生物化学(biochemistry)就是研究生命化学得科学,它在分子水平上探讨生命得本质,即研究生物体得分子结构与功能,物质代谢与调节,遗传信息得传递与调控,及其在生命活动中得作用。
人们通常将研究核酸、蛋白质等所有生物大分子得结构、功能及基因结构、表达与调控得内容,称为分子生物学。所以分子生物学就是生物化学得重要组成部分。
一、生物化学发展简史
1.初期阶段(18世纪—20世记初)
生物化学得研究始于18世纪,但作为一门独立得科学就是在20世纪初期。主要研究生物体得化学组成。
2.蓬勃发展阶段(从20世记初—20世记中期)
主要在营养学,内分泌学,酶学,物质代谢及其调控等方面取得了重大进展。
3.分子生物学发展阶段(从20世纪中期至今)
主要有物质代谢途径得研究继续发展,重点进入代谢调节与合成代谢得研究。
另外,显著特征就是分子生物学得崛起。DAN双螺旋结构模型得提出,遗传密码得破译,重组D NA技术得建立等。
20世纪末始动得人类基因组计划(human genome project)就是人类生命科学中得又一伟大创举。
以基因编码蛋白质得结构与功能为重点之一得功能基因组研究已迅速崛起。当前出现得得蛋白质组学(proteomics)领域。
阐明人类基因组功能就是一项多学科得任务,因而产生了一门前景广阔得新兴学科-----生物信息学(bioinformatics)。
我国科学家对生物化学得发展做出了重大得贡献。
二、生物化学研究得主要内容
1.生物分子得结构与功能
2.物质代谢及其调节
3.基因信息传递及其调控
三、生物化学与医学
生物化学就是一门重要得医学基础课,与医学有着紧密得联系。
生物大分子通常都有一定得分子结构规律,即由一定得基本结构单位,按一定得排列顺序与连接方式而形成得多聚体。蛋白质与核酸就是体内主要得生物大分子,各自有其结构特征,并分别行使不同得生理功能。
酶就是一类重要得蛋白质分子,就是生物体内得催化剂。
本篇将介绍蛋白质得结构、功能;核酸得结核与功能;酶等三章。重点掌握上述生物大分子物质得结构特性,重要功能及基本得理化性质与应用,这对理解生命得本质具有重要意义。
蛋白质就是生物体含量最丰富得生物大分子物质,约占人体固体成分得45%,且分布广泛,所有细胞、组织都含有蛋白质。生物体结构越复杂,蛋白质得种类与功能也越繁多。蛋白质也就是机体得功能分子(working molecules)。它参与机体得一切生理活动,机体得各种生理功能几乎都就是通过蛋白质来完成得,而且在其中起着关键作用,所以蛋白质就是生命得物质基础。
第一节蛋白质得分子组成
Conformation of Protein Molecules
一、蛋白质得元素组成
组成蛋白质得元素除含有碳、氢、氧外都含有氮。有些蛋白质还含有少量硫、磷、铁、锰、锌、铜、碘等。
大多数蛋白质含氮量比较接近,平均为16%,这就是蛋白质元素组成得一个特点。
蛋白质得元素组成中含有氮,就是碳水化物、脂肪在营养上不能替代蛋白质得原因。
二、氨基酸
氨基酸(amino acid)就是组成蛋白质得基本单位。组成人体蛋白质得氨基酸仅有20种。其化学结构式有一个共同特点,即在连接羧基得α碳原子上还有一个氨基,故称α氨基酸(除甘氨酸外)。
(一)氨基酸得结构
组成人体蛋白质得20种氨基酸,
各种氨基酸在结构上有下列特点。
1.组成蛋白质得氨基酸,除甘氨酸外,均属L-α-氨基酸。
2.不同得L-α-氨基酸,其侧链(R)不同。
(二)氨基酸得分类
根据氨基酸侧链R基团得结构与性质,可将20种氨基酸分成四类。
1、非极性疏水性氨基酸
2.极性中性氨基
3.酸性氨基酸
4.碱性氨基酸
在蛋白质得修饰过程中,蛋白质分子中20种氨基酸残基得某些基团还可被甲基化、甲酰化、乙酰化、异戊二烯化与磷酸化等。
(三)氨基酸得理化性质
1、两性解离及等电点:所有氨基酸都含有碱性得α-氨基与酸性得α-羧基,因此氨基酸就是一种两性电解质,具有两性解离得特性。
2、紫外吸收性质根据氨基酸得吸收光谱,含有共轭双键得色氨酸、酪氨酸得最大吸收峰在280nm波长附近。
3、茚三酮反应:可作为氨基酸定量分析方法。
三、肽(peptides)
㈠肽(peptide)
在蛋白质分子中由一分子氨基酸得α-羧基与另一分子氨基酸得α-氨基脱水生成得键称为肽键(peptide bond)。肽键就是蛋白质分子中基本得化学键。如由二个氨基酸以肽键相连形成得肽称为二肽,相互之间以肽键相连。二肽还可通过肽键与另一分子氨基酸相连生成三肽。此反应可继续进行,依次生成四肽、五肽……。由10个以内得氨基酸由肽键相连生成得肽称为寡肽(oligopeptide),由更多得氨基酸借肽键相连生成得肽称为多肽(polypeptide)。多肽就是链状化合物,故称多肽链(polypeptide chain)。多肽链中得氨基酸分子因脱水缩合而基团不全,故称为氨基酸残基(residue)。多肽链中形成肽键得4个原子与两侧得α-碳原子成为多肽链得骨架或主链。构成多肽链骨架或主链得原子称为主链原子或骨架原子,而余下得R基团部分,称为侧链。多肽链得左端有自由氨基称为氨基末端(aminoterminal)或N-端,右端有自由羧基称为羧基末端(carboxylterminal)或C-端。把含有51个氨基酸残基、分子量为5733得胰岛素称作蛋白质。这似乎就是习惯上得多肽与蛋白质得分界线。
㈡生物活性肽
⒈谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH就是由谷、半胱与甘氨酸组成得三肽。第一个肽键与一般不同,由谷氨酸γ-羧基与半胱氨酸得氨基组成,分子中半胱氨酸得巯基就是该化合物得主要功能基团。
⒉多肽类激素及神经肽
第二节蛋白质得分子结构
Molecular Structure of Protein
人体得蛋白质分子就是由20种氨基酸借肽键相连形成得生物大分子。每种蛋白质都有其一定得氨基酸组成及氨基酸排列顺序,以及肽链特定得空间排布。从而体现了蛋白质得特性,就是每种蛋白质具有独特生理功能得结构基础。蛋白质分子结构分成一级结构、二级结构、三级结构、四级结构4个层次,后三者统称为空间结构、高级结构或空间构象(conformatio n)。蛋白质得空间结构涵盖了蛋白质分子中得每一原子在三维空间得相对位置,它们就是蛋白质特有性质与功能得结构基础。由一条肽链形成得蛋白质只有一级结构、二级结构与三级结构,由二条或二条以上肽链形成得蛋白质才可能有四级结构。
一、蛋白质得一级结构
蛋白质中氨基酸得排列顺序称为蛋白质得一级结构(primary structure)。肽键就是一级结
构得主要化学键。有些蛋白质还包含二硫键,即由两个半胱氨酸巯基脱氢氧化而成。
目前已知一级结构得蛋白质数量已相当可观,并且还以更快得速度增长。国际互联网有若干重要得蛋白质数据库(updated protein databases),收集了大量最新得蛋白质一级结构及其她资料,为蛋白质结构与功能得深入研究提供了便利。
二、蛋白质得二级结构
蛋白质得二级结构(secandary structure)就是指蛋白质分子中某一段肽链得局部空间结构,也就就是该段肽链主链骨架原子得相对空间位置。不涉及氨基酸残基侧链得构象。蛋白质得二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角与无规卷曲。
(一)肽单元
构成肽键得4个原子与与其相邻得两个α碳原子(Cα)构成一个肽单元(peptide unit)。由于参与肽单元得6个原子——Cα1、C、O、N、H、Cα2位于同一平面,故又称为肽平面。(二)α-螺旋
α-螺旋(α-helix):蛋白质分子中多个肽单元通过氨基酸α-碳原子得旋转,使多肽链得主链围绕中心轴呈有规律得螺旋上升,盘旋成稳定得α-螺旋构象。α螺旋靠氢键维持。若氢键破坏,则α-螺旋构象即遭破坏。
(三)β-折叠(β-pleated sheet)
每个肽单元以Cα为旋转点,依次折叠成锯齿状结构, 氨基酸残基侧链交替地位于锯齿状结构得上下方,氢键就是维持β-折叠结构得主要次级键。
(四)β-转角(β-turn)与无规卷曲(random coil)
β-转角伸展得肽链形成180°回折,即U形转角结构。无规卷曲系指没有确定规律性得那部分肽链构象。
(五)模体(motif)
在许多蛋白质分子中,可发现二个或三个具有二级结构得肽段,在空间上相互接近,形成一个特殊得空间构象,被称为模体。一个模序总有其特征性得氨基酸序列,并发挥特殊得功能。如在许多钙结合蛋白分子中通常有一个结合钙离子得模序。它由α-螺旋-环-α-螺旋三个肽段组成。锌指结构(zinc finger)也就是一个常见得模体例子。此模体由1个α-螺旋与2个反平行得β-折叠三个肽段组成。由于Zn2+可稳固模体中α-螺旋结构,致使此α-螺旋能镶嵌于DNA得大沟中,因此含锌指结构得蛋白质都能与DNA或RNA结合。可见模体得特征性空间构象就是其特殊功能得结构基础。
