高产酸性果胶酶霉菌的选育
果胶酶在果酒酿造中具有提高出汁率、加速澄清、提升果酒质量等重要作用。我国果酒产业正处于迅猛发展的阶段,但果酒用果胶酶多依赖进口,这不但增加了生产成本,也使得我国果酒生产受到技术制约。
因此,研发出具有自主知识产权的果酒用酸性果胶酶是目前果酒行业中亟待解决的问题。本研究以本实验室前期筛选的产酸性果胶酶的土曲霉(Aspergillus terreus)gxy12-2为出发菌株,对其进行紫外和亚硝基胍诱变,经溴酚蓝培养基
初筛、发酵复筛等,得到两个表现突出的诱变菌株A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。
将诱变菌株A.terreus ZH2-4和A.terreus ZH2-11所产果胶酶,分别经真空冷冻浓缩后应用于低醇草莓酒、低醇枇杷酒、低醇西瓜酒的酿造中,探究其对果酒品质的影响。本研究的主要内容与结论如下:1.对菌株A.terreus gxy12-2进行了一次紫外诱变与两次亚硝基胍化学诱变,获得高产果胶酶的诱变菌株
A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。
本研究首先对A.terreus gxy12-2进行紫外诱变,获得一株果胶酶酶活提高34.9%的诱变菌株A.terreus C73D-2,其纤维素酶与聚半乳糖醛酸酶(PG)的比酶活分别是出发菌株A.terreus gxy12-2的1.28和1.1倍。以A.terreus C73D-2为出发菌株,进行亚硝基胍化学诱变,获得一株产果胶酶酶活提高了21.3%的菌
株A.terreus ZH1-4,其所产果胶酶比酶活和PL比酶活分别是出发菌株
A.terreus C73D-2的1.09倍和1.15倍。
以A.terreus ZH1-4为出发菌株,再次进行亚硝基胍诱变,获得两个高产果胶酶的诱变菌株A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。其中,与原始出发菌株
A.terreus gxy12-2相比较,A.terreus ZH2-4的果胶酶酶活和比酶活分别提高了145.08%和239.24%,PG、纤维素酶、PL、PE的比酶活分别提高了1.28、1.62、1.38、1.23倍;A.terreus ZH2-11的果胶酶酶活和比酶活分别提高了102.17%和177.8%,PG、纤维素酶、PL、PE的比酶活分别提高了1.27、1.68、1.38、1.57倍。
经过遗传稳定性检验,诱变菌株A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11均具有高产果胶酶的遗传稳定性。2.对A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11所产果胶酶进行酶学特性检验。
(1)A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11所产果胶酶最适反应温度分别为55℃和60℃,且经过70℃高温处理后,均能保持50%以上的酶活性。(2)A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11所产果胶酶的最适反应pH值均为4,属于酸性果胶酶,均具有较强的耐酸性,其中A.terreus ZH2-11所产果胶酶对酸的耐受性更强。
(3)经真空冷冻浓缩后,A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11果胶酶浓缩液的酶活分别提高了320.56%和387.34%,但其比酶活分别下降了30%和20%。3.A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11果胶酶应用于低醇草莓酒、西瓜酒和枇杷酒的酿造中。
酒精发酵结束时,各果酒的挥发酸均小于0.64g/L,相对于商业果胶酶EX,使用A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11果胶酶所酿得的三种果酒的挥发酸均略有降低。在三种果酒中ZH2-4果胶酶对色度、出汁率、自流汁率的影响与商品酶保持一致,并且ZH2-4果胶酶处理后的草莓酒色度显著高于商品酶处理。
ZH2-4产果胶酶在提高总酚含量方面表现突出,在西瓜酒与草莓酒中,总酚
含量均高于商品酶处理后的同类型酒。ZH2-4果胶酶处理后的甲醇含量均低于商
品酶处理。
业,2000,26(4):82-85. [3]Feron G,Du fosse L ,Pierard E ,et al.Production ,identification and toxicity of γ-decalactone and 4-hydroxyde -canoic acid from Sporidiobolus spp .[J ].Applied and E nvironmental Microbiology ,1996,62(8):2826-2831. [4]王建龙,施汉昌.聚乙烯醇包埋固定化微生物的研究及进展[J ].工业微生物,1998,28(2):35-39. [5]李峰,吕锡武.聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究[J ].中国给水排水,2000,16(12):14-17. [6]牛红星,邱蔚然.