us to obtain sequence data from large?scale environmental samples efficiently and cost?effectively.However,some critical problems need to be addressed when the 16S rRNA gene is used for microbial diversity studies,such as horizontal gene transfer (HGT),intragenomic heterogeneity,PCR amplification efficiency,and sequencing data analysis.In this review,we summarize the state?of?the?art applications of 16S rRNA gene as a biomarker for microbial ecology studies,and introduce current pyrosequencing techniques and bioinformatics for large?scale data analysis.This review focuses on four aspects.(i)We introduce the structure and properties of the 16S rRNA gene,e.g.the primary and secondary structure,HGT and heterogeneities of 16S rRNA genes.Based on current available microbial genomes,multi?copy and intragenomic heterogeneities of 16S rRNA genes are recognized.These phenomena may seriously bias the estimations of microbial diversity in environmental samples.Some online tools and databases used for analysis of the 16S rRNA gene sequencing data are also introduced.These tools are used
0772 生 态 学 报 35卷 to predict horizontal gene transfer,secondary structure,and to align and classify16S rRNA gene sequences.(ii)We introduce some16S rRNA?based techniques commonly used in microbial ecology studies,such as fingerprinting profiling, hybridization,microarray,and high throughput pyrosequencing methods.We compare the advantages and limitations of various methods and recommend how to use them properly based on a specific target.Different methods have different resolutions and detection limitations.Low?resolution profiling methods potentially miss some important information and make it difficult to detail the phylogenetic composition of an environmental sample.Pyrosequencing technique is highly recommended in the future for microbial ecology study.Several sequencing platforms,e.g.Roche454,Ion Torrent and MiSeq,are compared.(iii)We evaluate the biases that may be introduced during sample preparation and PCR procedures, e.g.DNA extraction,primer selection,PCR optimization,PCR product purification,and data analysis.Amplicon sequencing method suffers from a high level of sequencing and amplification artifacts.It is important to select OTU (operational taxonomic units)classification and chimera removing algorithms.In this case,the Uchime and Uparse are recommended for microbial amplicon pyrosequencing reads.(iv)We introduce some bioinformatics tools for pyrosequencing data analysis,such as chimera check and diversity index calculation.The most popular pipelines for pyrosequencing data analysis include RDP,QIIME and Mothur.In order to link ecological questions with microbial composition data,the methods of ecological statistics must be employed to build the relationships of microbial datasets with environmental variables.Here,we introduce some multiple statistical methods,e.g.PCA and UniFrac analysis.Based on these analyses, microbial data based on16S rRNA sequencing are linked to the environmental variables,and fundamental ecological questions are addressed.Finally,we recommend researchers to consider these problems systematically when using16S rRNA?based techniques in microbial ecology study.
Key Words:16S rRNA gene;microbial community;microbial diversity;pyrosequencing;bioinformatics
微生物是地球上数量最多和多样性最高的生物,1g土壤中仅细菌就可能有109个三由于大多数微生物尚不能纯培养,传统的微生物研究方法,如显微镜微形态观察二选择性培养基计数二纯菌种分离和生理生化鉴定等,在微生物多样性研究中都存在很大的局限性三基于非培养基础上的分子生物学方法可以使人们快速二系统地分析环境样品中微生物组成二结构和多样性,极大地促进了微生物生态学的发展三Zuckerkandl等首次提出使用基因序列作为分子钟来分析生物间的亲缘关系[1]三Woese和Fox基于16S rRNA基因序列对原核生物的系统进化关系进行了分析,提出了著名的 三域学说”[2]三从此,16S rRNA基因成为了最常用的生物标志物,广泛应用于微生物的系统进化二分类及多样性研究中三基于16S rRNA信息的系统分类结果与基于全基因组信息的分类结果很相似[3]三随着测序技术的发展,人们可以更加快捷地获得环境样品中的16S rRNA基因序列,这些序列信息可以和数据库中的已知信息进行比对,以研究环境样品中微生物群落的特点三本文主要针对当前使用16S rRNA基因分析微生物群落结构和多样性的现状进行总结,重点讨论当前技术的发展状况和存在的主要问题三
1 16S rRNA基因的特点
微生物rRNA在漫长的进化过程中,由于其在碱基组成二核苷酸序列二高级结构及生物功能等方面表现出高度保守性而有微生物 化石”之称三保守性能够反映微生物之间的亲缘关系,为系统发育重建提供线索三然而rRNA的序列组成也不是完全保持恒定的,其具有一定的可变性,这种可变性能够反应出不同微生物的特征核酸序列,可以作为微生物多样性分析的分子基础三原核微生物的rRNA按沉降系数可以分为5S二16S 和23S rRNA,大小分别约为120bp二1540bp和2904bp左右(以Escherichia coli为例)三5S rRNA的基因序列较短,易于测定,但是由于其缺乏足够的遗传信息,不适用于系统分类研究;相反,23S rRNA含有的核苷酸序列较长,分析较困难三16S rRNA占细菌总RNA量的80%以上,基因序列长短适中,其结构中既有保守区域,
又有变异区域,是较好的生物标志物三人们根据16S rRNA 基因不同区域序列的可变性将其分为9个可变区和9个保守区[4](图1)三
图1 16S rRNA 基因保守区和可变区的分布
Fig.1 Conserved and variable regions in the 16S rRNA gene
虽然16S rRNA 基因被广泛应用于微生物多样性分析中,然而对于某些属的菌群分辨效果较差,如Vibrio 二Pseudomonas 等[5]三人们一般设定16S rRNA 基因序列相似性397%的原核生物为同一个种,但很多不同种的微生物其16S rRNA 基因序列相似性却高于97%三另外,许多细菌的16S rRNA 基因是多拷贝的,而且各拷贝的序列组成存在一些差异;16S rRNA 基因也存在着水平转移问题,这些都直接影响着对原核微生物群落结构和多样性的分析三
1.1 基因水平转移(HGT)
人们以前曾普遍认为16S rRNA 基因不存在水平转移现象,然而一些研究发现,在许多细菌中16S rRNA 基因都出现了水平转移[6?7]三在对Pseudomonas 属的研究中发现,有些种的V1区和V3区中的48.3%和41.6%的16S rRNA 基因序列可能是从另一个距离较远的种通过基因水平转移得到的,因此,应该避免使用这些可变区对Pseudomonas 进行种间分类[7]三Choi 等在对Pfam 数据库蛋白结构域分析时发现已有的微生物可能发生过基因水平转移的占1.1% 9.7%,其中多于一个蛋白结构域基因发生水平转移的古菌占一半以上,而细菌占30% 50%,真核生物不到10%,这说明原核微生物发生基因水平转移的频率远远大于高等生物,他们也通过对比发现HGT 对于群落SSU (small subunit)rRNA 基因整体的系统发育分析影响不大[8]三Garcia?Valle 等
建立了基因水平转移数据库(HGT?DB),收录了多种微生物发生基因水平转移的数据和相关证据[9]三
1.2 16S rRNA 基因的多拷贝及异质性很多原核微生物基因组中rRNA 基因是多拷贝的,同一菌种中不同拷贝的基因序列也可能存在差异(异
质性)[10]三Větrovsky ′等研究了1690种已知的细菌基因组,发现只有15%的基因组中16S rRNA 基因是单拷贝的,21%的基因组含有3 7个拷贝,最大的拷贝数是15(Brevibacillus brevis NBRC 100599和Photobacterium
profundum SS9),2.4%的基因组中16S rRNA 基因具有1%以上的序列差异[11]三在此之前,Pei 等[12]通过对数据库中的rRNA 序列进行分析时也发现,425个种都具有2 15个不等的rRNA 基因拷贝数(2.22±0.81),如古菌一般含2 4个,氨氧化细菌含1 2个,固氮菌一般含1 3个;235个基因组中16S rRNA 基因序列异质性变化在0.06% 20.38%之间,例如古菌Haloarcula marismortui 基因组含有的两种16S rRNA 基因序列差异性达到了5%三多拷贝的存在给微生物群落的定量分析带来诸多问题,使群落的多样性估计和结构分析存在
较大的偏差[13]三Větrovsky ′等使用高通量测序法分析土壤细菌时发现具有低拷贝16S rRNA 基因的类群如Acidobacteria 的丰度会被低估,而具有高拷贝16S rRNA 基因的类群如Gammaproteobacteria 的丰度会被高估三
在某些特定情况下,对于拷贝数多或异质性大的菌群可以用其它替代性的单拷贝基因来分析其多样性或进化关系,如GroEL 伴侣蛋白,RNA 聚合酶β亚基(rpoB ),DNA 回旋酶β亚基(gyrB )和热休克蛋白(dnaK )等[14?15]三也有人使用hsp 60进行Enterobacter 的系统进化和分类研究[16]三异质性问题对16S rRNA 基因高通量测序研究的影响还需要进一步系统性评估三
1772 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
2772 生 态 学 报 35卷 1.3 16S rRNA序列的二级结构
不论种间的16S rRNA基因序列差异有多大,在进化过程中16S rRNA都保留了相似的二级结构,与Escherichia coli的二级结构相似性很高[17]三Thermoanaerobacter tengcongensis含有4个16S rRNA基因,这些基因的一级结构差别达到了6.7%,但二级结构却是很保守的[12]三研究者通过元基因组学方法发现其它细菌rRNA序列与Escherichia coli的16S rRNA序列相似性为80.9% 99.0%时,它们的rRNA操纵子可以通用,只不过代时将会增加,这个研究表明保持二级结构是维持rRNA功能的重要前提三虽然HGT对微生物群落多样性的分析结果影响较小,但如果进行研究的某些微生物类群中16S rRNA基因发生HGT可能性较大,要精确构建进化树则需根据已有的实验经验综合进行分析三
RNA分子具有降解速度快且难以结晶的特点使得难于通过X射线晶体衍射和NMR(Nuclear Magnetic Resonance)等方法提高对RNA分子空间结构的认识,因此利用各种计算方法从理论上分析rRNA的空间结构是目前主要的方法三原核微生物16S rRNA的二级结构相对于一级结构更加保守,因而研究二级结构对于系统进化分类很有意义[18],尤其是对于种属的鉴定[19]三很多序列比对分析软件都考虑了二级结构,如RDP aligner二ARB(http://www.arb?home.de/)二SSU?ALIGN(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/software/ssu?align/)等[20?21],使系统进化分类结果更加快速准确三rRNA二级结构分析编辑可使用ARB[22]和jphydit(http://plaza.snu.ac. kr/ jchun/jphydit/index.php)等三RNA二级结构的预测主要包括2种方法:最小自由能算法和序列比较分析方法三当前核酸数据库日益庞大,数据量呈指数性地增长,在16S rRNA一级结构的基础上进行二级结构分析对序列比对二OTU(operational taxonomic units)分类就变得更加重要[23?24],因此应该加强二级结构分析预测算法及软件的研究三
1.4 16S rRNA基因序列分析数据库
研究者们已经建立了一些专门针对于16S rRNA的数据库,储存16S rRNA基因序列,通过互联网对新测定的序列进行比对分析,比较著名的数据库有SILVA(http://www.arb?silva.de)[25]二RDP(http://rdp.cme.msu. edu/)[21]和Greengenes(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/)[26],人们可以从这些数据库中获取高质量的16S rRNA基因序列信息三rrnDB(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/rrndb)数据库专门用于记录细菌和古菌基因组中rRNA和tRNA基因的拷贝数[27]三在NCBI二DDBJ和EMBL数据库中也有许多16S rRNA基因全长和短序列,如NCBI Genbank中有几十万条大于1000bp的人体微生物群落的16S rRNA序列三某些领域也建立了一些专业的数据库,如病原微生物16SpathDB(http://147.8.74.24/16SpathDB)数据库,可用于鉴定对临床重要的细菌16S rRNA序列[28];CORE[29]是人体口腔微生物方面的专业数据库三Comparative RNA Web Site(http://www.rna. https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/)是分析rRNA二级结构的数据库三EzTaxon?e收集了已培养或未培养微生物的16S rRNA序列信息,常用于鉴定新分离的菌株[30]三probeBase可用来检索与16S rRNA有关的探针[31]三
2 16S rRNA基因在研究微生物群落中的应用
常规的微生物分子生物学研究方法如分子杂交二SSCP二DGGE二RFLP二ERIC?PCR二FISH及克隆文库法等相对简单,易于实验操作,但得到的信息量有限,分辨率普遍较低三近些年来发展起来的高通量测序[32?33]和基因芯片技术[34?35]强有力地推进了微生物生态学的研究三尽管每种方法都有各自的局限性,但这些技术的应用使人们对环境中的微生物群落有了更深入的认识[35?36]三图2勾画出了常用的利用16S rRNA基因分析微生物群落结构和多样性的基本流程三
2.1 指纹图谱技术
基于16S rRNA基因的指纹图谱技术如DGGE二TGGE二SSCP二ARDRA和T?RFLP等被广泛用于微生物群落的研究中[37]三由于指纹图谱技术的操作相对较简单,在环境微生物动态监测和分析等方面得到了广泛应用[38?39]三表1列出了常见的指纹图谱分析方法的原理和优缺点,并与多基因序列分析(MLSA)进行比较三
图2 基于16S rRNA 基因的微生物群落多样性分析的主要流程
Fig.2 Pipelines for microbial diversity analysis based on the 16S rRNA gene
表1 各种rRNA 分析技术的原理和比较
Table 1 Comparisons of fingerprinting profiling techniques
方法Method
原理Principle 特点Characteristic 参考文献References 核糖体分型(Ribotyping)
利用限制性内切酶对整个基因组进行酶切,用标记的16S rRNA 基因探针与之杂交,检测相应的RNA 操纵子的位置只与限制性酶切位点的变化相关,需进行杂交试验,较费时[40]扩增性rDNA 限制性酶切片段
分析(ARDRA)
对16S rRNA 基因扩增或克隆产物进行限制性酶切片段长度多态性分析分辨率高,与限制性位点有关,费时[41]末端限制性片段长度多态性分
析(T?RFLP)
通过PCR 技术二DNA 限制性酶切技术和荧光标记技术得到末端带有荧光标记的限制性多态性片段方便快捷,灵敏度高,并只与末端限制性片段的大小有关[39]16S 23S 内部转录间隔区(ITS)分型
ITS 片段在进化过程中产生更多的变异,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS 序列上表现出差异比16S rRNA 基因序列具有更大的变异,对亲缘性更近的种属分型更有用[42]核糖体ITS 区自动分型(ARISA)利用荧光标记微生物核糖体基因间隔
