05056888 200 100测试
主要用途
用于体外定量检测人体血清或血浆中的PCT (procalcitonin)。
Elecsys BRAHMS PCT检测可辅助临床早期诊断相关的细菌感染。
Elecsys和cobas e 免疫分析仪的工作原理是电化学发光免疫分析“ECLIA”。
临床应用
降钙素原（PCT）是由116个氨基酸组成的激素原，分子量大约为12.7kD。PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞）表达，经酶切分解为（未成熟）降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT1,2。细菌感染后PCT会明显升高。
动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT３。脓毒血症患者体内的PCT只含有114个氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro4。PCT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤其是重症脓毒血症和感染性休克5,6,7,8,9,10。PCT可作为脓毒血症的预后指标8,11,12,13，也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标14,15。
对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺
炎患者，PCT可作为抗生素选择以及疗效判断的指标。
检测原理
双抗体夹心法，总检测时间：18分钟
●第一次孵育：30μl样本、生物素化的单
克隆PCT抗体以及钌复合物标记a的单克隆
PCT抗体一起孵育，形成抗原抗体夹心复
合物。
●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠
微粒进行孵育，复合体与磁珠通过生物素
和链霉素的作用结合。
●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁
珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通
过ProCell被去除。给电极加以一定的电
压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器
测量发光强度。
●Elecsys软件自动通过定标曲线计算得到
检测结果。a)Tris(2,2’-bipyridyl)ruthenium(II)-co mplex (Ru(bpy){
2
3
}三联吡啶钌
试剂－工作溶液
M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶盖），每瓶6.5ml；包被链霉亲和素的磁珠微粒，
0.72mg/ml；防腐剂。
R1生物素化的Anti-PCT抗体（灰色瓶盖），每瓶9ml：生物素化的Anti-PCT抗体（小鼠源）约 2.0μg/mL，磷酸盐缓冲液95 mmol/L，Ph7.5;防腐剂。
R2 钌复合物标记a的Anti-PCT抗体（黑色瓶盖），每瓶9ml：钌复合物标记a的Anti-PCT 抗体（小鼠源）5.6 μg/mL；磷酸盐缓冲液
95 mmol/L，pH7.5;防腐剂。
Cal1 冻干的PCT定标液1（白色瓶盖），1瓶，每瓶4ml蒸馏水溶解：
PCT（重组）血清基质中浓度约0.10ng/mL;
防腐剂。
Cal2冻干的PCT定标液2（黑色瓶盖），1瓶，每瓶4ml蒸馏水溶解：
PCT（重组）血清基质中浓度约54ng/mL;
防腐剂。
PC PCT1冻干的PCT质控品1（米色瓶盖），1瓶，每瓶4ml蒸馏水溶解：
PCT（重组）血清基质中浓度约0.50ng/mL;
防腐剂。
PC PCT2冻干的PCT质控品2（褐色瓶盖），1瓶，每瓶4ml蒸馏水溶解：
PCT（重组）血清基质中浓度约10ng/mL;
防腐剂。
定标：不同批号试剂条码中编码有相应批号的定标值。
质控：不同批号的批特异性质控靶值和范围参见试剂盒附带的数值表。
警告和注意事项
仅用于体外诊断。
在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂操作的注意事项。所有废弃物必需按照当地法规进行处置。
专业人员可要求获得安全数据报告。
所有人源性物质必须视为有潜在感染性。
所有产品由献血员单体提供，经特殊制备而成，经检测HB S Ag、HCV抗体、HIV抗体，均为阴性。
所应用的检测方法经FDA认可或符合欧洲法令98/79/EC附件II列表A。
但由于任何实验方法都不能绝对地排除潜在感染的危险，故该产品仍需视作病人样本一样
仔细处理。接触者必须遵循健康专业机构相应的法规12，13。
若试剂超过保质期，则不能再使用。
避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产生气泡。
试剂处理
试剂盒（M,R1和R2）为即用型。
定标液和质控品
准确添加4ml蒸馏水复溶瓶内物质，垂直加盖静置15分钟。充分混匀并避免产生气泡。根据定标液和质控品的用量进行分装，可将复溶后的定标液/质控品转移到空的有盖小瓶中（CalSet/ControlSet Vials），并贴上标签，-20°保存备用。分装的定标液和质控品只能一次使用。
试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。
储存及稳定性
存放于2－8℃。
请垂直摆放Elecsys BRAHMS PCT试剂盒，确保仪器的自动搅拌器能够完全混匀磁珠微粒。
着在瓶盖上。
样本的采集和准备
下列类型的样本符合检测要求，并且样本量要充足。
血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管收集。
肝素锂和K3-EDTA抗凝的血浆都适用。
标准：斜率0.9-1.1，截距<±2倍分析灵敏度(LDL)，相关系数>0.95。
稳定性： 2–8°C可保存24小时；-20℃可保存3月，一次冻融。
标本采集后建议在24小时内完成检测，否则应-20℃冰冻保存。