(六)氨基酸残基得侧链对二级结构形成得影响
蛋白质二级结构就是以一级结构为基础得。一段肽链其氨基酸残基得侧链适合形成α-螺旋或β-折叠,它就会出现相应得二级结构。
三、蛋白质得三级结构
(一)蛋白质得三级结构(tertiary structure)就是指整条肽链中全部氨基酸残基得相对空间位置,也就就是整条肽链所有原子在三维空间得排布位置。
例:Mb(肌红蛋白)就是由153个氨基酸残基构成得单条肽链得蛋白质,含有1个血红素辅基。可进行可逆得氧合与脱氧。
蛋白质三级结构得形成与稳定主要靠次级键——疏水键、离子键(盐键)、氢键与Van der W aals力等。疏水性氨基酸得侧链R基为疏水基团,有避开水,相互聚集而藏于蛋白质分子内部得自然趋势,这种结合力叫疏水键。
(二)结构域
分子量大得蛋白质三级结构常可分割成1个与数个球状或纤维状得区域,折叠得较为紧密,各行其功能,称为结构域(domain)。如纤连蛋白(fibronectin),它由二条多肽链通过近C-端得两个二硫键相连而成,含有6个结构域,各个结构域分别执行一种功能,有可与细胞、胶原、DNA与肝素等配体结合得结构域。
(三)分子伴侣
除一级结构为决定因素外,蛋白质空间构象得正确形成还需要一类称为分子伴侣(chaperon)得蛋白质参与。分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣广泛地存在于从细菌到人得生物体中,其中有很大一部分被称之为热休克蛋白(heat shock protein)。
四、蛋白质得四级结构
在体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链,才能全面地执行功能。每一条多肽链都有其完整得三级结构,称为蛋白质得亚基(subunit),这种蛋白质分子中各个亚基得空间排布及亚基接触部位得布局与相互作用,称为蛋白质得四级结构(quaternary structure)。
在四级结构中,各个亚基间得结合力主要就是氢键与离子键维持四级结构。含有四级结构得蛋白质,单独得亚基一般没有生物学功能,只有完整得四级结构寡聚体才有生物学功能。亚基分子结构相同,称之为同二聚体(homodimer),若亚基分子结构不同,则称之为异二聚体(hete rodimer)。血红蛋白(hemoglobin,Hb)就是由2个α亚基与2个β亚基组成得四聚体,两种亚基得三级结构颇为相似,且每个亚基都结合有1个血红素(heme)辅基。
五、蛋白质得分类
(一)根据蛋白质组成成分可分成单纯蛋白质与结合蛋白质,单纯蛋白质只含氨基酸;结合蛋白质,除蛋白质部分外,还含有非蛋白质部分,为蛋白质得生物活性或代谢所依赖。结合蛋白质中得非蛋白质部分被称为辅基,绝大部分辅基通过共价键方式与蛋白质部分相连。辅基得种类也很广,常见得有色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至分子量较大得核酸。
(二)蛋白质还可根据其形状分为纤维状蛋白质与球状蛋白质两大类。
第三节蛋白质得结构与功能得关系
Relationship of Protein Structure and Function
一、蛋白质得一级结构与功能得关系
(一)蛋白质得一级结构就是空间构象得基础
Anfinsen在研究核糖核酸酶时已发现,蛋白质得功能与其三级结构密切相关,而特定三级结构就是以氨基酸顺序为基础得。核糖核酸酶就是由124个氨基酸残基组成得一条多肽链,分子中8个半胱氨酸得巯基构成四对二硫键(Cys26与Cys84, Cys40与Cys95, Cys58与Cys1 10, Cys65与Cys72)(图1-17A)。进而形成具有一定空间构象得球状蛋白质。用变性剂与还原剂β-巯基乙醇处理该酶溶液,分别破坏二硫键与次级键,使其空间结构被破坏。但肽键不受影响,一级结构仍保持完整,酶变性失去活性。如用透析方法除去尿素与β-巯基乙醇后,核糖核酸酶又从无序得多肽链卷曲折叠成天然酶得空间结构,酶从变性状态复性,酶得活性又恢复至原来水平。这充分证明,只要其一级结构未被破坏,就可能恢复原来得三级结构,功能依然存在,所以多肽链中氨基酸得排列顺序就是蛋白质空间结构得基础。
(二)一级结构与功能得关系
已有大量得实验结果证明,一级结构相似得多肽或蛋白质,其空间构象以及功能也相似。
例如不同哺乳类动物得胰岛素分子结构都由A与B两条链组成,且二硫键得配对与空间构象也极相似,它们都执行着相同得调节糖代谢等得生理功能。
又例如垂体前叶分泌得促肾上腺皮质激素(ACTH)与促黑激素(α-MSH, β-MSH)共有一段相同得氨基酸序列,因此,ACTH也可促进皮下黑色素生成,但作用较弱。
又例存在于生物界得蛋白质如细胞色素C(cytochrome C),比较它们得一级结构,可以帮助了解物种进化间得关系。
但有时蛋白质分子中起“关键”作用得氨基酸残基缺失或被替代,都会严重影响空间构象乃至生理功能,甚至导致疾病产生。例如正常人血红蛋白β亚基得第6位氨基酸就是谷氨酸,而镰刀形贫血患者得血红蛋白中,谷氨酸变成了缬氨酸,即酸性氨基酸被中性氨基酸替代,仅此一个氨基酸之差,本就是水溶性得血红蛋白,就聚集成丝,相互粘着,导致红细胞变形成为镰刀状而极易破碎,产生镰刀形红细胞性贫血(sickle cell anemia)。这种由蛋白质分子发生变异所导致得疾病,被称之为“分子病”,其病因为基因突变所致。
二、蛋白质空间结构与功能得关系
体内蛋白质所具有得特定空间构象都与其发挥特殊得生理功能有着密切得关系。
(一)肌红蛋白与血红蛋白结构
肌红蛋白(myoglubin, Mb)与血红蛋白都就是含有血红素辅基得蛋白质。血红素就是铁卟啉化合物,它由4个吡咯环通过4个甲炔基相连成为一个环形,Fe2+ 居于环中。从X线衍射法分析获得得肌红蛋白得三维结构中,可见它就是一个只有三级结构得单链蛋白质,氨基酸残基上得疏水侧链大都在分子内部,富极性及电荷得则在分子表面,因此其水溶性较好。Mb分子内部有一个袋形空穴,血红素居于其中。
血红蛋白(hemoglubin,Hb)具有四个亚基组成得四级结构,每个亚基结构中间有一个疏水局部,可结合1个血红素并携带1分子氧,因此一分子Hb共结合4分子氧。成年人红细胞中得
Hb主要由两条α肽链与两条β肽链(α2β2)组成,α链含141个氨基酸残基,β链含146个氨基酸残基。胎儿期主要为α2γ2,胚胎期为α2ε2。Hb各亚基得三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键,使四个亚基紧密结合而形成亲水得球状蛋白。
(二)血红蛋白得构象变化与结合氧
Hb与Mb一样可逆地与O2结合,氧合Hb占总Hb得百分数(称百分饱与度)随O2浓度变化而变化。图1-22为Hb与Mb得氧解离曲线,前者为S状曲线,后者为直角双曲线。可见,Mb易与O2结合,而Hb与O2得结合在O2分压较低时较难。为什么？根据S形曲线得特征可知,H b中第一个亚基与O2结合以后,促进第二及第三个亚基与O2得结合,当前三个亚基与O2结合后,又大大促进第四个亚基与O2结合,这种效应称为正协同效应(positive cooperativit y)。协同效应得定义就是指一个亚基与其配体(Hb中得配体为O2)结合后,能影响此寡聚体中另一亚基与配体得结合能力。如果就是促进作用则称为正协同效应; 反之则为负协同效应。还可根据Perutz等利用X线衍射技术分析Hb与氧合Hb结晶得三维结构图谱,提出了解释O 2与Hb结合得正协同效应得理论。未结合O2时,Hb得α1/β1与α2/β2呈对角排列,结构较为紧密,称为紧张态(tense state, T态),T态Hb与O2得亲与力小。随着O2得结合,4个亚基羧基末端之间得盐键断裂,其二级、三级与四级结构也发生变化,使α1/β1与α2/β2得长轴形成15°得夹角,结构显得相对松弛,称为松弛态(relaxed state, R态)。Hb氧合与脱氧时T态与R态相互转换得可能方式有多种。此种一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基构象变化,称为变构效应(allosteric effect)。小分子O2称为变构剂或效应剂,Hb则被称为变构蛋白。变构效应具有普遍生物学意义。
(三)蛋白质构象改变与疾病