区(ITS)对差异进行分析
分辨率较高[43]限制性片段长度多态性分析(RFLP)整个rRNA 基因的限制性片段长度多
态性分析
灵敏度高,操作要求高,分析较复杂[44]变性梯度凝胶电泳(DGGE)DNA 在不同浓度的变性剂中解链行为不同,导致电泳迁移率发生变化,从而
将片段大小相同而碱基组成不同的DNA 片段分开
检测片段在500bp 以内为宜,中等分辨率,只能检测优势菌群[45]温度梯度凝胶电泳(TGGE)DNA 在不同温度梯度环境中解链行为的不同会导致电泳迁移率发生变化
大片段DNA 由于Tm 值较高,检测难度较大[46]单链构象多态性(SSCP)单链DNA 的构象差异导致其在凝胶电
泳中的迁移率变化
分辨率中等,检测片段小于400bp 最为理想[47]多基因序列分析(MLSA)
通常对几个长度为500bp 左右的目的
基因进行测序,用于进化分析能有效地在种水平上鉴定菌株,还可用于生态型的划分[48] ARDRA:amplified ribosomal DNA restriction analysis;T?RFLP:terminal restriction fragment length polymorphism;ITS:internally transcribed
spacer;ARISA:Automated ribosomal intergenic spacer analysis;RFLP:Restriction fragment length polymorphism;DGGE:Denaturing gradient gel electrophoresis;TGGE:Temperature gradient gel electrophoresis;SSCP:Single?strand conformation polymorphism;MLSA:Multilocus sequence analysis 3
772 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
4772 生 态 学 报 35卷 整体来看,指纹图谱技术通量和分辨率比较低,可以用来对样品进行初步的筛选或评估,例如有时为了减少测序量,可以先进行ARDRA或其它方法分型,然后根据分型结果对有代表性的样品再进一步研究三某些情况下如果仅使用16S rRNA的信息,分辨效果可能不是太好,可使用其它一些分子分析方法作为补充三相比16S rRNA和23S rRNA来说,ITS序列在进化过程中由于面临着较小的选择压力故存在较大的变异,因此ITS 的长度和序列的多态性能用来区分不同种的原核生物[42]三在种的水平上,MLSA也是鉴定菌株非常好的方
法[48],可利用16S rRNA基因序列和各种指纹技术将未知菌株聚类到一个科或属里,然后根据这一组菌株的特点选择某些代表性的标记基因进行MLSA分析,从而进行种二亚种以及生态型的划分三有时也可参考数据库MLST(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,)或PubMLST(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,)进行一些病原微生物的多位点序列分型方面的信息查询三某些微生物之间的16S rRNA基因序列几乎相同,但是DNA杂交值却明显低于70%,因此它们代表着不同的种三16S rRNA基因同源性低于97%的菌株间其基因组DNA的相似性均低于60%三DNA?DNA杂交(DDH,whole genomic DNA?DNA hybridization)实验操作复杂,不适合进行较大范围的系统分类研究,因此16S rRNA序列分析的结果可以说明是否有必要进行DDH实验三随着高质量序列数据的快速增长,ANI(average nucleotide identity)作为一种很精确且方便使用的分类方法,应用越来越广泛[49]三
2.2 荧光原位杂交技术(FISH)
FISH技术是一种不依赖PCR的分子技术,它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可原位监测和鉴定样品中不同的微生物个体,已经广泛应用于微生物定量分析和群落结构分析[50?51]三FISH的原理是根据待测微生物的16S rRNA基因中的保守序列,设计相应的特异性寡核苷酸探针,并进行荧光标记,通过探针与环境基因组中的DNA分子进行杂交,检测该特异微生物种群的存在和丰度三利用分子遗传上保守性不同的特异序列,可以在不同的分类水平(如属二种等)上进行检测三当前的荧光探针安全且具有很好的分辨力,如果使用具有不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,可同时检测多个靶序列[52?53]三
FISH技术与其它方法结合能够更好地发挥优势,这些技术包括microcolony?FISH二DVC?FISH二in situ PCR?FISH二CPRINS?FISH二CARD?FISH二MAR?FISH等[53?54],其中CARD?FISH技术很好地解决了目标微生物数量较少时信号检测灵敏度低的问题[55]三Behrens等利用EL?FISH与NanoSIMS技术进行了微生物群落中单细胞进化分类和代谢活性的研究[56]三FISH技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷酸探针以减少干扰,可使用ARB软件包结合probeBase数据库等多种方法进行探针分析和设计三综合来看,应用FISH技术不仅能研究微生物群落的结构特征和空间分布,还可以跟踪微生物种群的动态变化,此外利用mRNA等作为目标分子还可以进行群落代谢方面的研究三
2.3 实时定量PCR(qRT?PCR)
qRT?PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量的分析,具有特异性强二重复性好二准确快速等优点三通常使用的荧光化学方法有TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法等三许多因素都会影响qRT?PCR反应在定量上的准确性,如细胞裂解效率二抑制剂的去除程度二SYBR GreenⅠ的浓度二同源和异源DNA背景二操作流程设计二目标基因的选择以及PCR产物的长度等,因此在操作时需要优化条件,最大化地减小误差[57?60]三各种qRT?PCR方法都有其自身的优缺点,操作时需要根据实验设计特点选择三对于特定类群微生物也可使用一些功能基因代替16S rRNA基因进行定量,如利用mcr基因定量产甲烷菌[58]三在绝对定量时,要用到标准样品,可以用带有特定基因的质粒,或者利用直接从环境样品中扩增的PCR产物做标准样品三各种实验操作因素(不同反应批次的差异二加液误差等)对qRT?PCR结果影响很大,因此在定量多个环境样品时,最好能用96或384孔的反应板一次完成三
qRT?PCR既可以对微生物群落的总体进行定量分析,也可以对具体的种属进行定量研究三某些种属的16S rRNA基因分辨率较低,可使用一些功能基因进行定量,如使用特异的invA基因研究Salmonella属三Liu 等设计了一种新的qRT?PCR方法用于定量分析群落16S rRNA基因的丰度,并分析了rRNA基因拷贝数等对定量的影响[13]三qRT?PCR与其它技术相结合使用可更好地研究群落的结构和多样性,如指纹图谱技术二测序
技术等[61]三
2.4 基因芯片技术
基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性二多样化二微型化和自动化三基因芯片的测定结果与高通量测序[62]二qRT?PCR[63]的结果有很好的一致性三根据已知的基因序列信息,研究者们设计出了许多基因芯片进行微生物群落结构和功能的研究,包括基因组芯片二功能基因芯片和系统进化芯片等,主要用于评估多样性和鉴定病原菌等三其中系统进化芯片(PhyloChip)是含有与SSU RNA基因序列互补的寡核苷酸探针的阵列,适合于微生物群落结构组成和动态变化分析三PhyloChip已应用于研究人的肠道二口腔以及水体二土壤和植物根系等微生物群落[64?66]三利用微生物的功能基因作为探针开发出的功能基因芯片 GeoChip[67],已广泛应用于检测各种环境样品中微生物群落的功能基因[68?69]三基因芯片的信号扫描及数据处理有许多商业软件可供使用,一些开源工具如Bioconductor平台(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/)[70]和R语言(http://www.r?https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/)也常用于基因芯片的数据分析中三
在定性分析方面,基因芯片是根据已知的基因序列信息制作的,因此无法检测到未知的基因信息,也可能检测不到那些丰度较低的基因三检测范围较广的基因芯片由于探针数目太多易产生假阳性,设计特异性探针能够克服这类问题,比如近些年来开发出专门用于检测人体微生物相关菌群的HITChip[71]及用于检测口腔微生物的OC Chip[72]等三在定量分析方面,由于某些菌rRNA基因操纵子是多拷贝的,而使测定的信号总量代表的是16S rRNA基因的总拷贝数,只有使用改进的算法才能更精确地进行定量分析[73]三与高通量测序相比,基因芯片方法实验费用低,数据分析过程相对简单,有时在研究特定的菌群和功能基因时,基因芯片技术是一个较好的选择三而高通量测序是一个 开放系统”,可以探测到环境中新的基因信息,信息更加系统二丰富,但需要利用生物信息学方法和生物化学知识对序列数据进行深入挖掘三
2.5 高通量测序技术
要全面系统地分析微生物的多样性,首先要获取16S rRNA基因序列,如何快速准确地获取大量的序列信息就显得很重要三传统的Sanger测序方法操作复杂二通量低,难于解决这个问题三2005年,美国454Life Science公司首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量测序系统,将第二代测序技术推向了市场三此后,Illumina公司和ABI公司相继推出了Hiseq和SOLiD等测序平台三现在利用高通量测序技术研究环境微生物多样性的报道越来越多,这些系统的主要优点在于通量高,而且利用Barcoded PCR技术使得在一次运行中能同时进行多样本的大规模测序,使测序成本大大降低三基于单分子测序原理的第三代测序技术也在迅速发展,Helicos Biosciences公司推出了单分子DNA测序仪tSMS Performance,PacBio与ZSGenetics公司也在大力研发新一代测序仪[74],第三代测序技术的进步将使测序更加快速准确,且能大大增加读长,而且可以直接对RNA测序三表2总结了几种最常用的高通量测序仪的主要技术参数三
表2 目前常用的高通量测序平台的主要技术参数
Table2 Main technical specifications of several pyrosequencing platform
测序仪类型
Platform运行时间
Run time读长(bp)
Length(bp)运行通量
Throughput错误类型
Error type
Roche
454GS FLX Titanium XL+ 454GS FLX Titanium XLR7023h
10h
<1000
<600
≤700Mb
≤450Mb
Indel
Indel
Illumina GAIIx HiSeq2000 MiSeq 14d
11d
65h
2×150
2×100
2×300
≤95Gb
≤600Gb
13.2 15Gb
Substitution
Substitution
Substitution
Life technologies
SOLiD5500xl8h75×35PE<300Gb(nanobeads)A?T bias Ion Torrent
PGM316chip v2 4.9h400≤1Gb Indel 5772
9期 刘驰 等:16S rRNA基因在微生物生态学中的应用
6772 生 态 学 报 35卷 基于测序技术进行微生物多样性研究的方法主要有两种:一种是基于16S rRNA基因的扩增子测序,另一种是基于环境基因组DNA的宏基因组测序,两种方法各有优缺点[75?76]三相比之下,基于16S rRNA基因的高通量测序技术更加常用,并且消除了克隆问题,可以综合研究各个可变区,分析方法也相对成熟,不过在具体的实验分析中也存在着一些问题需要解决,例如PCR扩增的偏差二扩增错误二测序错误等都可能影响群落α?多样性的准确估计[77?79]三在16S rRNA基因扩增子测序中,Roche GS FLX+测序平台理论读长最高可以达到1000bp,一块PTP板可获得超过80万条序列,而Illumina测序平台具有通量高的优点[80],使得Miseq和Hiseq系列测序仪广泛用于微生物生态学研究中三宏基因组测序无需PCR扩增,既可以研究微生物的群落组成和多样性,也可以反映群落的很多代谢特征,但数据分析相对复杂三
3 16S rRNA基因实验操作过程中的问题
3.1 核酸提取
环境基因组总DNA的提取效率影响着对微生物群落组成的准确鉴定和定量分析三核酸提取主要分为细胞破碎二核酸沉淀以及后续纯化三个环节三环境样品DNA提取过程中,不完全的细胞裂解二基质对DNA的吸附二酶抑制剂的共提取以及提取过程中DNA或RNA的降解是主要的一些问题[81],尤其是土壤样品,提取DNA或RNA过程中往往浸提出腐殖酸物质,抑制PCR或反转录反应三商业化的试剂盒(比如MP公司的FastDNA Kit for Soil二Mo Bio公司的PowerSoil DNA Isolation Kit等)能够部分解决此问题,不过价格较贵三其它成本较低的方法包括SDS裂解法二酶解法二玻璃珠破碎法及超声波破碎法等,这些方法提取的DNA往往需要后续再纯化以满足实验需要三对于抑制物含量较高的土壤DNA,可以用水稀释或利用CTAB方法进一步纯化后再扩增三研究表明,初步提取的DNA利用CTAB或/和PVPP可以有效去除大部分抑制剂或杂质[82]三针对不同的环境样品,应该根据文献报道的相关结果对DNA提取方法进行优化三Canto等在研究污泥微生物时使用不同的细胞直接裂解方法,获得了一种实用有效的DNA提取方法[83];Kuczynski等建议在研究复杂微生物群落时应使用多种方法进行细胞裂解[84];Flores等研究了一种新的直接PCR法以简化DNA提取步骤[85]三对于粘性土壤,可以加入skim milk以提高DNA的提取效率[86]三用试剂盒提取的DNA,进行qRT?PCR实验时的平行性往往优于自配试剂的提取方法三在进行样品总RNA提取过程中,要特别注意污染和降解问题[87],一些RNA酶抑制剂可以用于样品运输过程中的保存,以防止RNA降解,如RNA later和Methanol/ HEPES溶液[88]等三必须注意的是,要使结果分析重复性和精确性较高,在提取以及后面的操作过程中都要严格控制污染问题,因为相比在测序和分析过程中引入的偏差,实验污染等问题可能对结果影响更大三
3.2 引物的选择
16S rRNA基因不同区域的保守度是不一样的,因此扩增区域的选择会影响多样性的分析结果[89]三研究者们从各个方面对引物的选择问题进行了分析,主要有引物长度二扩增长度选择二引物覆盖度等三Cai等发现污泥微生物多样性分析与扩增区域有很大的关系,测序深度会影响低丰度细菌的鉴定[90]三利用27F/338R (V1 V2)引物,人们发现Verrucomicrobia类群在研究的土壤中数量相对较少,但改用515F/806R(V4)引物后,发现土壤中该类群的丰度变大[91]三理想的引物是能够尽量多地将环境样品中的基因扩增出来,同时又要能够区分出不同的种属三为了提高对环境样品DNA扩增的覆盖度,可以设计简并性通用引物,即使这样,也不能覆盖所有的菌群[92],而且,增加位点的非特异性可能会增大扩增偏差的概率三表3[93?101]列出了一些常用的16S rRNA基因的引物,不同的引物对不同种属的覆盖度不一样,某些引物对细菌有很高的覆盖率,某些专门针对古菌,还有些是细菌和古菌通用的引物三
有的学者建议细菌与古菌群落应该分别用专用引物进行分析[102],而其他一些学者则直接使用细菌与古菌通用引物[95?96]三因此,在实验设计时需要考虑到实验目的而有针对性地进行选择,对不同的通用引物的覆盖能力要有个大致的了解三利用454GS FLX平台,测序长度可以达到800bp,然而PCR产物短时,得到的序列数量多二质量好,所以一般选择400bp左右的扩增子进行测序三目前看来引物的选择很大程度上还是要根
据经验,没有统一的标准,V3 V5区引物应用较多三要根据测序平台的测序长度而选择适当的引物对,如Miseq 测序仪使用V2试剂盒时的测序长度在250 300bp 左右,通用引物515F /806R 是一个较好的选择[103],但该引物得到的古菌序列数要比通用引物515F /909R 低三
表3 常用于扩增16S rRNA 基因的高通量测序引物对
Table 3 Some primer pairs for 16S rRNA gene amplification
适用的菌Category 引物名称Names 引物序列Sequences 覆盖区域Positions 参考文献References Universal
U341F CCTAYGGGRBGCASCAG V3 V4[93]细菌和古菌U806R GGACTACNNGGGTATCTAAT Universal
U515F GTGYCAGCMGCCGCGGTA V4 V5[33]细菌和古菌
U806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT Universal U515F GTGYCAGCMGCCGCGGTA V4 V5[94]细菌和古菌
U909R
CCCCGYCAATTCMTTTRAGT Bacteria 细菌B8F
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG V1 V3[95]B533R
TTACCGCGGCTGCTGGCAC Bacteria 细菌U341F CCTACGGGRSGCAGCAG V3 V4[96]B785R
TACNVGGGTATCTAATCC Bacteria 细菌U341F CCTAYGGGRBGCASCAG V3 V5[95]B907R
CCGTCAATTCMTTTGAGTTT Bacteria 细菌B343F TACGGRAGGCAGCAG V3[97]B534R
ATTACCGCGGCTGCTGGC Bacteria 细菌U347F GGAGGCAGCAGTRRGGAAT V3 V4[98]U803R
CTACCRGGGTATCTAATCC Bacteria 细菌U519F CAGCMGCCGCGGTAATWC V4 V5[99]B926R
CCGTCAATTCMTTTRAGTT Archaea 古菌A349F GYGCASCAGKCGMGAAW V3 V4[100]A806R
GGACTACVSGGGTATCTAAT
Archaea 古菌A344F ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA
V3 V5[101]A915R GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 3.3 PCR 扩增
PCR 条件的选择对高通量测序结果影响很大三在准备高通量测序用的PCR 产物时,最好能用HPLC 纯
化的引物,以减少非特异性扩增或短片段,现在很多商业公司多用PAGE 纯化的引物三PCR 扩增时使用的模版浓度二PCR 的循环数二不同的聚合酶对微生物多样性结果也有影响[104]三相比其它聚合酶,Finnzymes 生产的Phusion High?Fidelity DNA Polymerase 保真性高,常用于高通量测序时的PCR 扩增;其它酶如Agilent 公司的pfuUltraII 的持续合成能力较强,产生的扩增产物变异较少,但价格较高三降低扩增循环数(通常不超过30个循环)及使用高保真聚合酶可以减少扩增偏差三通常对一个样品进行PCR 时要做技术重复并进行混合跑电泳回收以减小扩增效率影响三用带有Barcode 的高通量测序引物做PCR 时,通常会产生一些非特异性的杂带,所以要对每个样品的PCR 产物进行切胶纯化,这样才能保证不同barcode 的PCR 产物混合时定量准确,以使不同样品获得的序列数大致相同三市场上出售的很多胶纯化试剂盒都能满足纯化要求三修补PCR (Reconditioning PCR),即第一轮PCR 在20个循环的扩增后,取少量模板,其它条件不变,再进行5个循环的