冻融标本的检测回收率可降低约8%。
选择合适的试管进行不同类型样本的采集，不是所有的试管均可用于检测。不同厂商的样本采集系统可能含有不同的物质，某些情况下会影响检测结果。
如果使用原始管进行检测（样本前处理系统）时，应遵循生产商所提供的指导。有沉淀和冰冻的样本检测前必须先作离心处理。
添加叠氮化合物的样本和质控品均不能使用。检测前，样本、定标液及质控品须室温平衡(20–25°C)。
由于蒸发因素的影响，样本、定标液及质控品在分析仪上的检测必须2小时内完成。
提供的物品
参阅“试剂－工作溶液”章节。
·2 个条码卡
·质控条码
·4×8 小瓶标签
·4 个有标签的有盖小空瓶
需要的物品（未提供）
?货号11776576, CalSet Vials, 有盖小空瓶规格2 x56
?货号03142949, ControlSet Vials, 有盖小空瓶规格2 x56
?实验室基础设备
?Elecsys 2010 、MODULAR ANALYTICS E170或cobas e分析仪
Elecsys 2010和cobas e 411分析仪所需材料：?货号11662988, ProCell, 6 x 380 mL ,系统缓冲液
?货号11662970, CleanCell, 6 x 380 mL,测量池洗液
?货号11930346, Elecsys SysWash, 1 x 500 mL 附加洗液
?货号11933159, SysClean 适配器
?货号11706802, Elecsys 2010 分析杯, 60 x 60 反应管
?货号11706799, Elecsys 2010 分析吸头,
30 x 120 移液管吸头
MODULAR ANALYTICS E170和cobas e 601分析仪所需材料：
?货号04880340,ProCell M, 2 x 2 L 系统缓冲液
?货号04880293, CleanCell M, 2 x 2 L测量池洗液
?货号03023141, PC/CC杯, 12个用于在检测前预热Procell M及Cleancell M。
?货号03005712,ProbeWash M, 12 x 70 mL 清洗液，用于在检测完毕后或更换试剂时
清洗试剂针。
?货号03004899, PreClean M, 5 x 600 mL 检测清洗液
?货号12102137,反应杯/吸头组合装,×84反应杯/吸头组合装48盒,废物袋
?货号03023150, WasteLiner,废物袋
?货号03027651,系统清洁适配器 M
所有分析仪需要：
?货号11298500, Elecsys SysClean, 5 x 100 mL 系统清洗液
检测
要优化检测性能，请遵照本说明书中有关分析仪的相关指导，并参照分析仪操作手册。
试剂使用前分析仪自动搅拌磁珠微粒，使其处于悬浮状态。试剂相关信息可通过条形码自动读取，在特殊情况下，分析仪无法自动读取条码信息时，请输入条码标签上的15位数字序列。
MODULAR ANALYTICS E170、Elecsys2010和cobas e分析仪：将冷藏试剂室温平衡至20°C 左右，放置分析仪的试剂盘（20°C）内。避免泡沫产生。分析仪能自动调节试剂温度和开、关各试剂盒瓶盖。
将复溶的定标液放置在分析仪的样本架上。定标时保证瓶盖开启。定标所需的信息都编码在条码上，分析仪会自动读取。定标液只能一次使用。
质控品（PC PCT1和PC PCT2）的信息都编码在质控条码上，分析仪会自动读取。质控品只能一次使用。
定标
溯源性：可溯源至BRAHMS PCT LIA 分析。
每套Elecsys BRAHMS PCT试剂的条码标签上均含有其批号特异的定标信息。
使用Elecsys BRAHMS PCT Cal1和Cal2定标，可调整符合分析仪要求的预定义定标曲线。定校频率：
不同批号试剂须使用Elecsys BRAHMS PCT Cal1, Cal2重新定标（新试剂盒在分析仪上放置不能超过24小时）。
以下情况建议重新进行定标：
?使用同一批号试剂，1月后（28天）
?7天后（同一试剂盒在分析仪上使用）
?根据需要：如失控。
质控
室内质控可使用Elecsys BRAHMS PreciControl PCT1和2。也可以使用其他合适的质控品。
质控品1和质控品2至少每24小时内检测一次，每次更换试剂盒或定标后也须进行质控。每个实验室可根据各自的情况设定合适的控制限和质控周期。质控值必须处于规定的控制限内。
若失控每个试验室必须采取相应的纠正措施。计算
仪器会自动计算每个样本中的分析物浓度，单位ng/mL。
干扰因素
检测结果不受黄疸（胆红素<428μmol/L或<25 mg/dl）, 溶血（血红蛋白<0.559mmol/L或< 0.900g/dl）, 脂血(脂肪乳剂< 1500mg/dl）和生物素<123nmol/L或<30ng/ml的影响。
回收率标准：回收率在初始值的±15％之内。对于接受高剂量生物素治疗的患者（> 5mg/天），必须在末次生物素治疗8小时后采集样本。
浓度达150IU/ml的类风湿因子对检测无影响。浓度高达1000ng/ml的PCT对检测不产生hook
效应。
体外对18种常用药物以及10种特殊药物进行
试验未发现会影响检测结果。
由于检测试剂中含有单克隆鼠抗体，因此某些接受单克隆鼠抗体治疗或诊断的患者样本检
测结果可能有误。
少数病例中极高浓度的链霉素抗体和钌会影
响检测结果。
试剂含有的添加成份减少了上述因素的影响。
除感染外，以下情况也会出现PCT水平的升高20：
?长时间或者重度心脏休克
?长期的器官重度不规则灌注
?小细胞肺癌或者甲状腺髓质C细胞肿瘤
?大面积外伤早期、外科手术和严重烧伤
?炎症细胞因子刺激和释放治疗
?新生儿（出生后48小时内）
作为诊断指标，必须结合患者病史，临床检查和其他临床资料来综合评估检测结果。
检测范围
0.02-100ng/mL（通过最低检出限和厂商定标曲线的最高值确定）。低于检出限的值报告<0.02ng/mL。超过检测范围的值报告>100ng/mL。
稀释
PCT浓度超过检测范围的样本可以用PCT阴性血清进行手工稀释。
推荐稀释比是1：4。稀释样本的浓度必须>1.0ng/mL。手工稀释的检测结果要乘以稀释倍数。
期望值
参考范围