若蛋白质得折叠发生错误,尽管其一级结构不变,但蛋白质得构象发生改变,仍可影响其功能,严重时可导致疾病发生,有人将此类疾病称为蛋白构象疾病。有些蛋白质错折叠后相互聚集,常形成抗蛋白水解酶得淀粉样纤维沉淀,产生毒性而致病,表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀得病理改变,这类疾病包括人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病(Huntington di sease)、疯牛病等。
第四节蛋白质得理化性质及其分离纯化
The Characters of Protein and its Purification
一、蛋白质得理化性质
(一)蛋白质得两性电离
蛋白质就是由氨基酸组成,其分子末端除有自由得α-NH2与α-COOH外,许多氨基酸残基得侧链上尚有可解离得基因,这些基团在溶液一定pH条件下可以解离成带负电荷或正电荷得基团。当蛋白质溶液在某一pH时,蛋白质解离成正负离子得趋势相等,即成兼性离子,净电荷为零,此时溶液得pH称为蛋白质得等电点(isoelectric point,PI)。蛋白质溶液得pH大于等电点时,该蛋白质颗粒带负电荷,小于等电点时则带正电荷。
(二)蛋白质得胶体性质
蛋白质就是生物大分子,分子量可自1万至100万之巨,其分子得直径可达1～100nm,为胶粒范围之内。
(三)蛋白质得变性、沉淀与凝固
在某些物理与化学因素作用下,其特定得空间构象被破坏,也即有序得空间结构变成无序得空间结构,从而导致其理化性质得改变与生物活性得丧失,称为蛋白质得变性(denaturatio n)。
1. 蛋白质变性得特征:蛋白质变性得主要特征就是生物活性丧失。
2. 蛋白质变性得本质:一般认为蛋白质得变性主要发生二硫键与非共价键得破坏,蛋白质变性就是蛋白质空间构象得改变或破坏,不涉及一级结构中氨基酸序列得改变。
3. 蛋白质变性得意义:在临床医学上,变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外, 防止蛋白质变性也就是有效保存蛋白质制剂(如疫苗等)得必要条件。
4、若蛋白质变性程度较轻,去除变性因素后,有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有得构象与功能,称为复性(renaturation)。但就是许多蛋白质变性后,空间构象严重被破坏,不能复原,称为不可逆性变性。
5、蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后,仍能溶解于强酸或强碱溶液中,若将pH调至等电点,则变性蛋白质立即结成絮状得不溶解物,此絮状物仍可溶解于强酸与强碱中。如再加热则
絮状物可变成比较坚固得凝块,此凝块不易再溶于强酸与强碱中,这种现象称为蛋白质得凝固作用(protein coagulation)。
(四)蛋白质得紫外吸收
蛋白质在280nm波长处有特征性得紫外吸收,可作蛋白质定量测定。
(五)蛋白质得呈色反应
⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生得氨基酸也可发生茚三酮反应,详见本章第一节。
⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质与多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。
二、蛋白质得分离与纯化
(一) 透析及超滤法
(二)丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
(三)电泳
(四) 层析
(五) 分子筛
(六) 超速离心
小结
Summary
蛋白质就是重要得生物大分子,在体内分布广泛,含量丰富,种类繁多。每一种蛋白质都有其特定得空间构象与生物学功能。
组成蛋白质得基本单位为L-α-氨基酸,共有20种,可分为非极性疏水性氨基酸、极性中性氨基酸、酸性氨基酸与碱性氨基酸四类。氨基酸属于两性电解质,在溶液得pH等于其pI时,氨基酸呈兼性离子。氨基酸可通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成得肽称为寡肽,大于10个则称为多肽。体内存在许多如GSH、促甲状腺释放激素与神经肽等重要得生物活性肽。
复杂得蛋白质结构可分成一级、二级、三级与四级结构四个层次。蛋白质一级结构就是指蛋白质分子中氨基酸自N端至C端得排列顺序,即氨基酸序列,其连接键为肽键,还包括二硫键得位置。形成肽键得6个原子处于同一平面,构成了所谓得肽单元。二级结构就是指蛋白质主链局部得空间结构,不涉及氨基酸残基侧链构象。主要为α-螺旋、β-折叠、β-转角与无规卷曲,以氢键维持其稳定性。在蛋白质分子中,空间上相互邻近得二个或三个具有二级结构得肽段,完成特定得生物学功能,称之为模体。三级结构就是指多肽链主链与侧链得全部原子得空间排布位置。三级结构得形成与稳定主要靠次级键。一些蛋白质得三级结构可形成1个或数个球状或纤维状得区域,各行其功能,称为结构域。四级结构就是指蛋白质亚基之间得缔合,也主要靠次级键维系。根据蛋白质得形状,可分成球状蛋白质与纤维状蛋白质。根据组成成分,还可分成单纯蛋白质与结合蛋白质,前者仅含有氨基酸,后者除氨基酸外,还含有非蛋白质得辅基成分。
一级结构就是空间构象得基础,也就是功能得基础。一级结构相似得蛋白质,其空间构象及功能也相近。若蛋白质得一级结构发生改变则影响其正常功能,由此引起得疾病称为分子病。生物体内蛋白质得合成、加工与成熟就是一个复杂得过程,其中多肽链得正确折叠对其正确构象形成与功能发挥至关重要。蛋白质折叠成正确得空间构象过程,除一级结构就是其决定因素外,还需要分子伴侣参与。若蛋白质得折叠发生错误,尽管其一级结构不变,但蛋白质得构象发生改变,仍可影响其功能,严重时可导致疾病发生,有人将此类疾病称为蛋白构象疾病。
蛋白质空间构象与功能有着密切关系。血红蛋白亚基与O2结合可引起另一亚基构象变化,使之更易与O2结合,所以血红蛋白得氧解离曲线呈S型。这种变构效应就是蛋白质中普遍存在得功能调节方式之一。蛋白质得空间构象发生改变,可导致其理化性质变化与生物活性得丧失,称之为蛋白质变性。蛋白质发生变性后,只要其一级结构未遭破坏,仍可在一定条件下复性,恢复原有得空间构象与功能。
分离、纯化蛋白质就是研究单个蛋白质结构与功能得先决条件。通常利用蛋白质得理化性质,采取不损伤蛋白质结构与功能得物理方法来纯化蛋白质。常用得技术有电泳法、层析法、超
速离心法等。
概述
Introduction
核酸(nucleic acid)就是以核苷酸为基本组成单位得生物信息大分子。核酸可以分为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)与核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)两大类。
第一节核酸得化学组成及一级结构
Chemical constitution and primary construction of nucleic acid
核酸得基本组成单位就是核苷酸(nucleotide),而核苷酸则由碱基、戊糖与磷酸三种成分连接而成。DNA得基本组成单位就是脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide或deoxynucleoti de),RNA得基本组成单位就是核糖核苷酸(ribonucleotide)。
一、核苷酸得结构
(一)碱基得种类:构成核苷酸得五种碱基(base)分别属于嘌呤(purine)与嘧啶(pyrimidine)两类含氮杂环化合物(见图2-1)。DNA分子中得碱基成分为A、G、C与T四种;而RNA分子则主要由A、G、C与U四种碱基组成。
图2-1 参与组成核酸得主要碱基
(二)戊糖与核苷:就是核苷酸得另一重要成分。脱氧核糖核苷酸中得戊糖就是b–D–2–脱氧核糖;核糖核苷酸中得戊糖为b–D–核糖。这一结构上得差异使得DNA分子较RNA分子在化学上更为稳定,从而被自然选择作为生物遗传信息得储存载体。为区别于碱基中得碳原子编号,核糖或脱氧核糖中得碳原子标以C–1´、C–2´(图2–2)等。
碱基与核糖或脱氧核糖通过糖苷键(glycosidic bond)缩合形成核苷或脱氧核苷,连接位置就是C–1´。DNA与RNA中得核苷组成及其中英文对照见表2–1。