修补扩增,由于引物相对模板的浓度较大,可以减少异源双链和嵌合体的产生[105]三3.4 测序问题样品量少二测序深度要求不高的情况下,传统的16S rRNA 克隆文库结合Sanger 测序技术可以准确二快捷
7772 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
8772 生 态 学 报 35卷 地产生结果三目前常用的高通量测序法不需构建克隆文库,适用于样品量大或测序深度要求高的情况三如果利用罗氏公司的454GS FLX+平台,一般400bp左右的PCR产物测序效率较高,质量较好,也能够满足系统分类的要求三一个454GS FLX+测序反应可测定多达196个样品,从而大大降低了单个样品的测序成本三一个反应一般测定100 160个左右的样品,每个样品理论上可以得到5000 8000条左右的序列,能满足大多数环境样品的测序深度要求三但是,由于溶液样品转移的误差和一些不明原因,往往有些样品得到的序列数量过多或过少,对序列数过少的样品必需补测三利用Illumina公司的HiSeq或MiSeq测序仪及Ion Torrent的
PGM研究微生物群落与最初的454测序方法的过程基本一样三Illumina公司的HiSeq和MiSeq测序仪具有更高的通量,读长则相对较短,新型的MiSeq测序仪可以产生300bp以上的序列长度,一次可以测定200个以上的扩增子样品,每个样品可以得到2万条以上的序列数,在微生物多样性研究中具有很大的应用潜力三测序的精确性对数据的分析结果会产生不可忽略的影响[79],研究者们分别从测序错误对下游数据分析的影响二检测错误的方法二定量控制方法二不同平台的错误类型等方面进行了综合研究三虽然仍存在同聚物测序易出错以及整体错误率相对较高的问题,但随着质量检测方法的改进二数据分析方法的优化及测序技术的进步,高通量测序精度得到了很大的提高[79,106]三利用不同的测序引物从两端测序,以增加重叠区长度也可减少测序错误[107?108],然而,即使这样仍有40% 50%的测序产物不能准确地拼接三Miller等开发了一种算法EMIRGE,可用于拼接Illumina测序仪产生的短序列,从而组装出长的16S rRNA基因片段,他们发现这种方法可重复性好,分析群落变化时准确度较高[109]三
4 高通量测序数据的处理
高通量测序产生出了海量的DNA序列数据,如何对这些数据进行生物信息学处理来提取有生物学意义的信息是一个关键过程三通过生物信息学处理,可以得到微生物群落的组成二结构二多样性及其与环境因子的关系等方面的信息三现在已经开发了一些专门针对16S rRNA高通量测序数据处理的生物信息平台三有些平台允许上传数据,利用公共的服务器及相关在线工具进行运算三但对于大容量数据,只有在本地计算机上运算三很多免费软件都是基于Linux操作系统编写的,Perl二Python二R语言在生物信息学中也很常用,所以要求操作者对这些知识有一些基本了解三
4.1 数据前期处理
高通量测序数据一般包含序列信息和测序质量数据,数据应该首先进行质量检查,去除质量不好(读长异常二碱基识别模糊等)的序列,然后进行嵌合体检查,如果有叶绿体和线粒体序列的污染,应该先把这部分序列剔除,随后二次随机采集相同数量的序列数,用来进行序列同源比对聚类[110]等,最后根据OTU矩阵和赋予的种属关系进行统计分析(图3)三
每一步运算都有一些软件供选择使用,比如可用来进行序列比对的有PyNAST二SINA二MUSCLE二ClustalW二MAFFT二Blastn等[111?113],它们软件的算法各有特色,而且都在不断地得到改进三ARB二BioEdit二DNAstar等软件包常用来进行序列编辑三检测测序错误的算法主要有PyroNoise二DeNoiser和SeqNoise等[114?115]三由于微生物群落组成复杂,产生的数据量巨大,因此不同的软件会被研究者们选择性地组合成软件包以直接对原始数据进行更加方便系统性的分析,如RDP′s Pyrosequencing Pipeline[21]二QIIME[116]二Mothur[117]二STAP pipeline[75]等,这些软件包各有优缺点,使用时需学习相应的操作命名二文件格式和使用特点,在进行具体实验数据分析比较时也可根据需要合理地进行软件组合,这需要研究者们对软件的算法二计算机处理能力二统计方法等有所了解三如果使用克隆文库分析方法,在16S rRNA基因克隆文库构建完成后,就可以对文库中的克隆进行测序,使用SeqMan二Sequencher等软件可进行序列拼接三BioEdit是一个免费下载软件,可以在Windows下使用,对处理一般序列数据包括高通量测序数据都很有帮助三熟知各种生物信息学软件的特点才能更合理高效地处理测序数据和数据的深度挖掘[78]三
4.2 去除嵌合体
高通量测序的数据中会存在一些嵌合体,数据处理时一定要去除这部分序列三以往常用的嵌合体去除方
图3 利用RDP 平台分析环境样品高通量测序数据的技术流程
Fig.3 Pyrosequencing data analysis pipeline based on RDP platform
PCoA:principal coordinate analysis;CCA:canonical correspondence analysis;VPA:variation partition analysis
法如RDP二Bellerophon [118]均不适用于高通量测序所产生的大量短序列三近年来发展了一些新算法和程序,例如ChimeraSlayer [119]二Perseus [115]和UCHIME [120]等都可用于嵌合体的预测三嵌合体的识别主要是通过将短读长序列与高质量参考序列进行比对来实现[115,119?120]三UCHIME 适用于预测短读长高通量测序数据,其检测效率高二运行速度快,是当前处理高通量测序数据较好的方法三利用UCHIME 识别454GS FLX +测定的土壤16S rRNA 序列(400bp)中的嵌合体,发现大约有1% 18%的序列为嵌合体三在利用计算机软件识别嵌合体时,自然界中16S rRNA 基因通过水平转移产生的嵌合体也可能被误认为是实验过程中产生的嵌合体而被去除,PCR 过程中产生的异源双链和突变序列也会对检测造成影响,因此应该不断更新数据库信息,优化实验条件和软件算法,尽量减小偏差三
4.3 OTU 计算
样本中OTU 数量和相对丰度代表实际观察到的多样性,因此计算不同样品中OTU 的分布,是高通量测序数据处理中一个非常重要的步骤三计算OTU 之前,序列要进行比对(alignment)三比对的算法有很多,聚类(clustering)的方法也有多种,不同的软件所选择的算法各有不同,如ESPRIT 平台应用成对比对法(pairwise alignment)[121],RDP 利用Infernal alignment 比对计算距离和完全连锁聚类法(complete linkage cluster)进行OTU 聚类,MUSCLE 软件利用逐步比对方法(progressive alignment)[122]三Barriuso 等比较了各种方法计算多样性的优缺点,发现ESPRIT 和RDP 能够给出较一致和准确的结果[123]三对于OTU 计算分类,Uparse(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html, /uparse /)是目前较好的方法[124],相比其它OTU 分类方法,其计算更快速,结果更准确,可以将该软件组合到QIIME 分析流程中,也可以单独使用三目前来看,OTU 计算复杂二运算速度较低并且需要较大的储存
空间是一大难题,因此需要对计算方法进一步改进[125?126]三
4.4 系统进化分类常用的系统进化分类数据库有RDP二Greengenes二SILVA 和NCBI 等,国际著名数据库RDP 中的分类系统是最常用的三分类的基本过程是将测定的序列与数据库中已知的序列进行比对,确定其系统进化分类的位
9
772 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
0872 生 态 学 报 35卷 置[127?128],这种方法具有效率高二稳定性好的优点三也可以先根据整个测序数据中的各个序列之间的相似性程度进行OTU聚类[117,121],之后根据不同OTU的代表序列使用RDP classifier等工具进行数据库搜索[116,129],对OTU进行种属分类,然后进行后续分析三OTU的划分与分类水平之间的关系是很难准确界定的,通常是将相似性大于97%的序列归为一个OTU,不同类型菌群的相似性阈值也存在差异[130?131];另外使用其它不同的标志基因进行系统分类时OTU阈值的设定也各不同三系统分类研究是进行各种微生物学研究的基础,通过各种方法对原核生物精确分类和确定典型菌株具有重要意义[132],不断更新的LTP(All?Species Living Tree Project)搜集了大量的来自于典型菌株的序列数据并提供了根据已有的SSU rRNA基因序列所重建出的系统进化树作为参考[133],这些数据可被下载到ARB程序包中以方便序列比对二序列编辑等操作三4.5 进化树构建
微生物群落的多样性分析有时要用进化树来显示三构建进化树的主要过程包括获取序列数据二确定进化距离模型二进行多序列比对二根据比对结果提取信息二选择建树算法与参数构建进化树三进化树的构建基于距离的方法有UPGMA(unweighted pair?group method using arithmetic averages)二ME(minimum evolution method,最小进化法)和NJ(neighbor joining,邻接法)等,其它的方法包括MP(maximum parsimony,最大简约法)二ML (maximum likelihood,最大似然法)以及Bayesian推断等方法三一般来讲,如果模型合适,ML的效果较好,但相对耗时三对于相似度很低的序列,NJ往往出现长枝吸引现象三对近缘序列,可选择MP,其用的假设最少, MP一般不用在远缘序列上三基于16S rRNA基因的研究常用的参数模型有Kimura2二Jukes?Cantor等三虽然有研究者对各种进化树构建方法的准确性进行了探讨[134],然而进化树分析相当复杂,很难精确地比较,经常要根据经验选择合适的参数模型和建树方法三有时可用不同的方法构建进化树,如果所得到的进化树结构相似,说明结果较为可靠三表4列出了常用的与进化树构建相关的软件和特点,其它进化树构建软件可参考网站(https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/phylip/software.html)三
表4 部分进化树构建软件的特点
Table4 Some tools for phylogenetic tree constructions
软件
Software算法Algorithms特点Characteristics网址Website
ARB NJ,MP,ML多功能软件包,系统进化分析功能齐全,可进行
比对二编辑等,多种算法可供选择http://www.arb?home.de
Fast Tree ME,ML,NJ建树速度较快https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/fasttree
MAC5Bayesian基于贝叶斯方法的建树工具,后验概率对先验概
率的设置比较敏感https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/software/mac5 Mayas Bayesian可以将核酸序列以及形态学观察结果等整合到
数据文件中进行综合分析https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,
MEGA NJ,MP图形化软件,可以通过网络进行序列的比对和数
据搜索https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,
PAML ML进化参数估计二进化假说检验二分歧时间估计二正
选择估计等https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/software/paml.html PAUP MP,ML通用的构建系统进化树的商业软件https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,
PHASE ML,Bayesian参数模型考虑了rRNA的二级结构https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/resources/phase PHYLIP NJ,MP,ML命令行格式,功能强大https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,/phylip.html PHYML ML最快的ML建树工具http://www.atgc-montpellier.fr/phyml
通常构建完进化树后需要做Bootstrap检验,如果检验值过低,所构建进化树的拓扑结构可能存在问题三对于丰度很高的微生物群落,如果得到的序列数太多,就很难建树,也难以对结果进行图形化显示以及总体分类特点的比较[121],有时即使能够构建出复杂的进化树,也会因为分支太多而无法分析[135],因此图形化显示复杂系统的物种进化关系一直是个难点[136]三VITCOMIC(http://mg.bio.titech.ac.jp/vitcomic/)能够分类显示基于大量16S rRNA基因序列分析基础上的群落组成特征[137],相比其它工具,其最独特的功能是可直观地比
较样品间分类组成上的差异三
4.6 微生物群落数据的生态学统计分析
传统的基于分类关系的群落数据分析主要有:α?多样性分析(Chao1,Simpson index,Shannon index,rarefaction curves 等)二物种丰度差异分析二样品物种分布二β?多样性分析(Cody index,Sorenson index,Bray?Curtis index,Morisita?Horn index)等三结合群落结构和系统进化信息的α?多样性分析有Faith 系统发育多样性(Faith′s phylogenetic diversity)二平均成对系统发育距离(MPD)二平均最近类群距离(MNTD)二物种多样性矩阵二二次熵二系统发育关联性回归等;β?多样性分析包括了phylogenetic Sorenson index,UniFrac distance metric,群落间MPD 和MNTD 计算[138?140]等三研究环境因子和群落关系的分析方法有稀疏曲线分析二物种?环境回归分析二多元统计分析等三
多元统计分析方法已广泛应用于多种分子生物学技术的数据分析中,如指纹图谱二基因芯片二高通量测序等[39]三多元统计分析方法中探索性的方法有聚类分析二主成分分析(PCA)二对应分析(CA)二去趋势对应分析(DCA)二非度量多维标度(NMDS)等,NPMANOVA二ANOSIM 等可用于检验样品组间的差异显著性;解释性的方法有冗余分析(RDA)二典范对应分析(CCA)二线性判别分析二方差分解分析(VPA)二Mantel test 等[141?142]三
各种方法在实际研究中都有其使用条件,需根据不同的研究目的二环境因子及实验设计选用合适的方法,例如当环境梯度中OTU 类别相差较大时或主成分不能解释大量变异时,PCA 可能不适合,可考虑CA 或NMDS 等其它方法三对于基于距离矩阵的方法来说,距离度量方法的选择有时可能要比排序方法的选择更为重要[143]三在微生物生态学研究中要正确使用这些方法需要熟知方法的原理二特点及输入的数据类型[141]三对群落组成数据进行统计分析时需正确运用统计方法,比如要检验β?多样性形成和维持因素的假说时,若数据不满足多元正态假设就不能使用依赖于多元正态假设的显著性检验,而有时需对数据进行转换以满足正态假设三
在微生物生态学研究中,基于系统进化信息的多样性研究比单纯的分类多样性二功能多样性分析信息量更大,从而得到了更广泛的应用[140,144?145]三基于系统发育信息的数据分析方法中常使用UniFrac 分析[146],输入的数据可以是不同序列的存在与否的数据(定性)或不同序列的丰度数据(定量,weighted)[147]三UniFrac 方法也在不断地发展,如Fast UniFrac [135]在数据处理的许多方面都进行了优化,加入了很多新功能;VAW?UniFrac 在加权方法上进行了改进[148]三在具体的数据分析中需根据目的选择软件和方法,例如要调查微生物群落特征与环境因子的关系,首先要将各环境参数标准化,然后可以计算不同样品间Euclidean 距离等,形成相似性系数矩阵三可利用R 或PASSaGE 软件包中的Partial Mantel tests 方法计算UniFrac 距离与环境因子参数的关系[149]三利用CCA二RDA 等鉴定对微生物组成重要的环境因子,用于方差分解分析,以估算不同环境因子对群落变化的贡献率,这些运算程序可以在vegan 程序包(http://vegan.r?forge.r?https://www.doczj.com/doc/be4391491.html, /)中找到,在R 环境中运行三其它还有很多统计分析软件如SONS二Tree Climber二CANOCO 等[150?151]以及其它复杂数据的分析方法如偏最小二乘路径模型二网络分析和机器学习[152?153]等,可以根据需要灵活应用三准确的实验设计和数据分析方法对于生态理论的阐述至关重要,因此,在研究微生物生态学领域的理论问题如物种分布格局二多样性时所获取的数据一定要准确合理,统计方法使用得当,这样才能分析出正确的生态学结果三
5 总结与展望
微生物生态学的研究领域非常广泛,本文主要讨论了16S rRNA 基因在微生物群落生态学领域中的应用,微生物独特的生理生化特点使得微生物生态学领域的数据获取和分析相比其它生态学领域要复杂很多[154]三虽然基于16S rRNA 基因的微生物多样性研究已经取得了巨大的进展,不过仍存在一系列问题,如数据库中部分序列数据不够准确,同一基因组中含有多拷贝16S rRNA 基因和序列异质性的问题,生态理论模型发展不足,实验操作存在诸多影响因素等,正确分析这些问题才能更好地指导我们进行微生物生态学研究三虽然基于16S rRNA 的环境微生物学研究方法最为常用,但是以16S rRNA 基因为基础的分子生物学技术并不能完
1872 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
2872 生 态 学 报 35卷 全代替其它的微生物生态学研究方法三综合利用这些技术和方法,更加有助于揭示微生物群落的重要特征,加深我们对难培养微生物功能特点的认识三未来的研究方向可能会集中在以下几个方面,(1)新技术新方法的应用:纵观生物学发展史,许多新技术的产生都给生命科学带来革命性的进步三基于高通量测序技术发展起来的宏基因组和宏转录组技术等为微生物生态学研究提供了强大的手段三对于当前的二代测序技术的应用来说,优化实验步骤仍然是一重点,当然生态模型的研究也不可或缺;(2)各种研究方法的有机结合:微生物生态学研究进入了多学科交叉阶段,要获得较大突破需要许多学科的共同进步,因此应该大力发展交叉学科,特别是生物信息学,并将其成果广泛应用于微生物生态学研究中[155]三自然生态环境的取样研究二定位观测与实验室中的控制实验相结合[154]能更好的进行生态理论上的探索研究;(3)大规模综合性研究:继续开展
类似HMP计划[156]二EMP计划[157]等大规模的与微生物多样性有关的综合性研究对于探讨微生物多样性所蕴含的生物学意义相当重要,将微生物群落特征二环境因素和生态学模型等结合起来,借鉴已有的植物和动物生态学理论[158],能为了解微生物群落结构的普遍模式和发展新的微生物生态学理论提供重要的指导思想三参考文献(References):
[1] Zuckerkandl E,Pauling L.Molecules as documents of evolutionary history.Journal of Theoretical Biology,1965,8(2):357?366.