使用Elecsys BRAHMS PCT检测492例表面健康者（其中245为男性，247为女性），得到正常参考值为O.O46ng/ml(95百分位点)。
临床Cut-off值
Elecsys BRAHMS PCT检测得到的结果和文献相符20。一项关于ICU病人的研究显示：
PCT<0.5ng/mL预示低风险的严重脓毒血症和/或感染性休克
PCT>2ng/mL预示高风险的严重脓毒血症和/或感染性休克
每个实验室应通过实验确定参考范围的适用性，必要时建立本实验室的参考范围。
临床性能
根据ACCP/SCCM (American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine)标准，对283例首诊的ICU病人进行分类：分为SIRS（全身炎症反应综合征）(95例)、脓毒血症(71例)、严重的脓毒血症(60例)和感染性休克(57例)22，检测PCT的结果如下:
性为66%，阳性预期值为78%，阴性预期值为
性为66%，阳性预期值为59%，阴性预期值为72%。
根据以上数据，临床敏感性为
85%，临床特异性为93%，阳性预期值为93%，阴性预期值为
性为93%，阳性预期值为70%，阴性预期值为62%。
特殊的性能指标
试剂在分析仪上的性能试验数据如下。各实验室由于具体情况不同，所得出的数据可能会稍有差异。
精密度
应用Elecsys试剂盒、人混合血清/血浆样本和质控品验证重复性，按照CLSI的EP5-A2执行：每天2次，共21天 (n=84)。
下面是获得的结果。
分析灵敏度
最低检出限
≤ 0.02 ng/mL
最低检出限是最低浓度标准品+2SD得到的浓度（厂商定标品1+2SD，批内精密度，n=21）。
方法学比较
使用人肝素抗凝血浆比较Elecsys BRAHMS PCT 分析(y)和BRAHMS PCT LIA分析（x)，相关性数据如下（ng/mL）：
比较标本数n=152
Passing/Bablok23线性回归
y = 1.065x - 0.090 y = 1.143x - 0.194
比较标本数n=185
Passing/Bablok 23
线性回归
y = 0.850x - 0.035 y = 1.090x - 0.709 τ = 0.953 r = 0.988 比较样品浓度约为0.4～85 ng/mL 。
分析特异性
Elecsys BRAHMS PCT 检测与下列物质不发生
功能灵敏度 ≤0.06 ng/mL
功能灵敏度是批间检测CV ≤20%时得到的最低分析物浓度。
与BRAHMS PCT LIA/sensitive Kryptor 分析的一致性
研究比较Elecsys BRAHMS PCT 分析和BRAHMS PCT LIA 。分别评价Cut-off 值为0.5ng/mL 和2 90%；Cut-off 值为2 ng/mL 时为两者的一致性为96%。
研究比较 Elecsys BRAHMS PCT 分析和 PCT sensitive Kryptor 分析。分别评价Cut-off 值为0.5ng/mL 和2 ng/mL 的一致性。
96%；Cut-off 值为2 ng/mL 时为两者的一致性为96%。
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本产品仅限独立或公众临床实验室内使用，不适合临床POCT使用（诸如病房或急诊床旁检验、医生办公室等）。不允许出售用于其它用途。
要了解更多信息，请参见分析仪有关的操作手册、各自的应用信息单、产品信息和所有必需
部件的包装插页。
本产品与B.R.A.H.M.S合作开发。
B.R.A.H.M.S PCT是BRAHMS Aktiengesellschaft的注册商标。
COBAS,COBAS E,ELECSYS和MODULAR是罗氏集团的商标。其他商标或产品是其所有者的商标。INTRALIPID 是Fresenius Kabi AB的商标。
页面空白处的变化栏显示明显的添加物或变化。已读入的试剂条形码参数的变化需手工编辑。
?2008 罗氏诊断
罗氏诊断产品（上海）有限公司
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书 注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。 需要自己配置的其他物品： 除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览：
产品概述： 特异性：TUNEL 反应优先标记凋亡产生的DNA 链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑 制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA 链断裂 实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻， 如细胞外元件可能阻止TdT 到达DNA 断裂处。两种情况均能产生假阴性。 假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA 片段 DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生 假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时， 细胞形态评估是一项重要的参数 样本：细胞离心涂片和细胞涂片 在chamber slides 上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒50T