用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱[J ].华东理工大学学报,2002,28(4):372-375. [7]W anikawa A.,H os oi K.,K ato T.C onversion of unsaturated fatty acids to precurs ors of γ-lactones by lactic acid bacteria during the production of malt whisky[J ].Journal of the American Society of B rewing Chemists ,2000,58(2):51-56. [8]于伟,徐岩,喻晓蔚,等.生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯[J ].化工进展,2007,26(8):1151-1154. [9]周瑾,李雪梅,吕春华,等.地霉属真菌和棒状杆菌属株协同发酵生产γ-癸内酯[J ].生物技术通讯,2003,14(1):39-41. [10]王聪,宋焕禄,吕跃钢.复合诱变选育γ-癸内酯生产菌株[J ].食品科学,2007,28(6):237-240. [11]李花子,王建龙,文湘华.聚乙烯醇-硼酸固定化方法的改进[J ].环境科学研究,2002,15(5):25-27. [12]Zhuge J.M odern Ferment M icroorganism Experimental T echnology [M ].Beijing :Chem ical Industry Press ,2005:223-225. 果胶酶高产菌株EIM -4的鉴定及其液体发酵条件优化 柯崇榕,田宝玉,杨欣伟,林伟铃,黄薇,黄建忠 3 (福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心,福建福州350108) 摘要:目的:通过了解高产果胶酶菌株EI M -4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。方法:通过基于18S rDNA 序列的系统发育进化分析对果胶酶高产菌进行鉴定,通过单因素试验和均匀设计获得最适产酶条件。结果:通过对18S rRNA 基因的分子系统进化分析,菌株EI M -4被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger )。通过单因素和均匀设计试验确定最佳产酶培养基为(g ΠL ):橘皮粉3219,黄豆粉1017,(NH 4)S O 42.1,CaC O 31.0,pH 自然。结论:Aspergillus niger EI M -4的液体发酵产果胶酶的活力可达15159.82U Πm L 。 关键词:果胶酶;黑曲霉;分子系统进化;液体发酵;均匀设计 中图分类号:Q946.5;Q93-331 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)05-0069-04 Identification of A Pectinase -producing Fungi EIM -4and Its Orthogonal Experiment of Submerge Fermentation Conditions KE Chong -rong ,T ian Bao -yu ,Y ANG X in -wei ,LI N Wei -lin ,H UANG Wei ,H UANGJian -zhong 3 (Engineering Research Center of Industrial M icrobiology ,M inistry of Education ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350108,China ) Abstract :Objective :Developing available industrial technologies to produce pectinase by understanding basic in formation for a high pectinase -producing strain EI M4and optimizing its submerged fermentation conditions.Method :Identified strain EI M4by using m olecular phyloganatic analysis of 18S rDNA sequences and im proved pectinase production by orthog onal experiment design.R esult :S train EI M -4was identified as As 2pergillus niger .Through orthog onal experiment ,the optimal submerge fermentation condition was obtained for producing extracellular pectinase.The suitable medium contained :orange peel power 32.97g ΠL ,s oybean flour 10.76g ΠL ,(NH 4)S