[2] Woese C R,Fox G E.Phylogenetic structure of the prokaryotic domain:the primary kingdoms.Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America,1977,74(11):5088?5090.
[3] Rinke C,Schwientek P,Sczyrba A,Ivanova N N,Anderson I J,Cheng J F,Darling A,Malfatti S,Swan B K,Gies E A,Dodsworth J A,
Hedlund B P,Tsiamis G,Sievert S M,Liu W T,Eisen J A,Hallam S J,Kyrpides N C,Stepanauskas R,Rubin E M,Hugenholtz P,Woyke T.
Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.Nature,2013,499(7459):431?437.
[4] Chakravorty S,Helb D,Burday M,Connell N,Alland D.A detailed analysis of16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic
bacteria.Journal of Microbiological Methods,2007,69(2):330?339.
[5] Pascual J,Macián M C,Arahal D R,Garay E,Pujalte M J.Multilocus sequence analysis of the central clade of the genus Vibrio by using the16S
rRNA,recA,pyrH,rpoD,gyrB,rctB and toxR genes.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60(1):154?165.
[6] Schouls L M,Schot C S,Jacobs J A.Horizontal transfer of segments of the16S rRNA genes between species of the Streptococcus anginosus group.
Journal of Bacteriology,2003,185(24):7241?7246.
[7] Bodilis J,Nsigue?Meilo S,Besaury L,Quillet L.Variable copy number,intra?genomic heterogeneities and lateral transfers of the16S rRNA gene in
Pseudomonas.PloS One,2012,7(4):e35647.
[8] Choi I G,Kim S H.Global extent of horizontal gene transfer.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
2007,104(11):4489?4494.
[9] Garcia?Vallve S.HGT?DB:a database of putative horizontally transferred genes in prokaryotic complete genomes.Nucleic Acids Research,2003,
31(1):187?189.
[10] Wang Y,Zhang Z,Ramanan N.The actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active16S rRNA genes.
Journal of Bacteriology,1997,179(10):3270?3276.
[11] Větrovsky′T,Baldrian P.The variability of the16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses.PloS
One,2013,8(2):e57923.
[12] Pei A Y,Oberdorf W E,Nossa C W,Agarwal A,Chokshi P,Gerz E A,Jin Z,Lee P,Yang L,Poles M,Brown S M,Sotero S,Desantis T,
Brodie E,Nelson K,Pei Z.Diversity of16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes.Applied and Environmental Microbiology,2010, 76(12):3886?3897.
[13] Liu C M,Aziz M,Kachur S,Hsueh P R,Huang Y T,Keim P,Price L B.BactQuant:an enhanced broad?coverage bacterial quantitative real?time
PCR assay.BMC Microbiology,2012,12(1):56?56.
[14] Eardly B,Nour S,Van Berkum P,Selander R.Rhizobial16S rRNA and dnaK genes:mosaicism and the uncertain phylogenetic placement of
Rhizobium galegae.Applied and Environmental Microbiology,2005,71(3):1328?1335.
[15] Case R J,Boucher Y,Dahll?f I,Holmstr?m C,Doolittle W F,Kjelleberg https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,e of16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial
ecology studies.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(1):278?288.
[16] Iversen C,Waddington M,On S L,Forsythe S.Identification and phylogeny of Enterobacter sakazakii relative to Enterobacter and Citrobacter
species.Journal of Clinical Microbiology,2004,42(11):5368?5370.
[17] Cannone J S S,Schnare M,Collett J,D′Souza L,Du Y,Feng B,Lin N,Madabusi L,Müller K.The Comparative RNA Web(CRW)Site:an
online database of comparative sequence and structure information for ribosomal,intron,and other RNAs.BMC Bioinformatics,2002,3(1):2?2.
[18] Schloss P D.The effects of alignment quality,distance calculation method,sequence filtering,and region on the analysis of16S rRNA gene?based
studies.PLoS Computational Biology,2010,6(7):e1000844.[19] Chen C Y,Zhao S L,Ben K L.Phylogenetic analysis of the family Thermaceae with an emphasis on signature position and secondary structure of
16S rRNA.FEMS Microbiology Letters,2003,221(2):293?298.
[20] Schloss P D.A high?throughput DNA sequence aligner for microbial ecology studies.PloS One,2009,4(12):e8230.[21] Cole J R,Wang Q,Cardenas E,Fish J,Chai B,Farris R J,Kulam?Syed?Mohideen A S,McGarrell D M,Marsh T,Garrity G M,Tiedje J M.The
Ribosomal Database Project:improved alignments and new tools for rRNA analysis.Nucleic Acids Research,2009,37(Database issue ):
D141?D145.[22] Ludwig W,Strunk O,Westram R,Richter L,Meier H,Yadhukumar,Buchner A,Lai T,Steppi S,Jobb G,Forster W,Brettske I,Gerber S,Ginhart A W,Gross O,Grumann S,Hermann S,Jost R,Konig A,Liss T,Lussmann R,May M,Nonhoff B,Reichel B,Strehlow R,Stamatakis A,Stuckmann N,Vilbig A,Lenke M,Ludwig T,Bode A,Schleifer K H.ARB:a software environment for sequence data.Nucleic Acids Research,2004,32(4):1363?1371.[23] Schloss P D.Secondary structure improves OTU assignments of 16S rRNA gene sequences.The ISME Journal,2013,7(3):457?460.
[24] Letsch H O,Kuck P,Stocsits R R,Misof B.The impact of rRNA secondary structure consideration in alignment and tree reconstruction:simulated
data and a case study on the phylogeny of hexapods.Molecular Biology and Evolution,2010,27(11):2507?2521.[25] Pruesse E,Quast C,Knittel K,Fuchs B M,Ludwig W,Peplies J,Glockner F O.SILVA:a comprehensive online resource for quality checked
and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB.Nucleic Acids Research,2007,35(21):7188?7196.[26] DeSantis T Z,Hugenholtz P,Larsen N,Rojas M,Brodie E L,Keller K,Huber T,Dalevi D,Hu P,Andersen G L.Greengenes,a chimera?
checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.Applied and Environmental Microbiology,2006,72(7):5069?5072.[27] Lee Z M P,Bussema C,Schmidt T M.rrnDB:documenting the number of rRNA and tRNA genes in bacteria and archaea.Nucleic Acids
Research,2009,37(Database issue):D489?D493.[28] Woo P C Y,Teng J L L,Yeung J M Y,Tse H,Lau S K P,Yuen K Y.Automated identification of medically important bacteria by 16S rRNA gene
sequencing using a novel comprehensive database,16SpathDB.Journal of Clinical Microbiology,2011,49(5):1799?1809.[29] Griffen A L,Beall C J,Firestone N D,Gross E L,Difranco J M,Hardman J H,Vriesendorp B,Faust R A,Janies D A,Leys E J.CORE:a
phylogenetically?curated 16S rDNA database of the core oral microbiome.PloS One,2011,6(4):e19051.[30] Kim O S,Cho Y J,Lee K,Yoon S H,Kim M,Na H,Park S C,Jeon Y S,Lee J H,Yi H,Won S,Chun J.Introducing EzTaxon?e:a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2012,62(3):716?721.
[31] Loy A,Maixner F,Wagner M,Horn M.probeBase?an online resource for rRNA?targeted oligonucleotide probes:new features 2007.Nucleic Acids
Research,2007,35(S1):D800?D804.[32] Sogin M L,Morrison H G,Huber J A,Welch D M,Huse S M,Neal P R,Arrieta J M,Herndl G J.Microbial diversity in the deep sea and the
underexplored rare biosphere”.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(32):12115?12120.[33] Caporaso J G,Lauber C L,Walters W A,Berg?Lyons D,Lozupone C A,Turnbaugh P J,Fierer N,Knight R.Global patterns of 16S rRNA
diversity at a depth of millions of sequences per sample.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,
108(S1):4516?4522.[34] Brodie E L,DeSantis T Z,Parker J P M,Zubietta I X,Piceno Y M,Andersen G L.Urban aerosols harbor diverse and dynamic bacterial
populations.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(1):299?304.
[35] Hazen T C,Dubinsky E A,DeSantis T Z,Andersen G L,Piceno Y M,Singh N,Jansson J K,Probst A,Borglin S E,Fortney J L,Stringfellow W T,Bill M,Conrad M E,Tom L M,Chavarria K L,Alusi T R,Lamendella R,Joyner D C,Spier C,Baelum J,Auer M,Zemla M L,Chakraborty R,Sonnenthal E L,D′haeseleer P,Holman H Y,Osman S,Lu Z,Van Nostrand J D,Deng Y,Zhou J,Mason O U..Deep?sea oil plume enriches indigenous oil?degrading bacteria.Science,2010,330(6001):204?208.[36] Fierer N,Lauber C L,Zhou N,McDonald D,Costello E K,Knight R.Forensic identification using skin bacterial communities.Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America,2010,107(14):6477?6481.[37] Bouchet V,Huot H,Goldstein R.Molecular genetic basis of ribotyping.Clinical Microbiology Reviews,2008,21(2):262?273.
[38] Wang S Q,He J Z.Separation of fluorescence?labelled terminal restriction fragment DNA on a two?dimensional gel (T?RFs?2D)?an efficient
approach for microbial consortium characterization.Environmental Microbiology,2011,13(9):2565?2575.[39] Schütte U M,Abdo Z,Bent S J,Shyu C,Williams C J,Pierson J D,Forney L J.Advances in the use of terminal restriction fragment length polymorphism (T?RFLP)analysis of 16S rRNA genes to characterize microbial communities.Applied Microbiology and Biotechnology,2008,80(3):365?380.[40] Grimont F,Grimont P A.Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools.Annales de l′Institut Pasteur:
Microbiologie,1986,137B(2):165?175.
[41] Maragkoudakis P A,Nardi T,Bovo B,D′Andrea M,Howell K S,Giacomini A,Corich V.Biodiversity,dynamics and ecology of bacterial community during grape marc storage for the production of grappa.International Journal of Food Microbiology,2013,162(2):143?151.3872 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
4872 生 态 学 报 35卷 [42] Nocker A,Burr M,Camper A K.Genotypic microbial community profiling:a critical technical review.Microbial Ecology,2007,54(2):276?289.
[43] Needham D M,Chow C E,Cram J A,Sachdeva R,Parada A,Fuhrman J A.Short?term observations of marine bacterial and viral communities:
patterns,connections and resilience.The ISME Journal,2013,7(7):1274?1285.
[44] Zeng Y H,Koblizek M,Li Y X,Liu Y P,Feng F Y,Ji J D,Jian J C,Wu Z H.Long PCR?RFLP of16S?ITS?23S rRNA genes:a high?resolution
molecular tool for bacterial genotyping.Journal of Applied Microbiology,2013,114(2):433?447.
[45] Muyzer G,de Waal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction?amplified genes coding for16S rRNA.Applied and Environmental Microbiology,1993,59(3):695?700. [46] Chadalavada D M,Bevilacqua P C.Analyzing RNA and DNA folding using temperature gradient gel electrophoresis(TGGE)with application to in
vitro selections.Methods in Enzymology,2009,468:389?408.
[47] Kumari M,Sharma V L,Sodhi M,Mukesh M,Shouche Y,Sobti R C.PCR?SSCP and sequence analysis of three Odontotermes spp.(order:
isoptera;family:termitidae)on the basis of partial16SrRNA gene.Molecular and Cellular Biochemistry,2009,330(1/2):153?162. [48] Boite M C,Mauricio I L,Miles M A,Cupolillo E.New insights on taxonomy,phylogeny and population genetics of Leishmania(Viannia)parasites
based on multilocus sequence analysis.PLoS Neglected Tropical Diseases,2012,6(11):e1888.
[49] Richter M,Rosselló?Móra R.Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition.Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America,2009,106(45):19126?19131.
[50] Bertaux J,Gloger U,Schmid M,Hartmann A,Scheu S.Routine fluorescence in situ hybridization in soil.Journal of Microbiological Methods,
2007,69(3):451?460.