步骤和所需材料： 1 流程图： 2 样品准备 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS） Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2 Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph ，新鲜配制 Permeabilisation solution 渗透液：%Triton1）X-100溶于%柠檬酸钠溶液 中，新鲜配制 步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。 组织部分 福尔马林-包埋组织 福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓 度、孵育时间和温度应按组织类型优化 注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸酶， 核酸酶可导致假阳性。 另外3中替代方法在下表中描述（step 2） 需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）
降钙素原在细菌感染中的变化及意义 【摘要】目的探讨降钙素原（Procalcitonin，PCT）在细菌感染中的变化及意义。方法纳入2011年4月至2012年4月我院住院的细菌感染患者55例，其中男30例，女25例，年龄26～72岁，平均（47.38±14.79）岁，其中肺部感染22例，胆道感染15例，泌尿系感染10例，外科术后感染8例，以上病例均在标本（包括血、尿、痰液、引流液及分泌物）中发现病原学证据。根据有无感染性休克和（或）多脏器功能衰竭分为轻度感染组和重度感染组两组；留取标本做细菌学培养，同时应用双抗夹心免疫化学发光法（ILMA）行PCT测定。比较分析轻症及重症患者PCT数据的差异性。结果在两组数据中，第3天与第1天的PCT结果比较有显著性升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。且重症感染组较轻症感染组升高更为显著，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论监测血清PCT浓度变化，可有助于早期发现细菌感染；也可早期发现重症感染或器官功能衰竭。以便及时选用有效抗生素和器官支持治疗，以提高危重患者抢救的成功率。PCT 浓度与细菌感染严重程度及病死率有相关性，高浓度PCT患者多出现感染性休克及多脏器功能衰竭。同时血流感染时，血清PCT浓度会明显升高。局灶性感染时，患者PCT升高不明显或轻度升高，血培养结果多为阴性。对指导临床治疗具有重要意义。 【关键词】 降钙素原；细菌感染；病死率 近年来，随着细菌感染方面研究的不断深入，降钙素原（Procalcitonin，PCT）在细菌感染的监测方面已成为研究热点。文献报道细菌感染时炎症反应在病变过程中起重要作用，同时导致降钙素原（PCT）增加，但他们之间的联系缺乏深入研究。本研究通过对55例细菌感染患者PCT水平进行观察，探讨细菌感染者血清降钙素原（PCT）的变化及意义。 1资料与方法 1.1一般资料2011年4月至2012年4月我院住院的细菌感染患者55例，其中男30例，女25例，年龄26～72岁，平均（47.38±14.79）岁，其中肺部感染22例，胆道感染15例，泌尿系感染10例，外科术后感染8例，以上病例均在标本（包括血、尿、痰液、引流液及分泌物）中发现病原学证据。根据有无感染性休克和（或）多脏器功能衰竭分为轻度感染组和重度感染组两组；轻症感染组为临床症状较轻，同时无感染性休克及多脏器功能衰竭；重症感染组为伴有感染性休克或多脏器功能障碍。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。 1.2方法留取标本做细菌学培养，同时应用双抗夹心免疫化学发光法（ILMA）行PCT测定。分别在留取标本之前或之后12 h内及住院第3天留取血液学标本，干燥管取静脉血2 ml，3000×g 5 min，取上层血200 μl，放入检测板中，30 min 后读取数据。以轻症及重症患者分组，比较分析PCT数据的差异性。 1.3统计学方法用SPSS 10.0软件进行数据分析，数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较应用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2结果 表1可见，在两组数据中，第3天与第1天的PCT结果比较有显著性升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。且重症感染组较轻症感染组升高更为显著，差异
降钙素的临床应用 人降钙素（Calcitonin，Ct)是由32个氨基酸构成的肽激素，主要是由甲状腺的滤泡旁C细胞分泌。它是在肝脏和肾脏中代谢，受到血清钙水平调节。生理性Ct对钙、磷代谢有影响。正常基础血清降钙素值应<10 pg/ml（或依据试剂说明书参考值）。 一、降钙素测定的临床应用： 1、主要用作肿瘤标志物，诊断甲状腺髓样癌（MTC）及进行MTC术后随访监测；在疑似MTC患者以及MTC的随访和管理中，降钙素测量得到广泛建议和实践。《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》建议，血清Ct>100 pg/ ml 提示MTC。 2、一些专家指出，他们对大部分或所有甲状腺结节患者进行降钙素筛查。ETA建议对所有具有甲状腺结节的患者进行降钙素筛查，而ATA并未表示支持或反对。对于甲状腺结节患者，Ct检测可用于早期诊断MTC，也可用于阴性排除MTC。虽MTC发病率低阳性值少，但阴性预测值高。 3、MTC手术前及手术后2周和6个月测定降钙素和CEA，如果基础及激发后降钙素水平均测不出，才能排除存在残留组织或复发的可能性。 4、多发性内分泌腺瘤病（MEN）II型（IIa及IIb型）90%以上合并MTC，而且是死亡的主要原因，故主张对所有嗜铬细胞瘤患者常规监测血清降钙素，以排除MTC和MENII的可能性。 二、降钙素临床适应症 1、甲状腺髓样癌诊断 CT可有效鉴别诊断MTC MTC初诊和复发患者CT浓度与健康对照组、甲状腺良性结节、其他甲状腺疾病具有明显的差异。
CT可增加MTC诊断的敏感度 a.细针穿刺活检- 降钙素检测甲状腺髓样癌的灵敏度比细胞学分析更高，尤其是大部分的甲状腺髓样癌。（见右图） b.为了避免假阴性甲状腺髓样癌，所有疑似甲状腺髓样癌的患者都须进行细针穿刺活检- 降钙素测量。 c.这种方法需要测量所有接受甲状腺细针穿刺细胞学检查的患者的血清降钙素。 2、甲状腺髓样癌随访