O 42.14g ΠL ,CaC O 31.00g ΠL.,nature pH.Con 2clusion :The optimum pectinase activity of Aspergillus niger EI M -4is as high as 15159182U Πml. K ey w ords :pectinase ;Aspergillus niger ;phylogenetic analysis ;submerge fermentation ;orthog onal experiment 收稿日期:2008-07-17;修回日期:2008-09-03 基金项目:福建省科技厅重大项目(2005Q007)资助 作者简介:柯崇榕(1984-),男,硕士生;3通讯作者:黄建忠(1966-),男,博士,教授,Email :hjz @https://www.doczj.com/doc/b414636293.html, 。 果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分。近几年来,果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注[1]。果胶酶(Pectinases )是分解果胶质的一类复合酶的总称,主要通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键致使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸,它广泛存在于各种细菌、真菌和放线菌等微生物中。动植物天然来源的果胶酶产量低难于大规模提取制备,微生物才是生产果胶酶的优良生物资源[2]。果胶酶类的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面,还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处 理和饲料等行业中[1,3] 。 黑曲霉是公认的安全菌株(G RAS:G enerally Regarded As Safe ),其代谢产物可直接用于食品工业,并且黑曲霉分泌的果胶酶系比较全[4]。目前,工业用的果胶酶生产菌大多是通过黑曲霉固体发酵生产获得,但由于固体发酵规模生产受限且杂蛋白含量高,影响果胶酶的分离纯化[5,6]。因此,筛选适合于液体深层发酵培养高产果胶酶菌株显得尤为重要。本文基于18S rDNA 序列的系统发育学分析对筛选得到的高产碱性果胶酶的真菌进行鉴定,并对其液体深层发酵产酶条件进行初步优化,为下一步工业化生产或者分子育种提高果胶酶比活力奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株和质粒 真菌EI M -4和E scherichia coil DH5α(φ80lacZ ΔM15),均由 工业微生物教育部工程研究中心保存。pM D -18T S im ple Vec 2tor 购自T aK aRa Biotechnology (dalian )C o.,Ltd.1.1.2 试剂 DNA 限制性内切酶、X -gal 、IPTG 、Marker 购自T aK aRa Bio 2technology (dalian )C o.,Ltd.,胰RNA 酶(RNaseA )购自Biotech C o.,Ltd ,W ozard S V G el and PCR Clean -up System 购自Promega Biotech C o.,Ltd ,氨苄青霉素购自上海生工生物工程公司。1.1.3 培养基 (1)固体分离培养基:K 2HP O 40.1g ;M gS O 40.5g ;NaNO 3313g ;FeS O 40.01g ;果胶0.2g ;琼脂粉0.15g ;加水至1L ,自然pH; (2)基础固体培养基:马铃薯200g ;葡萄糖20g ;琼脂粉15g ;水1L ,自然pH ; (3)基础液体培养基:3%橘皮粉;2%麸皮;0.35%(NH 4)2S O 4;0.2%的CaC O 3。1.2 方法1.2.1 菌株基因组DNA 的提取 采用改良的S DS 裂解法提取真菌EI M -4的基因组DNA [7] 。1.2.2 引物设计 根据丝状真菌(曲霉)的18S rDNA 基因的保守序列设计一对通用扩增引物(由上海生工生物工程公司合成),其中: 正向引物P f :5’-T CC AACCTGG TTG AT CCTG CC AG T A -3’
果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优1 果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优化 摘要:通过野外采集样品，从中筛选出两株产酶相对较高的菌株，并对其酶学 性质进行初步研究，探索其最适生长时间，生长的环境温度，最适ph，以及最适 接种量，并设计实验方案。 第一部分前言 果胶酶是一类分解果胶物质的多种酶的总称，主要包括原果胶酶，果胶脂酶，果胶裂解酶及多聚半乳糖醛酸酶四大类，因其能有效的分解果肉组织中的果胶物质,而广泛应用于食品加工、酿酒工业等方面。此外，果胶酶在生物制药，生物污染防治，农产品加工，饲料等其他生物大规模产业也用途广泛，因而需求量也是日益增加，由于自然界中天然果胶酶广泛存在于动、植物体内，因产量较低而难以作为大规模提取，因此，寻求高效的果胶酶生产方法也更加重要，现阶段，采用微生物发酵，并从其代谢产物中提取果胶酶方法，已应用的日加成熟，各种高产、高效的菌株纷纷被筛选出来，而广泛应用于发酵生产。一、果胶酶产生菌 (一)果胶酶产生菌的选育 据报到，在自然界中，已知的果胶酶产生菌多达40余种，其中多数为细菌和 霉菌，还有少数的放线菌、酵母菌。 1.材料和方法: 1.1实验材料: 采集果园土壤及腐烂的柑橘、桔子、甜瓜等水果腐烂的部分。 1.2培养基: 1.2.1富集培养基: 5%的葡萄糖，0.3%酵母膏，0.5%蛋白栋。