[51] Matturro B,Aulenta F,Majone M,Papini M P,Tandoi V,Rossetti S.Field distribution and activity of chlorinated solvents degrading bacteria by
combining CARD?FISH and real time PCR.New Biotechnology,2012,30(1):23?32.
[52] Watt M,Hugenholtz P,White R,Vinall K.Numbers and locations of native bacteria on field?grown wheat roots quantified by fluorescence in situ
hybridization(FISH).Environmental Microbiology,2006,8(5):871?884.
[53] Wagner M,Haider S.New trends in fluorescence in situ hybridization for identification and functional analyses of microbes.Current Opinion in
Biotechnology,2012,23(1):96?102.
[54] Okabe S,Oshiki M,Kamagata Y,Yamaguchi N,Toyofuku M,Yawata Y,Tashiro Y,Nomura N,Ohta H,Ohkuma M,Hiraishi A,Minamisawa
K.A great leap forward in microbial ecology.Microbes and Environments,2010,25(4):230?240.
[55] Kubota K.CARD?FISH for environmental microorganisms:technical advancement and future applications.Microbes and Environments,2013,28
(1):3?12.
[56] Behrens S,Losekann T,Pett?Ridge J,Weber P K,Ng W O,Stevenson B S,Hutcheon I D,Relman D A,Spormann A M.Linking microbial
phylogeny to metabolic activity at the single?cell level by using enhanced element labeling?catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization(EL?FISH)and NanoSIMS.Applied and Environmental Microbiology,2008,74(10):3143?3150.
[57] Zhang T,Fang H H.Applications of real?time polymerase chain reaction for quantification of microorganisms in environmental samples.Applied
Microbiology and Biotechnology,2006,70(3):281?289.
[58] Smith C J,Osborn A M.Advantages and limitations of quantitative PCR(Q?PCR)?based approaches in microbial ecology.FEMS Microbiology
Ecology,2009,67(1):6?20.
[59] Nolvak H,Truu M,Truu J.Evaluation of quantitative real?time PCR workflow modifications on16S rRNA and tetA gene quantification in
environmental samples.Science of the Total Environment,2012,426:351?358.
[60] Callbeck C M,Sherry A,Hubert C R,Gray N D,Voordouw G,Head I M.Improving PCR efficiency for accurate quantification of16S rRNA
genes.Journal of Microbiological Methods,2013,93(2):148?152.
[61] Zhang H,Parameswaran P,Badalamenti J,Rittmann B E,Krajmalnik?Brown R.Integrating high?throughput pyrosequencing and quantitative real?
time PCR to analyze complex microbial communities.Methods in Molecular Biology,2011,733:107?128.
[62] van den Bogert B,de Vos W M,Zoetendal E G,Kleerebezem M.Microarray analysis and barcoded pyrosequencing provide consistent microbial
profiles depending on the source of human intestinal samples.Applied and Environmental Microbiology,2011,77(6):2071?2080. [63] Paliy O,Kenche H,Abernathy F,Michail S.High?throughput quantitative analysis of the human intestinal microbiota with a phylogenetic
microarray.Applied and Environmental Microbiology,2009,75(11):3572?3579.
[64] Wu C H,Sercu B,van de Werfhorst L C,Wong J,DeSantis T Z,Brodie E L,Hazen T C,Holden P A,Andersen G L.Characterization of coastal
urban watershed bacterial communities leads to alternative community?based indicators.PloS One,2010,5(6):e11285.
[65] DeAngelis K M,Allgaier M,Chavarria Y,Fortney J L,Hugenholtz P,Simmons B,Sublette K,Silver W L,Hazen T C.Characterization of
trapped lignin?degrading microbes in tropical forest soil.PloS One,2011,6(4):e19306.
[66] Mendes R,Kruijt M,de Bruijn I,Dekkers E,van der Voort M,Schneider J H,Piceno Y M,DeSantis T Z,Andersen G L,Bakker P A,
Raaijmakers J M.Deciphering the rhizosphere microbiome for disease?suppressive bacteria.Science,2011,332(6033):1097?1100. [67] He Z L,Deng Y,van Nostrand J D,Tu Q C,Xu M Y,Hemme C L,Li X Y,Wu L Y,Gentry T J,Yin Y F,Liebich J,Hazen T C,Zhou J Z.
GeoChip3.0as a high?throughput tool for analyzing microbial community composition,structure and functional activity.The ISME Journal,2010,4
(9):1167?1179.[68] He Z L,van Nostrand J D,Zhou J Z.Applications of functional gene microarrays for profiling microbial communities.Current Opinion in
Biotechnology,2012,23(3):460?466.[69] Wang F,Zhou H,Meng J,Peng X,Jiang L,Sun P,Zhang C,van Nostrand J D,Deng Y,He Z,Wu L,Zhou J,Xiao X.GeoChip?based
analysis of metabolic diversity of microbial communities at the Juan de Fuca Ridge hydrothermal vent.Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America,2009,106(12):4840?4845.[70] Gentleman R C,Carey V J,Bates D M,Bolstad B,Dettling M,Dudoit S,Ellis B,Gautier L,Ge Y,Gentry J,Hornik K,Hothorn T,Huber W,Iacus S,Irizarry R,Leisch F,Li C,Maechler M,Rossini A J,Sawitzki G,Smith C,Smyth G,Tierney L,Yang J Y,Zhang J.Bioconductor:open software development for computational biology and bioinformatics.Genome Biology,2004,5(10):R80?R80.[71] Rajilic?Stojanovic M,Heilig H G,Molenaar D,Kajander K,Surakka A,Smidt H,de Vos W M.Development and application of the human intestinal tract chip,a phylogenetic microarray:analysis of universally conserved phylotypes in the abundant microbiota of young and elderly adults.Environmental Microbiology,2009,11(7):1736?1751.[72] Crielaard W,Zaura E,Schuller A A,Huse S M,Montijn R C,Keijser B J.Exploring the oral microbiota of children at various developmental
stages of their dentition in the relation to their oral health.BMC Medical Genomics,2011,4(1):22?22.[73] Rigsbee L,Agans R,Foy B D,Paliy O.Optimizing the analysis of human intestinal microbiota with phylogenetic microarray.FEMS Microbiology
Ecology,2011,75(2):332?342.[74] Ozsolak F.Third?generation sequencing techniques and applications to drug discovery.Expert Opinion on Drug Discovery,2012,7(3):231?243.[75] Wu D Y,Hartman A,Ward N,Eisen J A.An automated phylogenetic tree?based small subunit rRNA taxonomy and alignment pipeline (STAP).
PloS One,2008,3(7):e2566.[76] Eisen J A.Environmental shotgun sequencing:its potential and challenges for studying the hidden world of microbes.PLoS Biology,2007,5
(3):e82.[77] Shokralla S,Spall J L,Gibson J F,Hajibabaei M.Next?generation sequencing technologies for environmental DNA research.Molecular Ecology,
2012,21(8):1794?1805.[78] Lynch M D,Bartram A K,Neufeld J D.Targeted recovery of novel phylogenetic diversity from next?generation sequence data.The ISME Journal,
2012,6(11):2067?2077.[79] Kunin V,Engelbrektson A,Ochman H,Hugenholtz P.Wrinkles in the rare biosphere:pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of
diversity estimates.Environmental Microbiology,2010,12(1):118?123.[80] Scholz M B,Lo C C,Chain P S.Next generation sequencing and bioinformatic bottlenecks:the current state of metagenomic data analysis.Current
Opinion in Biotechnology,2012,23(1):9?15.[81] Stach J E,Bathe S,Clapp J P,Burns R G.PCR?SSCP comparison of 16S rDNA sequence diversity in soil DNA obtained using different isolation
and purification methods.FEMS Microbiology Ecology,2001,36(2/3):139?151.[82] Zhou J Z,Bruns M A,Tiedje J M.DNA recovery from soils of diverse composition.Applied and Environmental Microbiology,1996,62(2):
316?322.[83] Canto?CanchéB,Tzec?SimáM,Vázquez?Loría J I,Espadas?Alvarez H,Chí?Manzanero B H,Rojas?Herrera R,Valdez?Ojeda R,Alzate?Gaviria L.Simple and inexpensive DNA extraction protocol for studying the bacterial composition of sludges used in microbial fuel cells.Genetics and Molecular Research,2013,12(1):282?292.[84] Kuczynski J,Lauber C L,Walters W A,Parfrey L W,Clemente J C,Gevers D,Knight R.Experimental and analytical tools for studying the
human microbiome.Nature Reviews:Genetics,2012,13(1):47?58.
[85] Flores G E,Henley J B,Fierer N.A direct PCR approach to accelerate analyses of human?associated microbial communities.PloS One,2012,7
(9):e44563.[86] Yankson K K,Steck T R.Strategy for extracting DNA from clay soil and detecting a specific target sequence via selective enrichment and real?time
(quantitative)PCR amplification.Applied and Environmental Microbiology,2009,75(18):6017?6021.[87] He S,Wurtzel O,Singh K,Froula J L,Yilmaz S,Tringe S G,Wang Z,Chen F,Lindquist E A,Sorek R,Hugenholtz P.Validation of two
ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.Nature Methods,2010,7(10):807?812.[88] Zoetendal E G,Booijink C C,Klaassens E S,Heilig H G,Kleerebezem M,Smidt H,de Vos W M.Isolation of RNA from bacterial samples of the
human gastrointestinal tract.Nature Protocols,2006,1(2):954?959.[89] Engelbrektson A,Kunin V,Wrighton K C,Zvenigorodsky N,Chen F,Ochman H,Hugenholtz P.Experimental factors affecting PCR?based
estimates of microbial species richness and evenness.The ISME Journal,2010,4(5):642?647.[90] Cai L,Ye L,Tong A H,Lok S,Zhang T.Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets.PloS One,
2013,8(1):e53649.[91] Bergmann G T,Bates S T,Eilers K G,Lauber C L,Caporaso J G,Walters W A,Knight R,Fierer N.The under?recognized dominance of Verrucomicrobia in soil bacterial communities.Soil Biology and Biochemistry,2011,43(7):1450?1455.5872 9期
刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
6872 生 态 学 报 35卷 [92] Hong S,Bunge J,Leslin C,Jeon S,Epstein S S.Polymerase chain reaction primers miss half of rRNA microbial diversity.The ISME Journal,
2009,3(12):1365?1373.
[93] Zakrzewski M,Goesmann A,Jaenicke S,Jünemann S,Eikmeyer F,Szczepanowski R,Al?Soud W A,S?rensen S,Pühler A,Schlüter A.
Profiling of the metabolically active community from a production?scale biogas plant by means of high?throughput metatranscriptome sequencing.
Journal of Biotechnology,2012,158(4):248?258.
[94] Tamaki H,Wright C L,Li X,Lin Q,Hwang C,Wang S,Thimmapuram J,Kamagata Y,Liu W T.Analysis of16S rRNA amplicon sequencing
options on the Roche/454next?generation titanium sequencing platform.PloS One,2011,6(9):e25263.
[95] Wang Y,Qian P Y.Conservative fragments in bacterial16S rRNA genes and primer design for16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic
studies.PloS One,2009,4(10):e7401.
[96] Klindworth A,Pruesse E,Schweer T,Peplies J,Quast C,Horn M,Glockner F O.Evaluation of general16S ribosomal RNA gene PCR primers for
classical and next?generation sequencing?based diversity studies.Nucleic Acids Research,2013,41(1):e1.
[97] Liu Z,Lozupone C,Hamady M,Bushman F D,Knight R.Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.Nucleic
Acids Research,2007,35(18):e120.
[98] Nossa C W,Oberdorf W E,Yang L,Aas J A,Paster B J,Desantis T Z,Brodie E L,Malamud D,Poles M A,Pei Z.Design of16S rRNA gene
primers for454pyrosequencing of the human foregut microbiome.World Journal of Gastroenterology,2010,16(33):4135?4144. [99] Mao Y,Yannarell A C,Mackie R I.Changes in N?transforming archaea and bacteria in soil during the establishment of bioenergy crops.PloS One,
2011,6(9):e24750.
[100] Frank K L,Rogers D R,Olins H C,Vidoudez C,Girguis P R.Characterizing the distribution and rates of microbial sulfate reduction at Middle Valley hydrothermal vents.The ISME Journal,2013,7(7):1391?1401.
[101] Teske A,Sorensen K B.Uncultured archaea in deep marine subsurface sediments:have we caught them all?The ISME Journal,2008,2(1): 3?18.
[102] Pinto A J,Raskin L.PCR biases distort bacterial and archaeal community structure in pyrosequencing datasets.PloS One,2012,7(8):e43093. [103] Caporaso J G,Lauber C L,Walters W A,Berg?Lyons D,Huntley J,Fierer N,Owens S M,Betley J,Fraser L,Bauer M.Ultra?high?throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.The ISME Journal,2012,6(8):1621?1624.
[104] Wu J Y,Jiang X T,Jiang Y X,Lu S Y,Zou F,Zhou H W.Effects of polymerase,template dilution and cycle number on PCR based16S rRNA diversity analysis using the deep sequencing method.BMC Microbiology,2010,10(1):255?255.
[105] Michu E,MrácˇkováM,Vyskot B,?l?uvováJ.Reduction of heteroduplex formation in PCR amplification.Biologia Plantarum,2010,54(1):173?176.
[106] Brockman W,Alvarez P,Young S,Garber M,Giannoukos G,Lee W L,Russ C,Lander E S,Nusbaum C,Jaffe D B.Quality scores and SNP detection in sequencing?by?synthesis systems.Genome Research,2008,18(5):763?770.
[107] Gloor G B,Hummelen R,Macklaim J M,Dickson R J,Fernandes A D,MacPhee R,Reid G.Microbiome profiling by illumina sequencing of combinatorial sequence?tagged PCR products.PloS One,2010,5(10):e15406.
[108] Bartram A K,Lynch M D,Stearns J C,Moreno?Hagelsieb G,Neufeld J D.Generation of multimillion?sequence16S rRNA gene libraries from complex microbial communities by assembling paired?end illumina reads.Applied and Environmental Microbiology,2011,77(11):3846?3852. [109] Miller C S,Baker B J,Thomas B C,Singer S W,Banfield J F.EMIRGE:reconstruction of full?length ribosomal genes from microbial community short read sequencing data.Genome Biology,2011,12(5):R44.
[110] Huse S M,Welch D M,Morrison H G,Sogin M L.Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.Environmental Microbiology,2010,12(7):1889?1898.
[111] Pruesse E,Peplies J,Gl?ckner F O.SINA:Accurate high?throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes.Bioinformatics, 2012,28(14):1823?1829.
[112] Edgar R C.MUSCLE:a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.BMC Bioinformatics,2004,5(1): 113?113.
[113] Caporaso J G,Bittinger K,Bushman F D,DeSantis T Z,Andersen G L,Knight R.PyNAST:a flexible tool for aligning sequences to a template alignment.Bioinformatics,2010,26(2):266?267.
[114] Reeder J,Knight R.Rapidly denoising pyrosequencing amplicon reads by exploiting rank?abundance distributions.Nature Methods,2010,7(9): 668?669.