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、 Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH ）或细胞通透液（% Triton X-100 溶于% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl， pH ，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min； 注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理 4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的 Proteinase K（400μg/mL）处理5 分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即 蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透 液：%TritonX-100 溶于%柠檬酸钠，需新鲜配制） 替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min （胃蛋白酶：%%溶于HCl PH2，胰蛋白酶%%溶于HCl ）
降钙素原（PCT）检测及临床意义 一、概述： PCT是无激素活性的降钙素前肽物质，由116个氨基酸组成，分子量为13 KD的糖蛋白。PCT的半衰期为25-30小时，在体外稳定性很好。健康人血浆PCT含量极低. PCT选择性地对系统性细菌感染、真菌感染及寄生虫感染有反应，而对无菌性炎症和病毒感染无反应或仅有轻度反应。许多学者研究发现，全身性细菌、真菌和寄生虫感染时，PCT水平异常增高，增高的程度与感染的严重程度及预后相关，在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。PCT水平的监测，对于严重威胁生命的感染性疾病过程和跟踪治疗方案是很有用的，PCT浓度的升高标志着炎症反应正在进行中，使用足够的抗生素、炎症灶清除术治疗等，PCT值下降，证明治疗方案正确，预后良好，反之改变治疗方案。 PCT为所有不知病因的炎症性疾病的鉴别诊断提供帮助与支持，如细菌性与毒素性的急性成人呼吸窘迫综合症（ARDS）的鉴别；胆源性与毒素性胰腺炎的鉴别；细菌性与病毒性脑膜炎的鉴别；微生物诱导的发热与非细菌性发热的鉴别，特别是发热待查（FOU）的诊断，病毒感染或自身免疫失调与免疫抑制条件下的急性细菌感染的鉴别，发热的病因的鉴别，如在肿瘤患者中被肿瘤溶解物或化疗诱导与细菌、真菌或其他感染病因区别，早期诊断新生儿和婴儿全身性细菌感染与败血症引起的急性发热；术后常规，包括术后感染预警及用药监测，术后切除感染灶（如腹膜炎、软组织感染）后的治疗指导，监测腹膜炎、吻合口漏和无典型腹部症状的疾病过程；器官移植后的监测，移植前排除急性细菌或其他感染，鉴别急性器官排斥、急性病毒、细菌与真菌感染；长期在ICU的患者及长期机械通气患者的监测，监测疾病过程及指导治疗；监测高危患者，早期获得有关并发症和内环境衰退的信息。 许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT 在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用。 二、PCT分子生物学结构：PCT来自定位于第11号染色体上（11P15，4）单拷贝基因（与降钙素基因相关肽为同一基因）。该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长约7.6Kb。转录后经特定剪辑产生PCTmRNA，再翻译成降钙素原前体（Pre-PCT），在高尔基复合体及分泌囊中，经一系列水解酶作用最终形成PCT氨基酸多肽（aminoPCT），降钙素（CT）及羧基端21个氨基多肽（CT：CCP-1）。 三、血清 PCT来源及可能的生物学机制正常条件下人血清PCT含量极低，约2.5pg/ml（运用高效液相色谱分析），而成熟CT含量约6.3 pg/ml。髓质甲状腺肿瘤或其他神经内分泌肿瘤患者血清PCT及其组分均增高，组分相对含量也发生变化。在一些非甲状腺损伤如慢性肾衰、吸入性烧伤、急性细菌感染、中风、败血症等患者血清PCT及其组分也均增高，有些甚至成倍的上升，而CT略微升高，说明除甲状腺髓质细胞分泌贮存PCT外，仍有其他细胞具有这些功能。 血清PCT升高的可能的生物学机制：靶细胞（PBMCs等）在LPS各种败血症相关因子作用下应急分泌PCT，这种应急分泌超过细胞后转录过程（由Pro-CT分解为aminoPCT、CT、CT：CCP-1）或后转换过程缺少必需的水解酶，从而导致实验所观察到的PCT成倍增长，而CT水平不变或稍增高。四、检测方法及正常参考值范围目前除了费时不易自动化的凝胶层析法及高效液相色谱分析法，检测PCT较特异与敏感的分析方法有：双抗夹心免疫化学发光法（双抗夹心法）和放射免疫分析法（RIA）。 双抗夹心法运用双单克隆抗体，其一作为捕获抗体直接结合PCT96-106氨基酸残基即未成熟CT：CCP-1部分，另一作为示踪抗体直接结合PCT70-76氨基酸残基，即未成熟CT分子，人工合成的PCT作为标准。该方法比较特异无交叉反应，其检测最低为10pg·ml-1l，标准曲线线性范围为 10-60pg·ml-1。批内、批间变异系数分别为7℅和8℅。