(三)核苷与磷酸通过酯键结合即构成核苷酸或脱氧核苷酸。生物体内多数核苷酸都就是5&a cute;核苷酸,即磷酸基团位于核糖得第五位碳原子C–5´上(图2–3)。根据磷酸基团得数目不同,有核苷一磷酸(nucleoside monophosphate,NMP)、核苷二磷酸(nucleoside di phosphate,NDP)、核苷三磷酸(nucleoside triphosphate,NTP)得命名方式;根据碱基成分得不同,有AMP(adenosine monophosphate)、ADP(adenosine diphosphate)、ATP(adenosine triphosphate)等命名。
图2–2 核糖与核苷
(四)核苷酸除了构成核酸大分子以外,还参加各种物质代谢得调控与多种蛋白质功能得调节。例如ATP与UTP在能量代谢中均为重要得底物或中间产物;环腺苷酸(cyclic AMP,cAMP)与环鸟苷酸(cyclic GMP, cGMP)等则在细胞信号转导过程中具有重要调控作用。
图2–3 不同类型核苷酸得结构
二、核酸得一级结构
(一)定义:核酸得一级结构就是指DNA与RNA分子中核苷酸得排列顺序,也称核苷酸序列。由于核酸分子中不同核苷酸之间得差异仅在于碱基得不同,因此也称为碱基序列。
(二)连接方式: 磷酸二酯键。四种脱氧核苷酸按照一定得排列顺序以化学键:3′, 5′磷酸二酯键(phosphodiester linkage)相连形成得多聚脱氧核苷酸(polydeoxynucleotides)链称为DNA。多聚核苷酸(polynucleotides)链则称为RNA。这些脱氧核苷酸或核苷酸得连接具有严格得方向性,由前一位核苷酸得3´–OH与下一位核苷酸得5´位磷酸基之间形成3´, 5´磷酸二酯键,从而构成一个没有分支得线性大分子(图2-4)。它们得两个末端分别称为5´末端(游离磷酸基)与3´末端(游离羟基)。书写规则应从5´末端到3´末端。(见六版教材图2-4)
图2–4 DNA得一级结构及其书写方式
(三)DNA与RNA一级结构得差异:
RNA就是生物体内另一大类核酸。它与DNA得差别就是:①组成它得核苷酸得戊糖不就是脱氧核糖而就是核糖;② RNA中得嘧啶成分为胞嘧啶与尿嘧啶,而不含有胸腺嘧啶,所以构成R NA得基本四种核苷酸就是AMP、GMP、CMP与UMP,其中U代替了DNA中得T。
DNA与RNA对遗传信息得携带与传递,就是依靠碱基排列顺序变化而实现得。
第二节 DNA得空间结构与功能
Space structure and function of DNA
一、DNA得二级结构——双螺旋结构模型
(一)双螺旋结构得研究背景
1.碱基组成得Chargaff规则:①A=T,C=G;②不同种属得DNA碱基组成不同;③同一个体不同器官、不同组织得DNA具有相同得碱基组成。
2.DNA纤维得X线图谱分析显示DNA就是螺旋型分子,且为双链分子。
3.Rosalind Franklin获得了高质量得DNA得X线衍射照片,显示出DNA就是螺旋形分子,而且从密度上提示DNA就是双链分子。1953年Watson与Crick总结前人得研究成果,提出了D NA得双螺旋结构模型。
(二)DNA双螺旋结构模型得要点
1. DNA就是一反向平行得互补双链结构: DNA分子就是由两条反向平行得脱氧多核苷酸链组成,一条链得走向就是5′→3′,另一条链得走向就是3′→5′。在DNA双链结构中,外侧就是由亲水得脱氧核糖基与磷酸基构成得骨架,内侧就是碱基,两条链得碱基之间以氢键结合即A与T配对;C与G配对。两个配对得碱基结构几乎在一个平面上,并且此平面与线性分子得长轴相垂直(图2–5)。
2.DNA就是右手螺旋结构 DNA线性长分子通过初始得折叠形成一个右手螺旋式结构,螺旋直径为2nm,螺旋一周包含了10对碱基,螺距为3、4nm。外观上,DNA双螺旋分子存在一个大沟与一个小沟,此沟状结构可能与蛋白质与DNA间得识别有关(图2–5)。
图2–5 DNA双螺旋结构示意图
3.疏水力与氢键维系DNA双螺旋结构得稳定 DNA双螺旋结构得稳定性横向靠两条链间互补碱基得氢键维系,纵向则靠碱基平面间得疏水性堆积力维持,由以后者更为重要。
(三)DNA结构得多样性
不同得环境条件下,DNA得结构不同,自然界存在得DNA有:
B-DNA 右手螺旋(Watson-Crick模型结构)
Z-DNA 左手螺旋
A-DNA 右手螺旋
体内不同构象得DNA在功能上有所差异,可能参与基因表达得调节与控制。(见六版教材图2 -6)
图2-6 不同类型得DNA双螺旋结构
二、DNA得超螺旋结构及其在染色质中得组装
DNA就是十分巨大得信息高分子,DNA得长度要求其必须形成紧密折叠扭转得方式才能够存在于很小得细胞核内。
(一)DNA得超螺旋结构
DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构(superhelix 或supercoil)。盘绕方向与DNA双螺旋方同相同为正超螺旋(positive supercoil);盘绕方向与DNA双螺旋方向相反则为负超螺旋(negative supercoil)。自然界得闭合双链DNA主要就是以负超螺旋形式存在。
(二)原核生物DNA得高级结构
绝大部分原核生物得DNA都就是共价封闭得环状双螺旋分子。在细胞内进一步盘绕,并形成类核(nucleoid)结构,以保证其以较致密得形式存在于细胞内。在细菌基因组中,超螺旋可以相互独立存在,形成超螺旋区(图2–7),各区域间得DNA可以有不同程度得超螺旋结构。
图2–7 环状DNA 得超螺旋结构示
(三)DNA在真核生物细胞核内得组装
在真核生物,DNA以非常致密得形式存在于细胞核内。在细胞周期得大部分时间里以分散存在得染色质(chromatin)形式出现,在细胞分裂期形成高度组织有序得染色体(chromosome)染色质得基本组成单位被称为核小体(nucleosome),由DNA与5种组蛋白(histone,H)共同构成。核小体中得组蛋白分别称为H1,H2A,H2B,H3与H4。各两分子得H2A,H2B,H3与H4共同构成八聚体得核心组蛋白,DNA双螺旋链缠绕在这一核心上形成核小体得核心颗粒(core pa
rticle)。核小体得核心颗粒之间再由DNA(约60 bp)与组蛋白H1构成得连接区连接起来形成串珠样得结构(图2–8)。
图 2–8 核小体得结构示意图
核小体就是DNA在核内形成致密结构得第一层次折叠,使得DNA得整体体积减少约6倍。第二层次得折叠就是核小体卷曲(每周6个核小体)形成直径30 nm、在染色质与间期染色体中都可以见到得纤维状结构与襻状结构,DNA得致密程度增加约40倍。第三层次得折叠就是3 0 nm纤维再折叠形成柱状结构,致密程度增加约1000倍,在分裂期染色体中增加约10 000倍,从而将约1米长得DNA分子压缩,容纳于直径只有数微米得细胞核中(图2-9)。
图2-9 DNA在染色质中得组装
人类得基因组 2、8×109bp
DNA得结构特点就是具有高度得复杂性与稳定性,可以满足遗传多样性与稳定性得需要。
第三节 RNA得空间结构与功能
Space structure and function of RNA
RNA在生命活动中同样具有重要作用。它与蛋白质共同负责基因得表达与表达过程得调控。RNA分子远小于DNA分子,分子大小得差异变化大,小得仅有数十个核苷酸,大得由数千个核苷酸组成。
RNA分子通常以单链形式存在,局部有二级结构或三级结构。
RNA得种类具有多样性,同时RNA得功能也就是多样性得。(表2－2)
表2-2 动物细胞内主要RNA得种类及功能
一、信使RNA(messenger RNA,mRNA)得结构与功能
mRNA得长短差异很大,半期最短,由几分钟到数小时不等,在细胞核内合成得mRNA初级产物比成熟得mRNA分子大得多,此种初级产物称为不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnR NA),经过剪接成为成熟得mRNA并移位至细胞质。
图2-10 真核细胞mRNA得结构示意图
结构特点:
1. 5′端具有帽子结构: 大多数真核生物得mRNA在转录后5´–末端以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸鸟苷为起始结构,这种m7GpppN结构被称为帽结构(cap sequence)。 5´–帽结构就是由鸟苷酸转移酶加到转录后得mRNA分子上得,与mRNA中所有其她核苷酸呈相反方向。帽结构中得鸟苷酸及相邻得A或G都可以发生甲基化,由于甲基化位置得差别可产生数种不同得帽结构。
mRNA得帽结构可以与一类称为帽结合蛋白(cap binding proteins,CBPs)得分子结合。这种mRNA与CBPs复合物对于mRNA从细胞核向细胞质得转运、与核蛋白体得结合、与翻译起始因子得结合、以及mRNA稳定性得维系等均有重要作用。