[115] Quince C,Lanzen A,Davenport R J,Turnbaugh P J.Removing noise from pyrosequenced amplicons.BMC Bioinformatics,2011,12(1):38?38. [116] Kuczynski J,Stombaugh J,Walters W A,Gonzalez A,Caporaso J G,Knight https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,ing QIIME to analyze16S rRNA gene sequences from microbial communities.Curr Protoc Bioinformatics,2011,Chapter10:Unit1017,doi:10.1002/0471250953.bi1007s36.. [117] Schloss P D,Westcott S L,Ryabin T,Hall J R,Hartmann M,Hollister E B,Lesniewski R A,Oakley B B,Parks D H,Robinson C J,Sahl J W,Stres B,Thallinger G G,Van Horn D J,Weber C F.Introducing mothur:open?source,platform?independent,community?supported software for describing and comparing microbial communities.Applied and Environmental Microbiology,2009,75(23):7537?7541.
[118] Huber T,Faulkner G,Hugenholtz P.Bellerophon:a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments.Bioinformatics,
2004,20(14):2317?2319.[119] Haas B J,Gevers D,Earl A M,Feldgarden M,Ward D V,Giannoukos G,Ciulla D,Tabbaa D,Highlander S K,Sodergren E,Methe B,DeSantis T Z,Petrosino J F,Knight R,Birren B W.Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454?pyrosequenced PCR amplicons.Genome Research,2011,21(3):494?504.[120] Edgar R C,Haas B J,Clemente J C,Quince C,Knight R.UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection.Bioinformatics,2011,
27(16):2194?2200.[121] Sun Y,Cai Y,Liu L,Yu F,Farrell M L,McKendree W,Farmerie W.ESPRIT:estimating species richness using large collections of 16S rRNA
pyrosequences.Nucleic Acids Research,2009,37(10):e76.[122] Edgar R C.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.Nucleic Acids Research,2004,32(5):1792?1797.
[123] Barriuso J,Valverde J R,Mellado R P.Estimation of bacterial diversity using next generation sequencing of 16S rDNA:a comparison of different
workflows.BMC Bioinformatics,2011,12:473?473.[124] Edgar R C.UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.Nature Methods,2013,10(10):996?998.
[125] Mizrahi?Man O,Davenport E R,Gilad Y.Taxonomic classification of bacterial 16S rRNA genes using short sequencing reads:evaluation of
effective study designs.PloS One,2013,8(1):e53608.[126] Hao X,Jiang R,Chen T.Clustering 16S rRNA for OTU prediction:a method of unsupervised Bayesian clustering.Bioinformatics,2011,27(5):
611?618.[127] Liu Z,DeSantis T Z,Andersen G L,Knight R.Accurate taxonomy assignments from 16S rRNA sequences produced by highly parallel
pyrosequencers.Nucleic Acids Research,2008,36(18):e120.[128] Huse S M,Dethlefsen L,Huber J A,Mark Welch D,Relman D A,Sogin M L.Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA
hypervariable tag sequencing.PLoS Genetics,2008,4(11):e1000255.[129] Ghosh T S,Gajjalla P,Mohammed M H,Mande S S.C16S?a Hidden Markov Model based algorithm for taxonomic classification of 16S rRNA
gene sequences.Genomics,2012,99(4):195?201.[130] Konstantinidis K T,Ramette A,Tiedje J M.The bacterial species definition in the genomic era.Philosophical Transactions of the Royal Society B:
Biological Sciences,2006,361(1475):1929?1940.[131] Goris J,Konstantinidis K T,Klappenbach J A,Coenye T,Vandamme P,Tiedje J M.DNA?DNA hybridization values and their relationship to
whole?genome sequence similarities.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2007,57(1):81?91.[132] Tindall B J,Rosselló?Móra R,Busse H J,Ludwig W,K?mpfer P.Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60(1):249?266.[133] Yarza P,Ludwig W,Euzeby J,Amann R,Schleifer K H,Glockner F O,Rossello?Mora R.Update of the All?Species Living Tree Project based
on 16S and 23S rRNA sequence analyses.Systematic and Applied Microbiology,2010,33(6):291?299.[134] Hall B https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,parison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences.Molecular Biology and Evolution,
2005,22(3):792?802.[135] Hamady M,Lozupone C,Knight R.Fast UniFrac:facilitating high?throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of
pyrosequencing and PhyloChip data.The ISME Journal,2010,4(1):17?27.[136] Page R D.Space,time,form:viewing the Tree of Life.Trends in Ecology &Evolution,2012,27(2):113?120.
[137] Mori H,Maruyama F,Kurokawa K.VITCOMIC:visualization tool for taxonomic compositions of microbial communities based on 16S rRNA gene sequences.BMC Bioinformatics,2010,11(1):332?332.
[138] Flores G E,Henley J B,Fierer N.A direct PCR approach to accelerate analyses of human?associated microbial communities.PloS One,2012,7
(9):e44563?e44563.[139] Kembel S W,Cowan P D,Helmus M R,Cornwell W K,Morlon H,Ackerly D D,Blomberg S P,Webb C O.Picante:R tools for integrating
phylogenies and ecology.Bioinformatics,2010,26(11):1463?1464.
[140] Lozupone C A,Knight R.Species divergence and the measurement of microbial diversity.FEMS Microbiology Reviews,2008,32(4):557?578.[141] Ramette A.Multivariate analyses in microbial ecology.FEMS Microbiology Ecology,2007,62(2):142?160.
[142] Lindstrom E S,Kamst?van Agterveld M P,Zwart G.Distribution of typical freshwater bacterial groups is associated with pH,temperature,and lake water retention time.Applied and Environmental Microbiology,2005,71(12):8201?8206.
[143] Kuczynski J,Liu Z,Lozupone C,McDonald D,Fierer N,Knight R.Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.Nature Methods,2010,7(10):813?819.
[144] Bryant J A,Stewart F J,Eppley J M,DeLong E F.Microbial community phylogenetic and trait diversity declines with depth in a marine oxygen
minimum zone.Ecology,2012,93(7):1659?1673.[145] Bryant J A,Lamanna C,Morlon H,Kerkhoff A J,Enquist B J,Green J L.Microbes on mountainsides:contrasting elevational patterns of bacterial and plant diversity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(S1):11505?11511.7872 9期 刘驰 等:16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用
8872 生 态 学 报 35卷 [146] Lozupone C,Hamady M,Knight R.UniFrac?an online tool for comparing microbial community diversity in a phylogenetic context.BMC
Bioinformatics,2006,7(1):371?371.
[147] Lozupone C A,Hamady M,Kelley S T,Knight R.Quantitative and qualitative茁diversity measures lead to different insights into factors that structure microbial communities.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(5):1576?1585.
[148] Chang Q,Luan Y,Sun F.Variance adjusted weighted UniFrac:a powerful beta diversity measure for comparing communities based on phylogeny.
BMC Bioinformatics,2011,12:118?118.
[149] Rosenberg M S,Anderson C D.PASSaGE:pattern analysis,spatial statistics and geographic exegesis.Version2.Methods in Ecology and Evolution,2011,2(3):229?232.
[150] Schloss P D,Handelsman J.Introducing SONS,a tool for operational taxonomic unit?based comparisons of microbial community memberships and structures.Applied and Environmental Microbiology,2006,72(10):6773?6779.
[151] Schloss P D,Handelsman J.Introducing TreeClimber,a test to compare microbial community structures.Applied and Environmental Microbiology,2006,72(4):2379?2384.
[152] Deng Y,Jiang Y H,Yang Y,He Z,Luo F,Zhou J.Molecular ecological network analyses.BMC Bioinformatics,2012,13(1):113?113. [153] Larsen P E,Field D,Gilbert J A.Predicting bacterial community assemblages using an artificial neural network approach.Nature Methods,2012, 9(6):621?625.
[154] Pagaling E,Strathdee F,Spears B M,Cates M E,Allen R J,Free https://www.doczj.com/doc/be4391491.html,munity history affects the predictability of microbial ecosystem development.The ISME Journal,2014,8(1):19?30.
[155] Langille M G,Zaneveld J,Caporaso J G,McDonald D,Knights D,Reyes J A,Clemente J C,Burkepile D E,Thurber R L V,Knight R.
Predictive functional profiling of microbial communities using16S rRNA marker gene sequences.Nature Biotechnology,2013,31(9):814?821. [156] Human Microbiome Project Consortium.Structure,function and diversity of the healthy human microbiome.Nature,2012,486(7402):207?214. [157] Gilbert J A,Meyer F,Jansson J,Gordon J,Pace N,Tiedje J,Ley R,Fierer N,Field D,Kyrpides N,Glockner F O,Klenk H P,Wommack K E,Glass E,Docherty K,Gallery R,Stevens R,Knight R.The Earth Microbiome Project:Meeting report of the"1EMP meeting on sample selection and acquisition"at Argonne National Laboratory October62010.Standards in Genomic Sciences,2010,3(3):249?253. [158] G?tzenberger L,de Bello F,Br?then K A,Davison J,Dubuis A,Guisan A,Lep?J,Lindborg R,Moora M,P?rtel M,Pellissier L,Pottier J, Vittoz P,Zobel K,Zobel M.Ecological assembly rules in plant communities?approaches,patterns and prospects.Biological Reviews,2012,87
(1):111?127.