1.2.2选择培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，果胶 0.5g，琼脂2.5g，水100ml，ph自然。 1.2.3液体培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，庶糖 0.5g，水100ml，ph自然。 1.2.4土豆斜面培养基:20%土豆，20%葡萄糖，2%琼脂，ph自然 1.3菌株筛选方法 1.3.1筛选路线:采样增殖初筛复筛保存 1.3.2筛选方法 (1)增殖培养:将采集得的土壤及水果腐烂部分用无菌水稀释，搅拌充分后，静置5分钟，取上清液10ml至于50ml富集培养液中，30?,150r/min培养2-3天。 (2)菌株初筛:取富集液进行适当稀释，并涂布于选择培养基中，30?，培养3-4天，选取菌落形态较好的平板，加入0.1%的刚果红溶液，染色30min后，菌落周围有透明圈形成的即为产果胶酶菌株，观察透明圈产生快慢及其大小。 (3)菌株复筛:选取产透明圈的菌株，于选择培养平板上接种培养连续接种4-5代后，选取最优菌株，液体培养测其酶活力。 1.4酶活力测定 1.4.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制 取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，补水至1ml加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10分钟，冷却后定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线，二次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax+b，求出吸光度与半乳糖醛酸量的关系。 1.4.2液体曲5000r/min离心取上清，
高产酸性果胶酶霉菌的选育 果胶酶在果酒酿造中具有提高出汁率、加速澄清、提升果酒质量等重要作用。我国果酒产业正处于迅猛发展的阶段,但果酒用果胶酶多依赖进口,这不但增加了生产成本,也使得我国果酒生产受到技术制约。 因此,研发出具有自主知识产权的果酒用酸性果胶酶是目前果酒行业中亟待解决的问题。本研究以本实验室前期筛选的产酸性果胶酶的土曲霉(Aspergillus terreus)gxy12-2为出发菌株,对其进行紫外和亚硝基胍诱变,经溴酚蓝培养基 初筛、发酵复筛等,得到两个表现突出的诱变菌株A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。 将诱变菌株A.terreus ZH2-4和A.terreus ZH2-11所产果胶酶,分别经真空冷冻浓缩后应用于低醇草莓酒、低醇枇杷酒、低醇西瓜酒的酿造中,探究其对果酒品质的影响。本研究的主要内容与结论如下:1.对菌株A.terreus gxy12-2进行了一次紫外诱变与两次亚硝基胍化学诱变,获得高产果胶酶的诱变菌株 A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。 本研究首先对A.terreus gxy12-2进行紫外诱变,获得一株果胶酶酶活提高34.9%的诱变菌株A.terreus C73D-2,其纤维素酶与聚半乳糖醛酸酶(PG)的比酶活分别是出发菌株A.terreus gxy12-2的1.28和1.1倍。以A.terreus C73D-2为出发菌株,进行亚硝基胍化学诱变,获得一株产果胶酶酶活提高了21.3%的菌 株A.terreus ZH1-4,其所产果胶酶比酶活和PL比酶活分别是出发菌株 A.terreus C73D-2的1.09倍和1.15倍。 以A.terreus ZH1-4为出发菌株,再次进行亚硝基胍诱变,获得两个高产果胶酶的诱变菌株A.terreus ZH2-4与A.terreus ZH2-11。其中,与原始出发菌株
1．(2019·长春高二检测)下列有关果胶的叙述，错误的是() A．果胶是植物细胞壁的主要成分之一 B．细菌可产生果胶酶，是因为细菌的细胞壁中也含有果胶 C．果胶酶能将果胶分解成半乳糖醛酸 D．果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊 2．(2019·江苏南京期中)下列关于果胶酶的叙述错误的是() A．果胶酶能够分解植物细胞壁和胞间层中的果胶 B．果胶酶能降低化学反应的活化能 C．果胶酶是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物 D．果胶酶在细胞内的合成场所是核糖体 3．(2019·湖南衡阳八中高二月考)下列可表示酶活性的高低的是() A．单位时间内、单位体积中反应物的总量 B．一段时间后生成物的总量 C．一段时间后、一定体积中消耗的反应物的量 D．单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量 4．下图是果胶酶在不同温度条件下的酶活性变化曲线，请回答下列问题： (1)分析图示可知，在50 ℃时，果胶酶的活性________。 (2)在________和________时，果胶酶的活性都降为0，但恢复至50 ℃时，________图中酶的活性可能恢复，请在图中画出恢复曲线，由此表明________图中酶的结构未受到破坏。 5．(2019·山东济南一中高二月考)下图为某同学探究温度对果胶酶活性的影响的实验操作流程图，下列叙述错误的是() A．底物可为苹果泥，酶液为果胶酶溶液 B．底物与酶混合前的同温处理可以取消 C．实验的自变量为温度