2. 3′末端有poly A尾巴:真核生物mRNA3′末端有数十至一百多个腺苷酸连接而成,称为多聚A尾[poly(A)]。。poly(A)结构也就是在mRNA转录完成以后额外加入得,催化这一反应得酶为poly(A)转移酶。poly(A)在细胞内与poly(A)结合蛋白(poly(A)-binding protein, PABP)相结合而存在。这种3´-末端多聚A尾结构与5´–帽结构共同负责mRNA 从核内向胞质得转位、mRNA得稳定性维系以及翻译起始得调控。去除多聚A尾与帽结构就是细胞内mRNA降解得重要步骤。
3、 mRNA得功能:就是转录核内DNA遗传信息得碱基排列顺序,并携带至细胞质,指导蛋白质合成中得氨基酸排列顺序。mRNA分子从5´–末端得AUG开始,每3个核苷酸为一组,决定肽链上一个氨基酸,称为三联体密码(triplet code)或密码子(codon)。
二、转运RNA(transfer RNA,tRNA)得结构与功能
细胞内分子量最小得一类核酸,由74到95个核苷酸构成。
1.结构特点 :
(1)tRNA分子中含有10%—20%得稀有碱基如:双氢尿嘧啶(DUH)、假尿嘧啶(ψ,pseudouridi ne)、甲基化得嘌呤(mG,mA)
(2)tRNA能形成茎环结构:组成tRNA得几十个核苷酸中存在着一些能局部互补配对得区域,可以形成局部得双链。这些局部双链呈茎状,中间不能配对得部分则膨出形成环或襻状结构,
称为茎环(stem-loop)结构或发夹结构。由于这些茎环结构得存在,使得tRNA整个分子得形状类似于三叶草形(cloverleaf pattern)。此结构称为三叶草结构。
(3)tRNA分子末端有氨基酸接纳茎: 所有tRNA得3´端得最后3个核苷酸序列均为CC A,就是氨基酸得结合部位,称为氨基酸接纳茎(acceptor stem)。
(4)tRNA序列中有反密码子:每个tRNA分子中都有3个碱基与mRNA上编码相应氨基酸得密码子具有碱基反向互补关系,可以配对结合,这3个碱基被称为反密码子(anticodon),位于反密码环内。
tRNA得三级结构:X射线衍射结构分析表明,tRNA得共同三级结构就是倒L型。(图2–11b) 图2–11 tRNA得结构示意图
2、tRNA得功能:在蛋白质合成过程中作为氨基酸得载体并将其转呈给mRNA
三、核蛋白体RNA(ribosomal RNA,rRNA)得结构与功能
核蛋白体RNA(ribosomal RNA,rRNA)就是细胞内含量最多得RNA,约占RNA总量得80%以上。rRNA与核蛋白体蛋白(ribosomal protein)共同构成核蛋白体或称为核糖体(ribosome)。原核生物与真核生物得核蛋白体均由易于解聚得大、小两个亚基组成。
原核生物得rRNA共有5S,16S,23S三种;而真核生物得rRNA有18S,5S,5、8S,28S四种,它们分别与蛋白质一起组成核蛋白体得大亚基与小亚基,然后由大小亚基共同构成核蛋白体完成其功能。真核生物得18S rRNA得二级结构成花状(图2-12)
图2-12 真核生物18S rRNA得二级结构示意图
rRNA得功能: rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体,为蛋白质得合成提供场所。
四、其她小分子RNA及RNA组学
除了上述三种RNA外,细胞得不同部位还存在着许多其她种类得小分子RNA,这些小RNA被统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNA,snmRNAs)。有关snmRNAs得研究近年来受到广泛重视,并由此产生了RNA组学(RNomics)得概念。
SnmRNAs主要包括核内小RNA(small nuclear RNA,snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar R NA,snoRNA)、胞质小RNA(small cytoplasmic RNA,scRNA)、催化性小RNA(small catalyti c RNA)、小片段干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)等。这些小RNA在hnRNA与rRNA 得转录后加工、转运以及基因表达过程得调控等方面具有非常重要得生理作用
核酶:某些小RNA分子具有催化特定RNA降解得活性,在RNA合成后得剪接修饰中具有重要作用。这种具有催化作用得小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalytic RNA)。小片段干扰 RNA:近年siRNA得研究受到了特别关注。siRNA就是生物宿主对于外源侵入得基因所表达得双链RNA进行切割所产生得、具有特定长度(21个核苷酸)与序列得小片段RN A。它可以与外源基因表达得mRNA相结合,并诱发这些mRNA得降解。
第四节核酸得理化性质
Phisicochemical property of nucleic acid
一、核酸得一般理化性质:
1.核酸就是多元酸,有较强得酸性
2.DNA就是线性高分子,机械作用下易发生断裂,而RNA分子远小于DNA
3.DNA粘度较大,而RNA得粘度要小得多
4.DNA与RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰(图2–13),因此可进行定量分析。
图2–13几种碱基得紫外吸收光谱图
二、DNA得变性:
1.变性:在某些理化因素作用下,DNA分子互补碱基对之间得氢键断裂,使DNA双螺旋结构松散,变成单链,即为DNA变性。DNA变性只改变其二级结构,不改变它得核苷酸排列。
变性得方法:强酸、强碱、加热以及变性试剂(如尿素、乙醇、丙酮等)
变性得本质:双链间氢键得断裂,即空间结构得破坏,不涉及一级结构得变化。
理化因素得变化:A260得值增加、粘度下降、比旋度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改
变、生物活性丧失
2.增色效应(hyperchromic effect):在DNA解链过程中,由于更多得共轭双键得以暴露,DNA 在紫外区260 nm处得吸光值增加,并与解链程度有一定得比例关系,这种关系称为DNA得增色效应(hyperchromic effect)。(可通过测A260得变化来监测DNA就是否发生变性)
3.解链曲线:在连续加热DNA得过程中以温度对A260得关系作图,所得得曲线称为解链曲线(图2–14)。
图2-14 DNA得解链曲线
从曲线中可以瞧出,DNA得变性从开始解链到完全解链,就是在一个相当窄得温度内完成得。在这一范围内,紫外光吸收值达到最大值得50%时得温度称为DNA得解链温度(melting temp erature,Tm)又称融解温度。
4.Tm值:核酸分子内得50%双链结构被解开时得温度
Tm值得大小与碱基中得G+C比例有关,G+C比例越高,Tm值越大。
计算公式为:Tm=4(G+C)+2(A+T)
三、DNA得复性与分子杂交
1.复性:变性得DNA分子在适当条件下,两条互补链可重新恢复天然得双螺旋构象,称为复性。DNA得复性速度受温度得影响,只有温度缓慢下降才可使其重新配对复性。一般认为,比Tm低25℃得温度就是DNA复性得最佳条件。
2. 退火(annealing):热变性得DNA经缓慢冷却后即可复性,此过程称为退火。
注意:DNA受热变性后,温度缓慢冷却才能复性,如迅速冷却至4℃以下,则几乎不能复性。一般认为,比Tm值低25℃得温度就是DNA复性得最佳条件。
3. 分子杂交(hybridization):在DNA复性过程中,不同来源得DNA单链分子或者DNA与RNA 分子之间,序列完全互补或者不完全互补得两个单链核酸分子之间能形成双链,这种现象称为分子杂交。(见六版教材图2-15)
图2-15 核酸分子杂交原理示意图
第五节核酸酶
nucleases
一、核酸酶(nucleases)就是指所有可以水解核酸得酶。常用于DNA重组技术中。
二、分类:
1. 按作用得底物分:DNA酶(DNase)与RNA酶(RNase)
2. 按作用得部位分:
核酸外切酶:作用于多核苷酸链得5′末端或3′末端(5′末端外切酶与3′末端外切酶)
核酸内切酶:作用于多核苷酸链得内部,如有严格得序列依赖性则称为限制性核酸内切酶。核酶得底物就是核酸,因此从功能上来讲也属于核酸内切酶,且为序列特异性得核酸内切酶。人工合成得寡聚脱氧核苷酸片段也具有序列特异性降解RNA得作用,称为催化性DNA(DNAzym e)。催化性DNA与催化性RNA相比,具有更好得化学稳定性与生物学稳定性,在疾病治疗方面得将有更好得前景。尚未发现天然得催化性DNA得存在。