第九章微生物生态学习题 一、名词解释 1．硝化作用 2．菌根 3．活性污泥（activated sludge）： 4．反硝化作用 5．硫化作用 6．氨化作用 7．共生 8．微生物生态学 9．根际微生物： 10．根圈效应： 11．根土比： 12．氨化作用： 13．微生态制剂（microecologics）： 14．正常菌群（normal microflora）： 15．条件致病菌（oppotunist pathogen）： 16．拮抗（antagonism）： 17．寄生（parasitism）： 18．富营养化9eutrophication）： 19．BOD（biochemical oxygen demand）： 20．COD（chemical oxygen demand）： 21．TOD： 22．DO： 23．产甲烷细菌（methanogens） 二、填空题 1、从，，，生境中可以分离到嗜热微生物；从，和生境中可分离到嗜盐微生物。 2、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：、、。 3、微生物种群相互作用的基本类型包括：，，，、、和。 4、嗜热细菌耐高温的使DNA体外扩增技术得到突破，为技术的广泛应用提供基础。 5、嗜生物推动的氮循环实际上是氮化合物的氧化还原反应，其循环过程包括，
，和。 6、按耐热能力的不同，嗜热微生物可被分成5个不同类型：，， ，和。 7、有机污染物生物降解过程中经历的主要反应包括，， 和。 8、评价有机化合物生物降解性的基本试验方法是和。 9、污水处理按程度可分为，和。 10、汞的微生物转化主要包括3个方面，和。 三、选择题（4个答案选1） 1、总大肠菌群中不包括（）。 A、克雷伯氏菌 B、肠杆菌 C、埃希氏菌 D、芽孢杆菌 2、下列有机物中最难被微生物降解的是（）。 A、纤维素 B、木质素 C、半纤维素 D、淀粉 3、同化硝酸盐还原的酶可被下列哪种化合物抑制？（） A、氨 B、氧 C、N2 D、N2O 4、异化硝酸盐还原的酶可被下列哪种化合物抑制？（） A、氨 B、氧 C、N2 C、N2O 5、活性污泥法处理污水的过程最类似于下面哪种微生物培养方式？（） A、恒浊连续培养 B、恒化连续培养 C、恒浊分批培养 D、恒化分批培养 6、和豆科植物共生固氮的微生物是（）。 A、假单胞菌 B、根瘤菌 C、蓝细菌 D、自生固氮菌 7、许多霉菌在农副产品上生长时易于产生霉菌毒素，下列中哪些条件最适于产生霉菌毒素？（） A、高温高湿 B、高温 C、蓝细菌 D、自生固氮菌 8、适用于生物冶金的微生物类群主要是（）。 A、嗜热微生物 B、嗜冷微生物 C、嗜酸微生物 D、嗜压微生物 9、超嗜热细菌主要是（）。 A、古生菌 B、真细菌 C、真菌 D、霉菌 10、酸矿水的形成是微生物对某些金属和非金属元素转化的结合，下列哪种循环与酸矿水形成有关？（） A、S循环 B、N循环 C、磷循环 D、硅循环
课程论文 城市景观生态学的特征及规划方法的应用 课程名称景观生态学 姓名葛婧 学院草叶与环境科学学院 学号320152120 一级学科生态学 学科方向生态科学 指导教师周建勤 论文评分
摘要：城市景观生态学是景观生态学的研究领域之一,主要研究城市的景观生忘过程与空间格局、城市生态环境及其与各景观要素之间的相互联系、景观生态规划与设计等内容。现阶段，我国城市建设中景观生态学的应用还不够成熟，需要进一步的研究，推动其应用与发展，促进我国城市景观生态建设的进步与完善。 关键词：景观生态学城市景观生态学规划方法 景观生态学是地理学与生态学之间的交叉学科。它是以景观为对象，通过能量流、物质流、信息流和物种流在地球表层的交换，研究景观的空间结构、内部功能及各部分之间的相互关系。简言之，景观生态学就是表示支配一个区域不同地域单元自然生物综合体的相关分析。现已广泛应用于自然资源开发与利用、生态系统管理、自然保护区的规划与管理、生物多样性保护、城乡土地利用规划、城市景观建筑规划设计、生态系统恢复与重建等领域。景观生态学是研究景观单元的类型组成、空间格局及其与生态学过程相互作用的综合性学科。 城市景观生态学是景观生态学的重要研究领域，它是利用景观生态学的原理和方法研究城市(以人为中心)区域的结构、功能、动态过程和变化效应，以利于城市化过程中带来的一些现代化生态环境问题的解决，它不仅研究城市景观和城市生态环境，而且还要研究城市景观和城市生态环境各要素之间的相互联系。在城市建设和发展中，涉及的部门和学科较多，如城市规划、城市建筑、城市资源开发、园林和自然景观、经济发展、生态环境保护、历史文物保护和开发、交通道路等，而城市景观生态学是以上学科的集大成者，也可以说各学科发展到一定程度以后，由于本学科力量不能解决问题，必然要走向城市景观生态学的一条必由之路[1]。 1 城市景观生态学 城市景观生态学隶属于城市生态学的研究范围，是社会生态系统和自然生态系统的交叉。主要涉及景观建筑学、美学、园艺学、植物学、环境科学、生态学等多种学科。目前研究的中心目的主要是协调“人一地”矛盾，试图将自然组分重新引入城市。对改变城市生态环境、维持生态平衡，实现城市与自然共存的战略目标具有重大而深远的意义。但在城市景观生态学方面的研究，前人主要从区域整体的角度，对其结构模式、与外界相互关系等方面进行过探讨，而对其内部
第1章绪论 1.什么是微生物生态学？ 微生物生态学（Microbial Ecology）是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。 2.微生物生态学研究意义？ ①发现新的、在工农业、食品、医药和环境保护方面有重要用途的微生物菌株； ②开发和利用自然界中的微生物资源，保护好微生物基因资源； ③为提高生产效率、保护人类健康和保护生态平衡发挥微生物的最佳作用。 开发利用保护微生物资源，保护环境维持环境生态平衡 第2章微生物生态学的基本原理 1.生境：是指发现有生物的物理区域。这一区域的物理化学特征可以影响在这一区域中生活的微生物生长、代谢活力、生物与生物之间的相互作用和微生物的生存。 2.生态位：生态位不仅指生物生长的空间范围，而且包括生物在这一生境内的活动、它们的功能作用及其与其他生物的相互作用。 3.土著微生物：指在一个给定的生境中那些能生存、生长和进行活跃代谢的微生物，并且这些微生物能与来自其他群落的微生物进行有效的竞争。 4.外来微生物：指来自于其他生态系统的微生物，所以这些微生物不能在这一生境中长期生活下去。 5.微生物区系：在一块土壤碎片内或植物根的表面有可能有很多环境因素不同的微环境。而每一微环境只适宜于某种或某些微生物的生长、繁殖，而不适合其他种微生物的生长，从而形成复杂的微生物区系（microflora）。 6.群落演替：是指在某一特定环境内，生物群落随着时间的推移顺序出现或被相继取代，最终形成比较稳定的群落结构的发展过程。 第3章自然环境中的微生物 1.生理群：指按生理特性将微生物划分为不同的类群。 2.优势种：在一定条件下或在一个生理群中常只有少数种类占优势，即在最高稀释度平皿中出现较多菌落数的菌种，该菌种称优势种。 3.水体富营养化：当水体中N、P营养元素的含量大量增加，远远超出正常指标，结果导致原有生态系统破坏，藻类或某些细菌数量猛增，其他生物种类减少，水质变坏的现象。 4.为什么说土壤是适合微生物生长的环境？
Microbial Ecology 绪论 1. 名词解释： 微生物生态学:是研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门科学。 微生态学：是生态学的一个层次，是研究正常微生物在细胞或分子水平上相关关系的科学环境、自然环境+生物环境 生境、指生物的个体、种群或群落生活地域的具体环境。生物＋非生物 栖息地、生物生活或居住的范围的物理环境。如林地生境中的不同树冠层、树干 生态位、一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系与作用。 基础生态位、一个物种能够占据的生态位空间，由物种的变异和适应能力决定，而非其地理因素。基本生态位是实验室条件下的生态位，里面不存在捕食者和竞争。 实际生态位、自然界中真实存在的生态位。 物种流是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。 2.微生物生态学的研究意义有哪些？ ①发现新的在工农业（如固氮）、食品（如发酵）、医药（如抗生素）和环境保护（如生物修复）方面有重要用途的微生物菌株（包括极端环境中微生物资源的发掘）； ②微生物在地球物质化学循环中具有重要作用； ③开发和利用自然界中的微生物资源，保护好微生物基因资源； ④控制有害微生物，利用微生物净化环境，保护环境，维持环境生态平衡； ⑤保护人类健康和保护生态平衡发挥微生物的最佳作用。
3.微生物生态学主要研究内容有哪些？ ①正常自然环境中的微生物种类、分布及变化规律； ②极端自然环境中的微生物； ③微生物之间、微生物与动植物相互关系； ④微生物在净化污染环境中的作用； ⑤现代分子微生物生态学的研究方法。 4.生态系统的功能有哪些？ 物种流能量流食物链营养级信息流 5.什么是微生物生态系统？其特点是什么？ 是指各种环境因子如物理、化学及生物因子对微生物区系（即自然群体）的作用和微生物区系对外界环境的反作用。 特点：微环境稳定性适应性 7.简述物种流的含义及其特点。 是指物种的种群在生态系统内或系统之间时空变化的状态。不同生态系统间的交流和联系。主要有三层含义： 生物有机体与环境之间相互作用所产生的时间、空间变化的过程； 物种种群在生态系统内或系统之间格局和数量的动态，反映了物种关系的状态，如寄生、捕食、共生等； 生物群落中物种组成、配置、营养结构变化，外来种和本地种的相互作用，生态系统对物种增加和空缺的反应等。 8.简述物种流对生态系统的影响。 物种的增加和去除改变原有生态系统内的成员和数量；入侵物种通过资源利用改变生态过程；
景观生态学的发展及前景 作者： 指导老师： 专业： 年月日
摘要 景观生态学是生态学中一门年轻的分支学科，它的理论与方法和传统生态学有着本质的区别，它注重人类活动对景观格局与过程的影响。最近几年，园林生态学受到人们的关注。它是一项全新的生态学内容。它不但分析体系本身的发展和变化特征，分析了今后的发展方向。景观生态学为综合解决资源与环境问题提供了新的理论和方法，因而近年来受到高度重视。从景现生态学的理论框架、一般原理、研究方法和实际应用四个方面进行论述。景观生态学研究的焦点问题是景观结构、景观动态与景观功能。综述了景观格局、景观动态、景观异质性、景观尺度与景观功能的研究现状，并探讨了景观生态学理论的最新应用领域，展望了景观生态学的研究。 关键词：景观生态学；理论框架；应用；发展趋势
Abstract Landscape ecology is a young discipline, its theory and method and the traditional ecology are essentially different, it pays attention to the impact of human activities on landscape pattern and process. In recent years, landscape ecology concern. It is a new ecology. It not only analysis of the development and changes of the system itself, analyzes the development direction in the future. Landscape ecology provides a new theory and method for solving the problems of environment and resources, in recent years, attention. From the four aspects of theory, landscape ecology principles, research methods and practical application. Are a research focus in landscape ecology landscape structure, landscape and landscape function. Study on the current situation of landscape pattern, landscape dynamics, landscape diversity, landscape scale and landscape function were reviewed, and discusses the theory of landscape ecology in the new application field, the prospect of the landscape ecology. Keywords: landscape ecology; theory; application; development trend
精编高一下册《基因工程及其应用》知识点 梳理：生物篇 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的剪刀：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的针线：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的运载工具：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。
c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。 5.转基因生物和转基因食品的安全性
第八章习题答案 一.名词解释 1.硝化作用：氨态氮经硝化细菌的氧化,转化为硝酸态氮的过程. 2土壤微生物区系：指在某一特定环境和生态条件下的土壤微生物所存在的微生物种类,数量以及参与物质循环的代谢物质强度. 3 土著性微生物：指土壤中那些对新鲜有机物质不很敏感的微生物,如革兰氏阳性球菌,色杆菌,芽孢杆菌,节杆菌,分支杆菌,放线菌,青霉,曲霉和从霉,他们常年维持在某一数量水平上,即使由于有机物质的加入或温度,湿度等变化而引起数量变化,其数量变化也很少. 4发酵性微生物：指土壤中那些对新鲜有机物质很敏感的微生物,在有新鲜动植物残体存在是可爆发性的旺盛发育,而在新鲜残体消失后又很快消退的微生物,包括各类革兰氏阳性阴性无芽孢杆菌,酵母菌,芽孢杆菌,链霉菌和根霉等. 5 生物降解：是指环境微生物被生物主要是微生物分解为小分子物质甚至是彻底分解为CO2和水的过程. 6 BOD5 ：表示在20℃下，1L污水中的有机物进行微生物氧化时5天所消耗溶解氧的毫克数。 7 COD：化学需氧量，是指采用强氧化剂将1升污水中的有机物完全氧化后所消耗氧的毫克数。 8根土比：即根际微生物数量与非根际土壤微生物数量的比值来表示。 9根圈：也称根际，指生长中的植物根系直接影响的土壤范围。 二．填空 1．微生物之间的相互关系有:偏利共栖,互利共栖,共生关系,竞争关系,拮抗关系,寄生关系和捕食等. 2．根际微生物对植物的有益影响有::改善对植物的营养源,产生生长调节物调节植物生长,分泌抗生素类物质抑制植物潜在病原菌生长和增加矿物质的溶解性. 3.沼气发酵的三个阶段分别由厌氧或兼性厌氧的水解性细菌或发酵性细菌、产酸产乙酸的细菌群、严格厌氧的产甲烷菌群三种菌群的作用。 4.我国生活饮用水水质标准规定1L水中大肠杆菌群数不超过3个 5．细胞型微生物包括的主要类群为细菌，放线菌，霉菌，酵母菌。 6一种种群因另一种种群的存在或生命活动而得利，而后者没有从前者受益或受害，此两种群之间的关系为___偏利作用___。 三. 判断 1. 在制作泡菜和青贮饲料过程中存在有拮抗关系。（正确） 2. 反硝化作用只有在无氧条件下进行。（正确） 3有机物质是产生沼气的物质基础，产甲烷细菌可以利用大分子有机物质做为碳源。（错误）4协同共栖的两个物种生活在一起时彼此受益，互相获得利，是一种互生关系。（正确） 四. 单选题 1. 亚硝化细菌和硝化细菌的关系可称为：（A） A 协同共栖 B偏利共栖 C 共生D中立 2.下述那个过程需要亚硝化细菌和硝化细菌：（D） A 脱氮作用 B 氨化作用 C固氮作用 D 硝化作用 3. 下述那种方法处理污水可产生甲烷：（C） A 曝气池 B 活性污泥 C 厌氧消化 D 生物转盘法 4.缺钼可能影响那个过程：（D）
景观生态学空间格局分析 方法综述 Prepared on 22 November 2020
景观生态学课程论文 景观生态学景观格局分析方法综述 目录 摘要
摘要 景观格局是景观生态学的核心问题，其目标是通过确定景观格局来分析生态过程。本文主要对景观生态学的格局分析方法进行综述，分别从景观格局分析概述、景观空间格局指数结合景观分析的统计学方法进行阐述，并通过山林地区的景观格局分析方法——以宁远县为例；干旱区绿洲城市景观格局分析方法——以石河子市为例；城市湿地公园景观格局分析——以白鹭湾湿地公园为例，对景观格局分析方法在不同类型的景观中的运用进行详细阐述。 关键词：景观生态学；GIS；景观格局；特征指数；景观类型 引言 景观生态学是研究景观单元的类型组成、空间配置及其与生态学过程相互 作用的综合性学科[1]。它以生态系统的空间关系为研究重点关注尺度的重要性 与时空的异质性。随着景观生态学的逐步发展其研究范围和内容都进一步扩大 突破了原先只是从类型或区域角度对自然综合体进行研究将地理过程与生态过 程也列为研究重心并且从单纯的地理过程研究发展到人地相互作用过程的研 究。在研究理论和方法方面等级理论、分形理论、渗透理论、尺度观点以及一 系列空间格局分析方法和动态模拟途径在景观生态学中也被广泛提出和应用为 其增添了新内容和新特点[2 -3]。 1 景观生态学的格局分析方法 景观格局分析概述 景观生态学研究最突出的特点是强调空间异质性、生态学过程和尺度的关 系这一特点也已成为景观生态学与其他生态学科的主要区别之一。研究景观的 结构(即组成单元的特征及其空间格局)是研究景观功能和动态的基础。空间格 局分析方法是指用来研究景观结构组成特征和空间配置关系的分析方法既包括 一些传统的统计学方法同时也包括一些专门用于解决空间问题的格局分析方 法。笼统地讲这些方法可分为两大类：格局指数方法和空间统计学方法。前者 主要用于空间上非连续的类型变量数据(categorical data)而后者主要用于空间上 连续的数值数据(guantitative data)[4-5]。 景观空间格局指数
第八章微生物生态试题 一．选择题： 81234.81234.在制作酸菜或青贮饲料时，一般并不人工接种乳酸菌，这是人们利用了植物的： A. 根际微生物 B. 叶面附生微生物 C. 与植物共生的根瘤菌 D. 寄生于植物的微生物 答：( ) 81235.81235.指出下列中不是微生物与植物形成的共生体的是： A. 根瘤 B. 菌根 C. 叶瘤 D. 叶面乳酸菌 答：( ) 81236.81236.根土比是指： A. 植物根际土壤重与根外土壤重之比。 B. 根外土壤重与根际土壤重之比。 C. 每克植物根际土壤中微生物数量与每克根外土壤中微生物数 量之比。 D. 每克根外土壤中微生物数量与每克根际土壤中微生物数量之 比。 答：( ) 81237.81237.植物根际每克土壤的微生物数量与每克根外土壤中微生物数量之比，称之为： A 土根比 B 根土比 C 比土根 D 比根土 答：( ) 81238.81238.土壤中有一部分微生物在有新鲜有机残体进入时便大量发育占优势，而新鲜有机体被分解后迅速衰退，这类微生物称之为： A. 发酵性微生物区系 B. 土著性微生物区系 C. 清水型水生微生物 D. 腐生性水生微生物 答：( ) 81239.81239.土壤中有一部分微生物对于新鲜有机物质的进入并不敏感，常年保持在某一数量水平上，这部分微生物称之为： A. 发酵性微生物区系 B. 土著性微生物区系 C. 清水型水生微生物 D. 腐生性水生微生物 答：( ) 81240.81240.好氧性微生物与厌氧性微生物共栖时，两者可形成： A. 互利共栖关系 B. 偏利共栖关系 C. 拮抗关系 D. 寄生关系 答：( ) 81241.81241.酸菜腌制后可以保存相当长的时间，这是人们利用了微生物之间的