D．检测的是果汁的体积或果汁的澄清度 6．(2019·海南中学期末)在“探究果胶酶的用量”实验中，下列说法中不正确的是() A．反应液的pH 必须相同 B．底物浓度一定时，酶的用量越大，滤出的果汁越多 C．应控制在适宜温度和pH 条件下 D．实验时可配制不同浓度的果胶酶溶液 7．果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。果胶酶能够分解果胶，分解植物的细胞壁及胞间层。请完成以下有关果胶酶和果汁生产中的问题： (1)在果汁生产中应用果胶酶可以提高________和________。 (2)某实验小组进行了“探究果胶酶催化果胶水解最适pH”的课题研究。本课题的实验步骤中，在完成“烧杯中分别加入苹果泥，试管中分别注入果胶酶溶液、编号、编组”之后，有下面两种操作： 方法一：将试管中果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥相混合，再把混合液的pH分别调至4、5、6……10。 方法二：将试管中果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥pH分别调至4、5、6……10，再把pH 相等的果胶酶溶液和苹果泥相混合。 ①请问哪一种方法更科学？ ________________________________________________________________________。 理由是__________________________________________________________________。 ②如果用曲线图的方式记录实验结果，在现有的条件下，当横坐标表示pH，纵坐标表示________时，实验的操作和记录是比较切实可行的。根据你对酶特性的了解，分析图中最可能是实验结果的曲线图是________。若实验所获得的最适pH＝m，请你在所选的曲线图中标出“m”点的位置。 8．(2019·盐城高二检测)下列关于果胶酶的说法，正确的是() A．果胶酶可以分解细胞壁的主要成分纤维素 B．果胶酶是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物 C．果胶酶不特指某种酶，而是分解果胶的一类酶的总称 D．果胶酶的化学本质是蛋白质或RNA 9．下表是某同学探究温度对果胶酶活性影响的实验结果。该结果不能说明()
课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。
果胶酶的生产技术 课程：食品生物技术 专业： 班级： 学号： 姓名： 完成时间：2011 年5月15日
果胶酶的生产技术 摘要：果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，它能将复杂的果胶分解为半乳糖醛酸等小分子。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。果胶酶主要来自微生物。综述了微生物果胶酶生产茵的菌种、选育、鉴定、发酵方法和发酵条件优化，酶的分离纯化、酶学性质和分子生物学方面的研究进展，并介绍了果胶酶的应用进展，最后展望了微生物果胶酶研究的广阔前景。 关键词：微生物果胶酶果胶；果胶酶；几丁聚糖；固定化研究现状展望 1 果胶 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a一1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起m．它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细 胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其 它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布． 2 果胶酶 2.1 果胶酶(pectolytic enzyme or pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称． 2.2 果胶酶的分布 许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，主要以曲霉和杆菌为主．新近报道的其它茵有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、扩展青霉(Penicillium expansum)以及Penicillium
海南大学（儋州校区）农学院 生物技术专业课程论文（设计） 题目：果胶酶高产菌种选育研究进展 学生：王鹤松 学号： B0704030 专业年级： 2007级生物技术（1）班 指导教师：朱稳 二o一o年六月二十五日