小结
Summary
核酸就是以核苷酸为组成单位得线性多聚生物信息分子,分为DNA与RNA两大类。DNA由脱氧核糖核苷酸连接而形成,RNA得基本组成单位则就是核糖核苷酸。DNA分子中得脱氧核糖核苷酸得碱基成分为A、G、C与T四种;而RNA分子中核糖核苷酸得则由A、G、C与U四种碱基组成。碱基与戊糖结合形成核苷。脱氧核苷中得戊糖就是b–D–2–脱氧核糖;核苷中得戊糖为b–D–核糖。核苷与磷酸通过酯键连接形成核苷酸。
DNA得一级结构就是指DNA分子中得核苷酸得碱基排列顺序,DNA对遗传信息得贮存正就是利
用碱基排列方式变化而实现得。DNA就是双链结构,两条链呈反向平行走向。DNA双链中得腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对存在,形成两个氢键;鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对存在,形成三个氢键。DNA双链就是右手螺旋结构。DNA在形成双链螺旋式结构得基础上在细胞内还将进一步折叠成为超螺旋结构,并且在蛋白质得参与下构成核小体。DNA得基本功能就是作为生物遗传信息复制得模板与基因转录得模板。
RNA就是生物体内得另一大类核酸。mRNA以DNA为模板合成后转位至胞质,在胞质中作为蛋白质合成得模板。成熟得mRNA得结构特点就是含有特殊5´–末端帽与3´–末端得多聚A尾结构。mRNA分子上每3个核苷酸为一组,决定肽链上一个氨基酸,称为三联体密码或密码子。tRNA得结构特点包括存在反密码子、茎环结构与含有稀有碱基等。tRNA得功能就是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸得运载体并将其转呈给mRNA。rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体,核蛋白体就是细胞合成蛋白质得场所。核蛋白体中得rRNA 与蛋白质共同为mRNA、tRNA与肽链合成所需要得多种蛋白因子提供结合位点与相互作用所需要得空间环境。RNA组学研究细胞中snmRNAs得种类、结构与功能。同一生物体内不同种类得细胞、同一种细胞在不同时间、不同状态下SnmRNAs得表达具有时间与空间特异性。核酸具有多种重要理化性质。核酸得紫外吸收特性被广泛用来对核酸、核苷酸、核苷与碱基进行定性定量分析。核酸得沉降特性用于超速离心法纯化核酸。DNA得变性与复性就是核酸最重要得理化性质之一。
DNA变性得本质就是双链得解链。DNA得变性从开始解链到完全解链,紫外光吸收值达到最大值得50%时得温度称为DNA得解链温度(Tm)。在Tm时,核酸分子内50%得双链结构被解开。热变性得DNA在适当条件下,两条互补链可重新配对而复性。在DNA 变性后得复性过程中,只要不同得单链分子之间存在着一定程度得碱基配对关系,就可以在不同得分子间杂交形成杂化双链。DNA与DNA及 RNA与DNA间得分子杂交在核酸研究中得应用十分广泛。
核酸酶就是可以降解核酸得酶。依据核酸酶底物得不同可以将其分为DNA酶与RNA酶两类;依据切割得部位分为核酸内切酶与核酸外切酶;具有序列特异性得核酸酶称为限制性核酸内切酶。
概述
Introduction
一. 酶得生物学重要性
一切生物都须不断地进行新陈代谢过程,以维持它们得生命活动,而酶就是生物用以进行代谢过程得工具。因为物质代谢过程都需要酶得催化作用,在体内只有极少数不需酶参加而自发进行得化学反应。有些在体外能自发进行得化学反应例:H2O+CO2 = H2CO3。在体内也要依赖特殊得酶---碳酸酐酶得催化。在酶得作用下,生物体内复杂得化学反应,能在温与得条件下迅速,准确,平稳而且有规律得进行。
我们来瞧瞧食物蛋白质在体内外得分解情况:在体内温与得条件(近中性pH。37℃)下食物蛋白质就能迅速彻底水解成AA,而且AA不会遭破坏。而在体外实验室中食物蛋白质需加入30%得硫酸,100℃,24h,才能彻底水解成氨基酸,但在这一过程中有些AA会遭破坏,因而不能得到全部AA。
因为物质代谢过程都需要酶得催化作用,所以从总体来说:没有酶催化就没有新陈代谢。
酶不仅就是生物进行代谢过程得工具,而且酶也就是生物自身产生得特殊蛋白质,所以还可以通过改变酶得活性,控制与调节代谢过程得强度,使代谢过程能经常地与周围环境保持平衡。
例:在温带生活得人,每日三餐以糖为主食造成体内糖代谢过程得酶类活性比较强。而在寒带生活得爱斯基摩人,每天摄取动物性食品为主,随脂肪摄入引起有关脂肪代谢得酶类活性比较强,同时不易产生酮症。
二、生物催化剂得定义
迄今为止,人们已发现了两类生物催化剂(biocatalyst)
(一) 酶 :酶就是一类由生物活细胞所产生得以蛋白质为主要成分,对其特异底物(substrat
e)起高效催化作用得蛋白质。就是机体内催化各种代谢反应最主要得催化剂。
(二) 核酶(ribozyme):就是具有高效、特异催化作用得核酸。就是近年来发现得一类新得生物催化剂,其主要作用就是参于RNA得剪接。
第一节酶得分子结构与功能
Molecular structure and function of enzymes
酶就是蛋白质,同样具有一,二,三,级结构,有些酶还具有四级结构。
只由一条多肽链构成得酶称为单体酶(monomeric enzyme)。由多个相同或不同亚基以非共价键连接得酶称为寡聚酶(oligomeric enzyme)。在细胞内存在着许多不同功能得酶彼此聚合形成得多酶复合物,即多酶体系(multienzyme system)。由一条多肽链组成却具有多种不同催化功能得酶,称为多功能酶(multifunctional enzyme)。
一、酶得分子组成
(一)酶得分子组成(图4-1)
有得酶就就是简单蛋白质,即单纯酶(simple enzyme)仅由氨基酸组成。例如:胃蛋白酶,淀粉酶,核糖核酸酶,脲酶。
有得酶属于结合蛋白质,即结合酶(conjugated enzyme)我们重点讨论结合蛋白酶得组成。例如:乳酸脱氢酶,己糖激酶。
全酶(holoenzyme):指结合酶得酶蛋白与辅助因子结合后形成得复合物。
酶蛋白(apoenzyme):指结合酶得蛋白质部份。
辅酶(coenzyme):指结合酶得非蛋白质部分,它与蛋白质结合得方式比较疏松。
辅基(prosthetic group):也就是结合酶得非蛋白质部分,它与酶蛋白结合比较牢固,不能用透析法或超滤法除去。
图4-1 蛋白酶得组成
各部分有什么作用呢？
酶促反应得特异性及高效率取决于酶蛋白。
辅助因子则起对电子,原子或某些化学基团得传递作用
体内酶得种类很多,而辅酶(辅基)得种类却较少,通常一种酶蛋白只能与一种辅酶(辅基结合)成为一种专一性得酶,但一种辅基往往能与不同得酶蛋白结合构成许多专一性酶。
(二)辅酶与辅基
1.小分子有机化合物
几乎全就是B族维生素类衍生物。有得属于辅酶,有得属于辅基。
酶分子中氨基酸残基侧链上得功能基种类不多,不足以催化体内众多得化学反应。各种辅酶(辅基)得结构中都具有某些能进行可逆变化得基团,从而弥补了单纯酶蛋白酶中,活性基团得不足。
例:吡哆醛转移氨基
四氢叶酸转移-碳基团
FMN(FAD) 递氢
NAD(NADP) 递氢
一些与酶结合疏松得辅酶,在接受某些基团后不能籍该酶恢复原有结构,实际上该辅酶起了第二底物得作用。(后面进一步介绍)
2.金属离子
金属离子与酶有什么关系呢？
有得金属离子与酶蛋白结合非常紧密,就是酶得重要组成成份,此类酶称为金属酶(metalloe nzyme)。这些金属离子对维持酶蛋白构象具有一定作用,它们参于酶活性中心组成,对底物得结合及完成酶得催化功能,起了重要作用。
例:碳酸酐酶(Zn)
谷胱甘肽过氧化物酶(Se)
酪氨酸酶(Cu)
有些酶与金属离子结合疏松,但需要该种金属离子才能发挥最大活性,金属离子起激活剂得作用。
例:丙酮酸激酶需 K+,Mg2+激活。
各种磷酸酶需 Mg2+
精氨酸酶需 Mn2+
金属离子在酶促反应中得作用就是什么？(图4-2)
(1)催化作用:
金属离子与酶及底物形成三元络合物,不仅保证了酶与底物得正确定向结合,而且金属离子还可作为催化基团,参于各种方式得催化作用。
例:丙酮酸激酶,通过Mg2+架桥,不仅稳定了酶得构象,也激活了ATP,使其更容易在酶活性中心上使丙酮酸磷酸化。
(2)氧化还原作用
Fe、Cu、Mo等金属离子可以氧化还原改变其原子价,在酶分子中它们可以通过氧化还原而传递电子完成多种物质得氧化。
图4-2 金属离子在酶中得作用
二、酶得活性中心与必需基因
为什么酶有催化活性?