大学校园景观中景观生态学应用 摘要：校园规划与社会和科学技术发展以及高等教育体制有着密切的关系，是城市规划与设计中一项重要的课题。文中针对景观生态学在校园景观规划中的应用进行研究，从宏观和微观两方面对景观生态学在现代景观设计中的应用进行论述。由于高等学校相对而言，功能性较为复杂，综合性较强，因此本文的重点以介绍高等院校的景观设计为主，并以江南大学蠡湖校区为例系统的阐述了景观生态学当代校园景观规划中的应用。 关键词：校园环境；景观生态学；校园景观设计 随着科学技术的发展，人类的生活环境已经面临严重的生态危机，环境破坏已经成为了现代人类面临的头号问题，生态环境的恶化已经威胁到整个民族的可持续发展，必须将恢复生态学和生态恢复的理论知识与技术手段、可持续发展的技术、思想贯穿于景观环境设计—建造—管理的始终。 1 景观生态学的基本概念 景观生态学是一门新兴的多学科之间交叉的学科，它的主体是地理学与生态学之间的交叉。景观生态学以整个景观为对象，通过物质流、能量流、信息流与价值流在地球表层的传输和交换，通过生物与非生物一级人类之间的相互作用与转化，运用生态系统原理和系统方法研究景观结构和功能、景观动态变化以及相互作用机理、研究景观的美化格局、优化结构、合理利用和保护。 景观生态学作为一门正在发展中的综合性交叉学科，其理论的直接来源是生态学与地理学，同时从现在科学的诸多相关理论中也汲取了丰富的营养。景观生态学的理论基础为开放系统的自然等级有序理论，以及综合性和组织性理论；它的自然生态系统与人类系统之间生物控制共生理论是以控制论为基础的。因果反馈耦合关系建立不仅与系统论、控制论有关，还涉及到信息论的有关问题。景观生态学的自组织理论及稳定性概念又和耗散结构理论有关。 2 校园景观设计综述 校园景观设计包括小学、中学和大学的校园景观，这三种景观都是属于校园景观范畴内，因此具有相同的特点。三者都强调为教学服务的宗旨，营造具有文化气息的校园环境，符合师生学习工作的需要等特点。但是由于他们所服务的人群有很大差异，同时校园的功能性、综合性、复杂性有很大的差异，因此三者还有很大差异。但是在校园景观设计中必须遵循以下几个基本原则。 2.1 以人为本的原则，校园的景观设计是以人的需求为基础的，因此大学校园景观规划应本着“以人为本”，即在尊重自然的前提下，考虑人的尺度和心理要求，将人的活动性和舒适性作为景观规划的出发点。 2.2 可持续发展原则，大学校园景观规划要体现可持续发展的原则，要从长远发展考虑。景观设计要与学校自身的发展目标和定位相结合，必须要有符合自身风格特色的大学校园环境，规划和设计要能够经得起时间的考验。 2.3 生态性和因地制宜原则，对于学校来说，必须从大环境着眼，从小环境入手，尽可能利用那些天然的地形和植被，为生态环境的合理化创造条件，应避免为追求气派而过分强调草坪的作用，忽视乔、灌、草、地被植物群落式立体配置的重要性，设计手段应是“花最少的力气去适应生态环境”。 2.4 功能性、人文性相统一的原则，大学校园必须是学习与生活同在、学科与学科交融、校园与社会对话、人文与生态共享的集合共存体，能同时满足教、学、研及生活的各种不同需求。 3 基于生态学的校园景观规划设计的方法
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。
------------------------------------------------------------精品文档-------------------------------------------------------- 第十章微生物生态学 单项选择题 1.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记 地球被科学家划分为4个圈，不包括下列哪一项( )。 选项A）土壤圈 选项B）大气圈 选项C）水圈 选项D）岩石圈 答案：A 2.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记 生态圈中，起着主导作用的是( )。 选项A）大气圈 选项B）生物圈 选项C）水圈 选项D）岩石圈 答案：B 3.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记 生物循环的特点是( )。 选项A）运转较缓慢 选项B）可循环性 选项C）运转迅速 ）以上均是D选项． 答案：C 11. 知识点：1(生态系统) 难易度：适中认知度：理解 ( ) 。生态系统结构不包括下面哪一个方面选项A）外源能 选项B）生物关系 选项C）营养循环 选项D）能量代谢 答案：D 12. 知识点：1(生态系统) 难易度：适中认知度：认知 ( ) 。生物在生态系统物质循环中扮演着重要作用，但不包括选项A）生产者 选项B）消费者 选项C）分解者 选项D）固定者 答案：D 13. 知识点：1(生态系统) 难易度：较难认知度：认知 ( ) 。微生物生态系统自身的特点不包括选项A）微环境 选项B）稳定性
选项C）协调性 选项D）适应性 答案：C 认知度：理解难易度：较难) 生态系统1(知识点：14. ( ) 。成熟的生态系统的平衡特点是选项A）生产者、消费者、分解者比例相同 选项B）物质循环与能量循环协调畅通 选项C）系统的输入和输出在比例上合理 选项D）物质循环与能量循环大致相等 答案：B 15.知识点：2(微生物在自然界中的分布) 难易度：容易认知度：理解 。)土壤中三大类群体微生物以数量排序为( 选项A）细菌＞放线菌＞真菌）细菌＞真菌＞放线菌B选项C选项）放线菌＞细菌＞真菌选项D）真菌＞细菌＞放线菌A 答案：难易度：容易认知度：理解2(16.知识点：微生物在自然界中的分布) )。( 微生物的种质资源库存在于 A）水体选项）土壤选项B C）植物选项）动物选项DB 答案：知识点：17.2( 难易度：容易认知度：理解) 微生物在自然界中的分布 。) ( 土壤微生物的季节分布特征一般是 选项A）春季＞夏季＞秋季＞冬季 选项B）夏季＞春季＞秋季＞冬季 选项C）春季＞秋季＞夏季＞冬季 选项D）夏季＞秋季＞春季＞冬季 答案：C 18.知识点：2(微生物在自然界中的分布) 难易度：容易认知度：理解 。)大多数土壤的酸碱度( 5.5~8.5 A）选项4.0~10.0 B）选项3.5~12.0 ）选项C 8.0选项D）左右答案：A 难易度：容易认知度：识记2(19.知识点：微生物在自然界中的分布) 。( ) 土壤放线菌的主要优势种群为选项A）链霉菌属B选项）小单孢菌属）放线菌属选项C 选项D）节杆菌属A 答案：) 2(20.知识点：微生物在自然界中的分布认知度：识记难易度：容易土壤中的土腥味主要来源于( ) 。）细菌A选项． 选项B）放线菌 选项C）霉菌 选项D）酵母菌 答案：B 21.知识点：2(微生物在自然界中的分布) 难易度：容易认知度：识记 下列微生物中比较适合于干燥环境存在的是( )。 选项A）细菌 选项B）食用菌 选项C）放线菌 选项D）酵母菌 答案：C
景观生态规划文献综述 一前言 景观是人类的世界观、价值观、伦理道德的反映，是人类思想在大地上的投影，而景观设计是人们实现梦想的途径。然而，保护生物多样性和维持良好的生态环境是人类生存和未来工农业持续稳定发展的基础。环境恶化的结果是导致景观结构的改变、生态功能的失调，而设计合理的景观结构对保护生物多样性和生态环境具有重要作用。景观生态规划是建立合理景观结构的基础，它在自然保护区设计、土地持续利用以及改善生态环境等方面有着重要意义。景现与城市的生态设计反映0人类的一个新的梦想，这个梦想就是自然与文化、设计的环境与生命的环境，美 的形式与生态功能的真正全面地融合，它要让公园不再是孤立的城市中的特定用地．而是让其消融，进入千家万户；它要让自然参与设计；让自然过程伴依每一个人的日常生活；让人们重新感知、体验和关怀自然过程和自然的设计。 二景观生态规划的概念和原理 2.1 景观生态规划的概念 如果我们把景观设计理解为是一个对任何有利于人类使用户外空问及土地问题的分析、提出解决问题的方法以及监理这一解决方法的实施过程，而景观设汁师的职责就是帮助人类使人、建筑物、社区、城市以及人类的生活同地球和喈相处m。那么，景观设计从本质上说就应该是对土地和户外宅间的生态设计，生态原理是景现设计学(1andscape architecture)的核心。从更深层的意义上说，景观设汁是人类生态系统的设计。是一种最大限度的借助于自然力的最少设计，一种基于自然系统自我有机更新能力的再生没计，即改变现有的线性物流和能流的输入和排放模式．而在源、消费中心和汇之间建立一个循环流程一其所创造的景观是一种可持续的景观。 不同学科和领域对生态规划有着不同理解．公认的生态规划分为广义和狭义两种。我们这里谈到的是广义的生态规划．是作为一种方法论去指导其他一些具有很强操作性的规划(景观建筑规划、土地利用规划、园林规划等)，使其成为贯穿生态学原理的规划。生态规划作为一种学术思想产生于19世纪末20世纪初以美国地理学家G．P．马什(G．P．Marsh，1864)、地质学家J．W．鲍威尔(J．W．Powell，1879)、英国生物学家派特里克·盖迪斯(Patrick Geddes，1915)为代表的土地生态恢复、生态评价、生态勘测、综合规划等方面的理论与实践。
第十章微生物生态学 单项选择题 1.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记地球被科学家划分为4个圈，不包括下列哪一项( )。 选项A）土壤圈 选项B）大气圈 选项C）水圈 选项D）岩石圈 答案：A 2.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记生态圈中，起着主导作用的是( )。 选项A）大气圈 选项B）生物圈 选项C）水圈 选项D）岩石圈 答案：B 3.知识点：1(生态系统) 难易度：容易认知度：识记生物循环的特点是( )。 选项A）运转较缓慢 选项B）可循环性
选项C）运转迅速 选项D）以上均是 答案：C 11. 知识点：1(生态系统) 难易度：适中认知度：理解 生态系统结构不包括下面哪一个方面( )。 选项A）外源能 选项B）生物关系 选项C）营养循环 选项D）能量代谢 答案：D 12. 知识点：1(生态系统) 难易度：适中认知度：认知 生物在生态系统物质循环中扮演着重要作用，但不包括( )。选项A）生产者 选项B）消费者 选项C）分解者 选项D）固定者 答案：D 13. 知识点：1(生态系统) 难易度：较难认知度：认知 微生物生态系统自身的特点不包括( )。
选项A）微环境 选项B）稳定性 选项C）协调性 选项D）适应性 答案：C 14. 知识点：1(生态系统) 难易度：较难认知度：理解 成熟的生态系统的平衡特点是( )。 选项A）生产者、消费者、分解者比例相同 选项B）物质循环与能量循环协调畅通 选项C）系统的输入和输出在比例上合理 选项D）物质循环与能量循环大致相等 答案：B 15.知识点：2(微生物在自然界中的分布) 难易度：容易认知度：理解土壤中三大类群体微生物以数量排序为( )。 选项A）细菌＞放线菌＞真菌 选项B）细菌＞真菌＞放线菌 选项C）放线菌＞细菌＞真菌 选项D）真菌＞细菌＞放线菌
基因工程及其应用集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
第2节基因工程及其应用（第1课时） 知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究 传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？
《景观生态学》教学大纲 (学时:32 适应专业: 风景园林) 一、课程性质和任务 景观生态学是一门新兴的交叉学科，是城市园林与花卉设计专业的必修专业课程。它主要来源于地理学上的景观和生物学中的生态，它把地理学对地理现象的空间相互作用的横向研究和生态学对生态系统机能相互作用的纵向研究结合为一体，以景观为对象，通过对物质流、能量流、信息流和物种流在地球表层的迁移与交换，研究景观的空间结构、功能及各部分的相互关系，研究景观的动态变化及景观优化利用和保护的原理和途径。其中包含的思想和方法对园林设计有较强的指导作用。 二、课程教学目标 （一）知识教学目标 1、了解景观生态学的发展历史、数量方法及遥感和地理信息系统在景观 生态学中的应用。 2、理解景观生态学的一般概念、景观结构、生态过程和景观的动态变化。 3、掌握景观生态学在生物多样性保护、土地持续利用和全球变化中的应 用。 （二）能力教学目标 1、培养学生景观优化利用的能力 2、培养学生系统全面分析景观格局与生态过程的关系以及人类对景观及其 组分的影响的能力 3、培养学生对景观进行准备全面评价的能力，并能提出合理改造的建议（三）思想教育目标 1、提高环境保护的意识 2、培养学生的敬业精神 三、教学内容和要求 第一章景观生态学的概念及发展 教学内容： （一）景观与景观生态学 （二）景观生态学的发展 （三）景观生态学的展望 教学要求：1、了解景观生态学的发展过程； 2、掌握景观生态学的相关概念 第二章景观生态学的理论基础 教学内容：
（一）系统与景观生态学 （二）自然等级理论与尺度效应 （三）岛屿生物地理学理论与异质种群 （四）渗透理论 （五）地域分异规律 （六）景观生态学的一般原理与核心概念 教学要求： 1、了解景观生态学的基本原理 2、理解景观生态学的核心概念 第三章景观结构 教学内容： （一）景观发育 （二）斑块 （三）廊道 （四）基质 （五）景观的异质性 （六）景观空间格局 （七）网络 （八）生态交错带 教学要求： 理解景观结构及结构和功能间的相互关系 第四章景观生态过程 教学内容： （一）干扰与景观格局演变 （二）景观连接度与连通性 （三）景观中的物种运动 （四）景观中的水分和养分运动 （五）景观中的人文和文化过程 教学要求：1、了解景观演变的生态过程 2、理解景观中的人文和文化过程变化 3、掌握景观设计中连接度和连通性的有关要求 第五章景观动态变化 教学内容： （一）景观稳定性 （二）景观变化的驱动因子 （三）景观变化的生态环境影响 （四）景观变化的动态模拟 教学要求： 1、理解景观的动态变化 2、培养学生动态模拟景观的能力 第六章景观生态分类与评价
景观生态学课程论文 景观生态学景观格局分析方法综述
目录 摘要 ................................................................................................................................ I 引言 . (1) 1 景观生态学的格局分析方法 (1) 1.1景观格局分析概述 (1) 1.2景观空间格局指数 (1) 1.2.1景观单元特征指数 (1) 1.2.2景观异质性指数 (2) 1.2.3景观指数的实例应用 (3) 1.3景观分析的统计学方法 (4) 2不同类型景观格局分析方法及案例 (4) 2.1基于GIS 的山林地区的景观格局分析方法——以宁远县为例 (4) 2.1.1研究区域概况 (4) 2.1.2研究数据与处理 (5) 2.1.3土地利用分类系统 (5) 2.1.4研究方法——景观空间格局指数分析法 (5) 2.1.5景观格局特征指数变化结果分析 (6) 2.2基于GIS干旱区绿洲城市景观格局分析方法——以石河子市为例 (7) 2.2.1研究区域概况 (7) 2.2.2研究数据与处理 (7) 2.2.3景观格局指数分析 (8) 2.2.4城市景观格局总体变化特征结果分析 (9) 2.3城市湿地公园景观格局分析——以白鹭湾湿地公园为例 (10) 2.3.1研究区域概况 (11) 2.3.2研究数据与处理 (11) 2.3.3景观空间格局特征指数分析研究方法 (11) 2.3.4结果与分析 (12) 3 结语 (13) 参考文献 (14)
高二生物导学案班级 班级姓名使用时间 一、学习目标 1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。 3.认同基因工程的应用促进生产力的提高。 二、学习重点 1.DNA重组技术的基本工具（三方面） 2.基因工程的基本操作程序（四方面） 三、学习难点 1.DNA重组技术的基本工具（三方面） 2.基因工程的基本操作程序（四方面） 一、植物基因工程硕果累累 提高农作物的（如）能力、改良农作物的，和利用植物生产等。
一、动物基因工程前景广阔 二、基因工程药物异军突起 1、方式：利用基因工程培育来生产药品。 2、成果：利用工程菌可生产、、、等。 3、什么是工程菌？ 四、基因治疗 1、概念：把导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。 2、成果：将导入患者的淋巴细胞。 3、途径：分为和。 4、注意：基因治疗治疗疾病的最有效手段。 5、基因治疗用于临床治疗了么？ 作业：1．下列关于基因工程的应用，说法正确的是() A．我国转基因抗虫棉是转入了植物凝集素基因培育出来的 B．可用于转基因植物的抗虫基因只有植物凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因 C．抗真菌转基因植物中，可使用的基因有几丁质酶基因和抗毒素合成基因 D．提高作物的抗盐碱和抗干旱的能力，与调节渗透压的基因无关 2．运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有()
A．抗虫基因B．抗虫基因产物 C．新的细胞核D．相应性状 3．科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是() ①该技术将导致定向变异 ②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来 ③蛋白质中的氨基酸序列可为合成目的基因提供材料④受精卵是理想的受体 A．①②③④B．①③④ C．②③④D．①②④ 4．下列不．属于基因工程药物的是() A．从大肠杆菌体内获取的白细胞介素B．从酵母菌体内获取的干扰素 C．从青霉菌体内获取的青霉素D．从大肠杆菌体内获取的胰岛素 5．在转基因植物(如抗虫棉)的培育中，成功与否最终要看() A．用什么方法获得目的基因B．选择运载体是否得当 C．重组DNA分子的结构和大小D．是否赋予了植物抗性 6．若利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种，其在环境保护上的最重要意义是() A．减少氮肥使用量，降低生产成本B．减少氮肥生产量，节约能源 C．避免使用氮肥过多引起的环境污染D．改良土壤的群落结构 7．利用基因工程技术将生长激素基因导入绵羊体内，转基因绵羊生长速度比一般的绵羊提高30%，体型大50%，在基因操作过程中生长激素基因的受体细胞最好采用() A．乳腺细胞B．体细胞C．受精卵D．精巢 8．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是() A．人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵 C．在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中D．人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA 9．“工程菌”是指() A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选取能迅速增殖的菌类 10．抗病毒转基因植物成功表达后，以下说法正确的是() A．抗病毒转基因植物可以抵抗所有病毒 B．抗病毒转基因植物对病毒的抗性具有局限性或特异性 C．抗病毒转基因植物可以抗害虫 D．抗病毒转基因植物可以稳定遗传，不会变异 11．要彻底治疗白化病必须采用() A．基因治疗B．医学手术C．射线照射D．一般药物 12．下列与基因诊断有关的一组物质是() A．蛋白质、核酸B．放射性同位素、蛋白质 C．荧光分子、核酸D．放射性同位素、糖类 13．下列关于基因工程成果的概述错误的是（） A在医药卫生方面主要用于诊断治疗疾病