果胶酶高产菌种选育研究进展 王鹤松 （海南大学海南儋州571737 B0704030） 摘要：果胶酶是能协同分解果胶质的一组酶的总称，在生产，造纸，食品发酵等方面有广泛应用。本文对酸性果胶酶和碱性果胶酶生产菌种的特点分别进行了介绍，并从传统育种、诱变育种和基因工程育种三个方面对果胶酶产生菌的高产育种技术的研究进展进行了综述。关键词：果胶酶；微生物；选育；影响因素 Development on the Breeding of Pectinase High-yielding Strains Hesong Wang ( Hainan University, Danzhou, Hainan ，571737，B0704030 ) Abstract：For pectinase is coordinated with pectin can decompose the floorboard of a group of enzymes in production, papermaking, fermentation etc, food is widely used. Based on acid and alkaline pectic enzymes for pectinase strains of production were introduced, and from conventional breeding, mutation breeding and gene engineering to produce three aspects of bacteria for pectinase high-yielding breeding technology is reviewed. Key words：pectinases；microbe；mutafacient；influencing factor 果胶酶（pectinases）是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，是一种复合酶（由D-半 乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物）。它通常包括原果胶酶（PPase）、多 聚半乳糖醛酸酶（PG）、裂解酶（PL）和果胶酯酶（PE）等4类。如果从生产、应用领域 和最适用pH值环境来划分，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶通 常是指内聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，EC3.2.1.15）[1]，因为大多数的聚半乳糖 醛酸酶的最适pH值为3.5~5.5。它是以水解作用方式无规则切断果胶酸分子的α-1，4糖苷 键，主要应用于食品工业中果蔬汁和果酒的提取和澄清。碱性果胶酶一般多指聚半乳糖醛酸 裂解酶（polygalacturonate lyase，EC4.2.2.1），它是以反式消去作用方式裂解果胶酸分子的α -1，4糖苷键[1]，将复杂的果胶分解成小分子，如半乳糖醛酸。碱性果胶酶在碱性范围内具有较高活性，其主要应用于植物病毒的纯化、诱导植物抗病、纸浆漂白、棉织物处理、含果胶污水处理、咖啡和茶的发酵生产，以及榨油、木材防腐、洗涤剂和家禽饲料加工[2]等。并且，果胶酶在全世界食品酶的销售额中占25%[3]。因此，果胶酶的菌种选育尤为重要，通过对酸碱性果胶酶菌种的种群特点的深入研究，更有利于菌种进行选育，获得高产的优良菌株，并通过对影响微生物产果胶酶的各种因素进行分析，可以更深层次为果胶酶的选育提供帮助。
1104110116 1041101班 食品学院 陈家晟 2013/6/25
摘要：果胶酶是分解果胶质酶类的总称。通常包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)、果胶裂解酶(PL)等主要组分。本文主要叙述了果胶酶的制备方法和主要的应用。 关键词：果胶；果胶酶；黑曲霉；制备；应用； 前言：50年前国外就将果胶酶应用于果汁的加工，现有商品果胶酶制剂生产。近年来，为了满足国内市场对果胶酶的需求，一些研究单位对果胶酶的生产菌种及研制[1]展开了积极的研究。 此外，随着中国三大产业的发展，特别是第一和第二产业的高速发展，果胶酶的应用也越来越广泛。现在果胶酶主要应用于果汁加工和果酒酿造。除此之外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。 1.果胶酶及其简述 1.1果胶酶的定义 果胶酶，英文别名:Pectase; Polygalacturonase，是个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。 1.2果胶酶的特性 特性：作用pH:3.0-6.0，最适作用pH:3.0 温度特性：作用温度为15-55℃左右。最适作用温度为 50℃。 1.3果胶酶的作用原理 果胶酶是从根霉中提取的,可以分解细胞间的果胶物质，可以澄清果汁和分离细胞。2.果胶酶的制备 2.1高产酶菌株的选育 激光诱变育种:由成熟的黑曲霉斜面孢子制成一定浓度的孢子悬液，在搅拌条件下，采用810nm多模连续输出的半导体激光进行辐照.将辐照过的抱子悬液进行分离培养，挑单菌落接种于装有含1%果胶的麦芽汁试管中，置30℃恒温培养5-6d，观测并选出透明层较对照为最长的试管，将其孢子接种于斜面培养，在发酵培养基进行复筛，选出产酶最高者[2]. 2.2果胶酶的生产工艺 固体发酵生产果胶酶工艺流程: 培养料拌料 ↓ 灭菌 ↓ 斜面菌种→麸皮菌种→接种曲盘发酵培养 ↓ 出曲浸提 ↓ 离心甩滤→去渣 ↓ 填充剂脱色 ↓↓ 成品包装←喷雾干燥←超滤浓缩