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 一、试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 组份 (20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC 100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide 100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20 ℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。 3、Store at -20℃ for 12 months 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液 四、使用注意事项 1. 微量试剂取用前请离心集液。 2. Annexin V-FITC ，Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用。对于Annexin V-FITC 这个组份，建议您在收到产品之后，分装为小份避光保存于-20℃，即用即取。 3. Propidium Iodide （PI ）有毒，操作时要戴手套。 4. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。 5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而 用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。 6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每 次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、 操作方法 1. 悬浮细胞离心（2000rpm 离心5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不 易过长，否则容易引起假阳性）； -20℃避光 4℃避光 4℃
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书 货号：T2190 规格：20次 保存：-20oC保存，荧光标记液需避光保存。 产品简介： 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。产品内容： 1.TdT酶100μl 2.荧光标记液900μl 3.TdT酶稀释液(选用)500μl
凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(通用)（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本） 使用说明书 一、TUNEL制品说明 凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA 的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 本试剂盒特点 ●操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。 ●高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ●高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ●快速操作：整体操作约需3小时。 ●用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 ●方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。 ●高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性
使用注意事项 1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 6. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。 7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。 二、TUNEL试剂盒组分 试剂盒以外自备仪器和试剂
the MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB 11821598 322 100测试 主要用途 用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸 激酶同工酶MB含量。 电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏 Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。 临床应用1、2、3 肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不 同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。 血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如 急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可 持续较长时间，这取决于病情经过。 CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹 肌溶解症和中风。实验室诊断方面，测定总体 CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些 临床疾病。 CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。因此跟 踪测定非常有意义。 Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接 对抗人CK-MB的单克隆抗体。 检测原理 双抗体夹心法，总检测时间：18分钟 ●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗 CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB 特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗 体夹心复合物。 ●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠 微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之 间的反应结合到微粒上。 ●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将 磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物 质通过ProCell被去除。给电极加以一定 的电压，使复合体化学发光，并通过光电 倍增器测量发光强度。 ●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得 到检测结果。 a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)- complex (Ru(bpy){ 2 3 }三联吡啶钌 试剂－工作溶液 M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶 盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的 磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。 R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶， 10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小 鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L， pH值7.0；防腐剂。 R2 Ru(bpy)32+标记的抗CK-MB抗体（黑盖）， 1瓶，10mL；钌标记的抗CK-MB单抗 1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH 值 7.0；防腐剂。 警告和注意事项 仅用于体外诊断。 在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂 操作的注意事项。 所有废弃物必需按照当地法规进行处置。 专业人员可要求获得安全数据报告。 避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产 生气泡。 试剂处理 试剂盒为即用型，不能分开使用。 试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。 储存及稳定性 存放于2－8℃。 请垂直摆放Elecsys CK-MB试剂盒，确保使用 前仪器通过自动搅拌能够完全混匀磁珠微粒。 样本的采集和准备 仅以下罗列的样本通过检测要求。 血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管 收集。 肝素锂、肝素钠、K3-EDTA和枸橼酸钠抗凝的 血浆都适用。使用枸橼酸钠抗凝的血浆时，结 果必须按＋10％校正。 标准：回收率在血清值的90-110%以内或斜率 0.9-1.1＋截距<±2×分析灵敏度（LDL）＋相 关系数>0.95。 稳定性：18-23℃保存4小时，2-8℃保存8小时， -20℃保存3个月。 样本只能冰冻一次。
降钙素原（PCT）的检测时间:2010-06-04 13:45来源: 作者: 点击:195次字体大小: [ 大中小 大中小 核心提示:PCT是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。lt;BRg PCT是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。另外，PCT只是在少数患者的大型外科术后1~4d可以测到。 PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细菌移位可能引起诱导。 19.5.1指征 PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。 PCT的测定可以预示为： 作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。 监测有感染危险的患者（如外科术后和器官移植后免疫抑制期，多处创伤后）以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。 评价严重炎症性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。 19.5-1血清PCT在各种疾病中的类型 PCT升高PCT降低或稍微升高 细菌性感染伴随系统性炎症反应，例如：腹膜炎、软组织感染病毒感染，例如：乙肝，HIV，CMV 脓毒症，MODS 自身免疫性疾病和慢性炎症 全身性真菌感染过敏反应（类型I~IV）寄生虫感染（痢疾）局部局限性细菌感染、溃疡、浅表微生物移植发展 细菌引起的ARDS 中毒引起的ARDS 胆管引起的胰腺炎中毒性胰腺炎 细菌性脑膜炎病毒性脑膜炎 新生儿脓毒症局部微生物移植发展 外科大手术后的一些病例小或中等规模外科手术ARDS：成人呼吸窘迫综合征。 19.5.2检测方法 免疫发光测定法
罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒 是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。其 原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移 酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的 3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ） 反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的 细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。本 试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细 胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗 肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱 布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试 剂：试剂盒含： 1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、