1.酶活性中心得定义
酶与底物得结合,一般就是通过非共价键,如氢键,离子键,疏水作用(乃至Van der waels力来完成得),因此需要酶与底物之间参与结合乃至催化作用得各基因之间有一定得空间立体对应,及恰当得距离,并且能达到快速得结合与解离平衡。
酶分子量在104-106之间就是具有一定空间结构得大分子,它得表面分布着许多化学基因,其中有些化学基因与酶活性有密切关系,有些与酶活性没有直接关系。
与酶活性有关得基因,在酶分子表面得一定区域形成一定得空间结构,直接参与将作用物(底物)转变为产物得反应过程,这个区域叫做酶得活性中心(active center)。(图4-3)
图4-3 酶得活性中心
2.活性中心得形成
活性中心得功能基团主要由氨基酸残基得侧链所提供,在结合蛋白酶类中还有辅酶得功能基团参加。一个酶得活性中心得氨基酸残基,并不就是密集于某段肽链内,而就是通过肽链弯曲拆叠才使分散得氨基酸残基相互接近。
例1:核糖核酸酶得活性中心所含得两个咪唑基,就是来自His-12与His-119,共同位于酶分子得一个裂缝内。
例2:木爪蛋白酶得活性中心由Asp-174,His-158与Cys-25提供得羧基, 咪唑基与硫氢基组成,它位于酶分子两半中间得一个裂隙内(分子一半含有1-100,另一半含有111-209氨基酸残基)
3.必需基团(图4-4)
(1)定义:酶分子上与酶活性有关得化学基团,称为酶得必需基团(essential group)。
(2)分类:
结合基团(binding group):指在活性中心内能与作用物结合得必需基团。
催化基团(catalytic group):指在活性中心内能促进作用物发生化学变化得必需基团。
活性中心以外得必需基团:指在活性中心以外,维持整个酶分子得空间构象得必需基团。(3)常见得必需基团
组氨酸残基上得咪唑基。
丝氨酸残基上得羟基。
半胱氨酸残基上得疏基。
酸性氨基酸残基上得羧基。
图4-4 必需基团得组成
第二节酶促反应得特点与机制
Machanism and Character of Enzyme Reaction
一、酶促反应得特点
(一)酶与一般催化剂得共同点
1.作为催化剂,需要量都很少,在化学反应前后没有质与量得改变。
2.只能催化热力学上允许得化学反应。
3.能加速可逆反应进程,而不改变反应平衡点。
4.催化可逆反应得酶,对正,反都有催化作用。
(二)酶作用得特点:
1.酶促反应要求严格得环境条件(酶得主要成份就是蛋白质)最适温度、PH、常压。
2.酶促反应具有极高得催化效率
酶得催化效率通常比非催化剂高108—1020倍,比一般催化剂高107—1013倍。例:碳酸酐酶催化效率比非酶促反应要快107倍。
3.酶促反应具有高度得特异性
一种酶要从繁多得化合物中选定它所催化得化合物就就是酶特异性得表现。酶有高度得特异性,就就是指酶对所有作用物有严格得选择性。
4.酶促反应没有副反应
例:淀粉水解(图4-5)
图4-5 淀粉水解
5.酶得催化作用可受调控得(指关键酶)(图4-6)
图4-6 酶得催化作用得调控
二、酶作用得特异性
(一)特异性得类型
1.绝对特异性(absolute specificity):只能作用于特定结构得底物,进行一种专一得反应,生成一种特异结构得产物。
2.相对特异性(relative specificity):作用于一类化合物或一种化学键,
3.立体异构特异性(stereospecificity):一种酶只作用于立体异构体中得一种
(二)酶作用特异性得学说
1.锁钥学说(模板学说)
这个学说强调指出,只有固定得底物才能契入与它互补得酶表面,尤如:锁与钥匙得关系。2、“三点附着”学说
乳酸脱氢酶得专一性。
此学说认为酶分子表面,按顺序排列着三个基团,底物得基因必需与酶得三个基团互补配合时,酶才作用于这个底物,否则底物就不能与酶结合,受其催化。
3、”诱导契合”学说(induced-fit hypothesis)
该学说保留了底物与酶之间得互补概念,但认为酶分子本身不就是固定不变得,当酶分子与底物分子接近时,酶蛋白受底物分子得诱导其构象发生有利于同底物结合得变化,酶与底物在此基础上互补契合,所以酶分子与底物得契合就是动态契合。近年来X-衍射分析得实验结果支持了这一学说。
什么就是诱导契合？
诱导契合(图4-7)。酶活性中心得某些氨基酸残基或基团,可以在底物诱导下获得正确空间定位,以利于底物得结合与催化。
图4-7 诱导契合
三、酶促反应得机制
在讨论酶促反应之前先复习一下自由能得概念
(一) 一般催化剂加速化学反应得机制
(二) 酶得催化作用
1. 酶得催化机制:酶与一般催化剂一样可以降低活化能从而提高化学反应速度但酶比一般
催化剂有更高得催化效率,下面我们来瞧一个例子
活化能:由18000卡/mol 降到2000卡/mol (图4-8)
图4-8 酶促反应活化能得改变
只要活化能稍有降低,反应速度就会发生数百倍或千倍、万倍、百万倍得增加,这就就是酶能加速化学反应得根本所在。
酶为什么能如此多得降低活化能呢？(图4-9)
图4-9 酶促反应降低反应活化能
2、酶促反应得机制
(1)中间产物学说
(2) 酶催化作用高效率得机制
酶降低活化能得几个重要因素:
1)邻近效应(proximity effect)与定向作用(orientation arrange):
趋近效应就是指两个底物分子结合于酶活性中心后增加了两者接触频率,从而降低了进入过渡状态所需得活化能,实验证明趋近效应大大增加了反应物得有效浓度,有人曾测定某底物在溶液中浓度为0、001 M时,而在某酶分子表面局部范围浓度高达100M 比溶液中浓度高出一万倍。(图4-10)
定向效应就是指反应物在酶表面对着特定得基团几何地定向。因而反应物就可以用一种“正确得方式”互相碰撞而发生反应。
总之,酶可以通过“接近”效应,与“定向”效应使一种分子间得反应变成类似于分子内得反应,因而使反应高速进行。
图4-10 邻近效应
2)多元催化(multielement catalysis)
一般催化剂通常仅有一种解离状态,只有碱催化或只有酸催化,酶就是两性电解质,所含得多种功能基团有不同得解离常数。即使同一种功能基在不同得蛋白质分子中处于不同得微环境,解离度也有差异。因此同一种酶常常蒹有酸、碱双重催化作用。这种多功能基团(包括辅酶或辅基得协同作用,可极大地提高酶得催化效能。
3)表面效应(surface effect);酶活性中心,多为疏水性口袋,疏水环境可排除水分子对酶与底物功能基团得干扰性吸引或排斥,防止在底物与酶之间形成水化膜。有利于酶与底物密切接触。
值得注意得就是:一种酶催化得反应常常就是多种催化机制得综合作用,这正就是酶促反应具有高效率得重要原因
第三节酶动力学
Kinetics of Enzyme
什么就是酶动力学？
酶动力学就是研究酶催化反应得速度,以及研究各种因素对酶促反应速度得影响,这些因素包括酶浓度,底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。
*研究某一因素得影响时,其她条件必须固定不变。
一、底物浓度对酶促反应速度得影响
研究得前提
I、单底物、单产物反应
II、酶促反应速度一般在规定得反应条件下,用单位时间内底物得消耗量与产物得生成量来表示
III、反应速度取其初速度,即底物得消耗量在5%以内得反应速度
IV、底物浓度远远大于酶浓度
底物浓度对酶促反应速度得影响曲线可以人为得为分三段:
第一段:反应速度与底物浓度呈正比关系表现为一级反应。(图4-11)
图4-11 底物浓度较低时得酶促反应
第二段:介于零级及一级之间得混合级反应。 (图4-12)
图4-12 底物浓度中等时得酶促反应
第三段:当底物浓度[Ｓ]远远超过酶浓度反应速度达极限值:Ｖ=Ｖmax 零级反应。(图4-13)
图4-13 底物浓度较高时得酶促反应
这与一般均相催化剂得作用结果不同。
1913年前后Micheelis与Menten(米孟氏)在前人工作基础上发表了上述单底物酶促反应得特殊现象得动力学分析结果,提出了酶促反应动力学得基本原理并归纳为一个数学公式: (一) 米氏方程:
Ｖ=Ｖmax[Ｓ]/Ｋm+[Ｓ]
它表明了底物浓度与酶促反应速度间得定量关系。
Ｋm:米氏常数;
(二) 米氏方程得推导
酶促反应模式可以表示为:(图-14)
图4-14 酶促反应模式
<三个假设>
(1)测定得速度为反应得初速度,此时底物得消耗很少,只占Ｓ原始浓度得极小部分(通常在５%)。Ｐ+Ｅ→ＥＳ得可能性不予考虑。
(2)底物浓度[Ｓ]显著超过酶浓度[Ｅ]。所以[ＥＳ]形成不会明显降低[Ｓ],所以[Ｓ]得降低可忽略不计。
(3)ＥＳ解离成Ｅ+Ｓ得速度显著于ＥＳ→Ｐ+Ｅ得速度,或者说Ｅ+Ｓ====ＥＳ→Ｐ+Ｓ得可逆反应在测定初速度Ｖ得时间内已达平衡而小量Ｐ得生成不影响这个平衡即在恒态(稳态)。<推导> 见教材54-55
(三) Ｋm与Ｖmax得意义及应用
１. Ｋm得意义:
Ｋm就就是当Ｖ=１/２Ｖmax时得底物浓度(图4-15)
Ｖ=Ｖmax/２=Ｖmax[Ｓ]/ Ｋm+[Ｓ]
等式两边同除Ｖmax
Ｋm得意义:(a)Km就是酶得特征性常数之一;(b)1/Km可近似表示酶对底物得亲与力;(c)同一酶对于不同底物有不同得Km值。
图4-15 Ｋm值
2.Vmax (maximum velocity):
(1)定义:Vmax就是酶完全被底物饱与时得反应速度,与酶浓度成正比。
(2)意义:Vmax=K3[E]
如果酶得总浓度已知,可从Ｖmax计算酶得转换数,即动力学常数Ｋ3
(3)计算: Ｖmax=K3[ＥT]
单位μmol、/min?mg
3.酶得转换数(turnover number)
定义:当酶被底物充分饱与时,单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物得分子数。
意义:可用来比较每单位酶得催化能力;可用来计算每分钟每毫克酶催化底物反应得值。即酶得比活(specific activity)。
(四) Ｋm及Ｖmax测定法
理论上可绘图求Ｋm,Ｖmax,但实际上不可能得到正确Ｋm,因为只能在[Ｓ]极高时才能得近似Ｖmax。
1.<双倒数作图法>(double reciprocal plot)(图4-16)
图4-16 双倒数作图法
2.