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119 摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。 关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基： 1.1. 2.1 筛选培养基： 酪素培养基 1.1. 2.2营养培养基： 肉汤培养基 1.1. 2.3鉴别性培养基 （1）淀粉培养基 （2）明胶培养基
（3）葡萄糖发酵培养基 （4）葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。 1.2 方法 1.2.1 菌种的筛选 1.2.1.1 培养基的配置及灭菌 按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。 1.2.1.2 涂布分离 称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化 观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。 将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备 在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变
产碱性蛋白酶菌株的分离鉴定 摘要：碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。本文综述了产碱性蛋白酶菌株的研究现状，包括生产菌株的来源、菌株的分离方法以及菌株的鉴定方法，并对其前景进行展望。 关键词：碱性蛋白酶、菌株、分离、鉴定 Isolation and Identification of Alkaline Protease-producing Strains Wensi Hou (Yanshan university , Liren college , Hebei 066004) Abstract：Alkaline protease is a group of important industrial enzyme and has been widely applied in food industry, medical treatment, detergent industry, leather producing, brewing and other fields. This paper reviews the research status of alkaline protease producing strains, including the methods of isolated strains, strain sources and methods of identified strains. This paper also discusses its prospect. Key words:Alkaline protease ; strains ; isolation ; identification 1．碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60℃以下。 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活性基团,因此,一些金属离子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)
高产蛋白酶的芽孢杆菌菌株选育 学校河北农业大学 专业生命科学学院 姓名xxx 学号x 指导老师x 同组人员x 二〇一三年十二月二十五日 （河北农业大学生命科学学院，河北保定，071000） 摘要：目的：通过筛选诱变选育高产蛋白酶，为食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业提供材料基础。方法: 通过在富含蛋白质的场所的针对性采集土样，菌落平板筛选结合紫外线诱变育种，选育高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过一系列鉴别性培养基鉴
定其生理生化特性，查找其种属。结果：通过筛选得到一诱变菌种，通过伯杰氏手册鉴定其为枯草芽孢杆菌属。诱变90s后，其蛋白酶活性提高最大。 关键词：高产蛋白酶芽孢杆菌诱变鉴定 引言：蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以树林土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，筛选得到高产蛋白酶菌株。 High protease of Bacillus Strain Breeding Abstract:Objective: by screening the mutation breeding of high yield protease, food, pharmaceutical, cosmetics, detergent, spinning, fur softening provides basic material industry. Methods: the protein rich places for collecting soil samples, colony plate screening combined with ultraviolet mutagenesis breeding, breeding of high yield protease of Bacillus, cultivate their physiological and biochemical characteristics based identification through a series of differential, find the species. Results: by screening a mutagenic strain, through Berger's manual was identified as Bacillus subtilis. Mutation in 90s, the protease activity increased. Keywords: high yield protease from Bacillus mutagenesis and identification 目录
中图分类号：TS2；文献标识码：B；文章篇号:1007-2764(2006)01-0091-036 黑曲霉果胶酶产生条件的初步研究 周建琴 (江苏食品职业技术学院生物工程系，江苏淮安 223001) 摘要：本文报道了黑曲霉A3.1在麦麸固体培养基的产酶条件，在不同氮源试验中以(NH4)2SO4为最佳，该菌产酶的最佳条件为28℃，含水量45%，起始pH5.0，时间3d。 关键词：黑曲霉；果胶酶；固体培养基 Producing Conditions of Pectinase in Aspergillus niger Zhou Jian-qin (Jiangsu Food Science College, Huaian 223001, China) Abstract: This paper reported the best fermentation condition of pectinase by Aspergillus nigerA3.1 on wheat bran solid medium. The best nitrogen source of medium was (NH4)2SO4. The optimum enzyme-producing conditions were 45% water content, initial pH 5.0 at 28℃ for3 days Keywords: Aspergillus niger; Pectinase; Solid medium 果胶酶在食品和酿造工业有广泛应用，目前普遍采用此酶澄清制备果汁。许多微生物都有产生果胶酶的能力，但研究和应用较多的是真菌果胶酶。黑曲霉属于国际上认为较安全的菌种，其生产的果胶酶系组分较全[1]，本实验研究了黑曲霉生产果胶酶的条件。 1 材料和方法 1.1 菌种 黑曲霉A3.1，由本实验室2000年从土中分离得到的黑曲霉经过初步筛选得到。菌种在28℃下在马铃薯葡萄糖琼脂斜面上培养5d后备用。 1.2 果胶酶的制备 在250ml的三角瓶中加入麦麸皮4.5g，桔皮粉0.25g，2.0%（NH4）2SO45ml，调pH至5.0，高温灭菌30min后冷却至30℃，接入斜面孢子一环，28℃培养3天成曲后加自来水50ml于35℃浸泡2h，过滤，滤液即为果胶酶液。 1.3 果胶酶活力测定 取0.25%果胶溶液（以pH=3.5，0.05mol/LNaH2PO4 -0.025mol/L柠檬酸缓冲液配制）0.5ml于试管中，50℃水浴稳定后加入适当稀释的酶液0.2ml，保温30min,采用Somogyi[2]方法测定水解产生的还原糖。 在上述条件下，底物产生1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(u)。 收稿日期：2005-09-04 2 结果 2.1 氮源对产酶的影响 在培养基中添加各种含氮化合物进行产酶试验,表1结果说明添加含氮化合物能促进酶的合成，无机氮较有机氮效果显著，以硫酸铵最佳。 表1 各种含氮化合物对产酶的影响 酶活单位：(单位/g) 含氮物含量%酶活含氮物含量%酶活 NH4Cl 1.0 1400 尿素 1.3 1010 NH4NO3 1.5 1398 鱼胨 1.0 1109 (NH4)2HPO4 2.5 1455 酵母膏 1.5 736 (NH4)2SO4 2.0 1570 对照0 710 NaNO3 2.5 1008 注：含量为含氮化合物在培养基中的含量 2.2 培养基含水量对产酶的影响 制备不同含水量的培养基进行产酶试验。表2结果表明，适于该菌产酶的含水量范围为35~50%，以45%为最佳。 表2培养基含水量对产酶的影响 酶活单位：单位/g 含水量%25303540 45 50 5560酶活1202142014521486 1496 148613991208 2.3 培养基起始pH对产酶条件的影响 将培养基用硫酸和氢氧化钠溶液调pH至不同值，进行制曲试验。表3结果表明，该菌对培养基的起始pH要求不严。 (下转第94页) 91