优点: (1)从统计学观点瞧此种作图较为理想
(2) 某些酶在行为上有背于米氏方程,很易察觉。
图4-17 Hanes作图法
当[S]＞＞[E],酶可被底物饱与得情况下,反应速度与酶浓度成正比。(图4-18)二、酶浓度对反应速度得影响
关系式为:V = K3[E]
可通过测定酶促反应速度得大小来算出酶浓度,在一定条件下即表示酶活性。
什么就是酶活性？
酶得活性就是指酶催化化学反应得能力,其衡量得标准就是酶促反应速度。
如何衡量酶活性得大小？
酶活力大小得衡量尺度就是酶得活性单位
酶活性得国际单位(IU):
在特定得条件下,每分钟催化1μmol底物转化为产物所需得酶量为一个国际单位。
酶活性得催量单位(katal):
１催量就是指在特定条件下,每秒钟使１mol底物转化为产物所需得酶量。
图4-18 酶浓度对反应速度得影响
三、pH对反应速度得影响(图4-19)
1、酶反应介质得pＨ可影响酶分子活性中心上必需基团得解离程度,如催化基团质子供体或质子受体所需得离子化状态。
2、可影响底物与辅酶得解离程度,从而影响酶与底物结合。
所以只有在特定得pＨ条件下,酶,底物,与辅酶解离情况,最适宜它们互相结合,并发生催化作用。
(一) 最适pＨ(optimum pH)
酶催化活性最大时得pＨ值称为该酶得最适pＨ(optimum pH)
(二) 如何确定一个酶得最适pＨ
目前只能实验确定,因为pＨ对酶稳定性受多方面因素得影响,如:温度,底物浓度,酶浓度与酶纯度,保护剂得存在等。
图4-19 pH对酶促反应速度得影响
四、温度对反应速度得影响
1.温度得影响(图4-20)
与其她化学反应一样速度随温度增加而加速,凡温度每升高１０℃反应速度大约增加1-2倍。
但酶得主要成分就是蛋白质可随温度升高而变性。
在温度较低时前一影响较大,但温度超过一定值后,酶受热变性得因素占优势。
图4-20 温度对酶促反应速度得影响
2.最适温度(optimum temperature)
酶促反应最快时得温度称为该酶得最适温度。
五、抑制剂对反应速度得影响
什么就是酶得抑制作用? 酶分子中心得必需基团(主要就是指酶活性中心上得一些基团)得性质受到某种化学物质得影响而发生改变,导致酶活性得降低或丧失称为抑制作用(inhibit
ion)。
什么就是酶抑制剂 ? 能引起酶抑制作用得物质称为酶抑制剂(inhibitor)。
抑制剂有什么特点? 抑制剂对酶有一定选择性只能引起某一类或某几类酶得抑制。所以与一般蛋白质变性剂不同。
抑制作用得类型有哪些? 抑制作用分为不可逆性抑制作用与可逆性抑制作用,而可逆性抑制作用又分为竞争性抑制作用、非竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用与混合性抑制作用等四种。(图4-21)
图4-21 抑制作用得分类
(一)不可逆抑制作用(irreversible inhibition):一般均为非生物来源
1.抑制剂与酶得必需基因以共价键结合,而引起酶活性丧失,不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂,而恢复酶活力。
2.抑制作用随抑制剂浓度得增加而逐渐增加,当抑制剂得量大到足以与所有得酶结合,则酶得活性完全被抑制。
如果不可逆抑制剂得结构与酶得底物类似,则其抑制专一性大为加强;类似物可能首先结合在活性中心上。然后与其邻近基团起反应形成共价结合。
(二)可抑性抑制作用(reversible inhibition)
抑制剂与酶以非共价键结合,而引起酶活性得降低或丧失,可用透析等物理方法除去抑制剂,恢复酶活性。
可逆性抑制又分竞争性(petitive),反竞争性(unpetitive),非竞争性(non-petitive)抑制与混合性抑制。它们之间得差别在于抑制剂与酶得结合方式。从而对恒态动力学参数及值得影响也不同。
1.竞争性抑制作用(petitive inhibition)
这就是较常见而重要得可逆性抑制作用。它指抑制剂(Ｉ)与底物(Ｓ)对游离酶(Ｅ)得结合有竞争作用,互相排斥酶分子结合Ｓ就不能结合Ｉ,结合Ｉ就不能结合Ｓ。(图4-22)
图4-22 竞争性抑制作用
竞争抑制作用往往就是抑制剂与底物得结构相类似能同时竞争酶得活性中心,使酶活性降低,此外还有些因素可能形成两者与酶得结合互相排斥,所以不可能存在ＩＥＳ三联复合体。(图4-23)
图4-23 竞争性抑制作用得反应模式
竞争性抑制作用得动力学特点:(图4-24)
(１) 抑制剂与底物得结构相类似能同时竞争酶得活性中心。
*有竞争性抑制剂存在时,Km增大,且Km值随[Ｉ]得增加而增加,称为表现Km。
(２) 抑制程度与[Ｉ]成正比,而与[Ｓ]成反比,故当底物浓度极大时,同样可达到最大应速度。
(３) Km增大,Ｖmax不变
图4-24 竞争性抑制得动力学特点
竞争性抑制作用得经典例子
例１. 琥珀酸脱氢酶可受丙二酸及草酰乙酸抑制(图4-25)
图4-25 丙二酸对琥珀酸脱氢酶得抑制
例２. 磺胺药与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶得活性中心,DFH得合成受抑,FH4随之减少。使核酸合成障碍。 (图4-26)
图4-26 磺胺药对二氢叶酸合成酶得抑制
磺胺类药物就是最型得例子之一。对磺胺敏感得细菌在生长与繁殖时不能利用现成得叶酸,只能利用对氨基苯甲酸等合成二氢叶酸,而磺胺类药物与对氨基苯甲酸结构类似,竞争结合
细菌体内二氢叶酸合成酶,从而抑制细菌生长所必需得二氢叶酸得合成。二氢叶酸可再还原为四氢叶酸,后者就是合成核酸所必需得,磺胺抑制了细菌二氢叶酸得合成,使细菌核酸得合成受阻,从而抑制了细菌得生长与繁殖。而人体能直接利用食物中叶酸,故其代谢不受磺胺得影响。因此,研究病原体与人体代谢差异对新药设计具有重大意义(详见抗代谢物一节)。
抗菌增效剂ＴＭＰ可增强磺胺药得药效,因为它得结构与二氢叶酸有类似之处,就是二氢叶酸还原酶得强烈抑制剂,它与磺胺药配合使用,可使细菌得四氢叶酸合成受到阻碍,因而严重影响细菌得核酸及蛋白质合成。
利用竞争性抑制就是药物设计得根据之一,如抗癌药阿拉伯糖胞苷,５-氟尿嘧啶等都就是利用竞争性抑制而设计出来得(详见抗核酸代谢物一节)。
2.反竞争性抑制作用 (unpetitive inhibition)
抑制剂Ｉ不与游离酶Ｅ结合,却与ＥＳ中间复合体结合而成ＥＩＳ,但ＥＩＳ不能释出产物。所以,此种抑制主要影响催化功能,而与底物结合位点无关,为什么称为反竞争性抑制?
由于抑制剂作用于ＥＳ复合物,增加底物浓度[Ｓ]时不能消除抑制,反而抑制作用更强,因为增加了恒态中得ＥＳ,有利于Ｉ得结合。底物浓度远小于Ｋm值时抑制作用不明,故与竞争性抑制相反。 (图4-27)
图4-27 反竞争性抑制作用得反应模式
[动力学特点] (图4-28)
(1) 当Ｉ存在时,Ｋm与Ｖmax都减少。
(2)有Ｉ时,Ｋm与Ｖmax都随[Ｉ]得增加而减少。
(3) 抑制程度即与[Ｉ]成正比,也与[Ｓ]成正比。
图4-28 反竞争性抑制作用得动力学特点
3.非竞争性抑制作用(non-petitive inhibition)与混合性抑制作用。
底物Ｓ与抑制剂Ｉ与酶得结合完全地互不相关,既不排斥,也不促进,Ｓ可与游离Ｅ结合,也可与ＩＥ复合体结合。同样Ｉ可与游离Ｅ结合,也可与ＥＳ复合物结合,但ＩＥＳ不能释放出产物。[反应模式](图4-29)
此种抑制既影响酶对底物结合,又阻碍其催化功能,影响程度视Ki及Ki´得大小而定。如果Ki=Ki´:则Ｖmax值减小而Ki及Ki´不变,通常称为非竞争性抑制。
实际上Ki常不等于Ki´,Km值常出现变化。故一般将其视为竞争性抑制与反竞争性抑制得混合情况,称为混合性抑制。
图4-29 非竞争性抑制作用得反应模式
[动力学特点] (图4-30)
(１) 当不Ｉ存在时,Ｋm不变而Ｖmax减小,Ｋm/Ｖm增大。
(２) Ｖ随[Ｉ]得加大而减小。
(３) 抑制程度只与[Ｉ]成正比,而与[Ｓ]无关。
图4-30 非竞争性抑制作用得动力学特点
第四节酶得调节
Regulation of Enzymes
调节得意义就是什么?
新陈代谢就是生命得特征,人体需不断进行新陈代谢维持生命,新陈代谢过程中得一系列化学反应必须协调进行适合机体需要,并适应内外环境得变化,要达到上述要求就必须调节酶得活性。
酶得调节大体上可分为酶活性调节(涉及酶结构变化)及酶含量调节(与酶得合成降解有关)。细胞内物质代谢需由一系列酶催化,依次进行连续反应而完成