2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、 3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP； 自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、 70%）、 DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、 Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ， pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。 三、实验步骤 操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反 应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。 具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min； 2.用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理 4.用 Proteinase K工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的
流式细胞仪 1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组 2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗 3，准备1X的annexin结合液，例如，对于10个实验来说，加1ml 5X annexin 结合液（组分C）到4ml 去离子水中 4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。没有使用的这部分工作液用于以后的实验。 5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备100ul 足够的体积。 6，加5ul Alexa Fluor 488 annexin V(组分A)和1ul 100ug/ml PI工作液（4步骤中准备的）到每100ul的细胞悬液中。 7，室温孵育细胞15min. 显微镜观察 1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组 2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗 3，准备1X的annexin结合液，例如，配置1ml，加200ul 5X annexin 结合液（组分C）到800ul去离子水中 4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。没有使用的这部分工作液用于以后的实验。 5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备足够的体积。 6，加5-25ul的annexin V缀合物（组分A）和1-2ul(100ug/ml)PI工作液到100ul 的细胞悬液中。高浓度的annexinV缀合物会产生较好的结果；最佳染色浓度需要凭借经验 7，室温孵育细胞15min 8，1X annexin 结合液清洗细胞 9，用一个合适方法使细胞固定在载玻片上，用一个适当的滤镜观察荧光效果。 细胞应该被分成3组：活细胞，凋亡细胞和死细胞。活细胞在细胞膜上有微弱的annexin V染色，而凋亡细胞在膜上有一个显著亮度，死亡细胞在膜上有annexin染色和核上的PI染色。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 产品简介： 碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。 细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(T dT-mediated d U TP N ick-E nd L abeling)法检测细胞凋亡的原理。 注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。 本试剂盒有如下优点。(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。 本试剂盒足够检测20个样品。 保存条件： -20℃保存，荧光标记液需避光保存。 注意事项： 需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于封片的抗荧光淬灭封片液(P0126)，用于固定的4%多聚甲醛或向碧云天订购免疫染色固定液(P0098)，同时需自备含0.1％ Triton X-100的PBS或向碧云天订购免疫染色洗涤液(P0106)。 如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯。蛋白酶K(ST533)可以向碧云天订购。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.对于贴壁细胞或细胞涂片： a.PBS或HBSS洗涤一次。 b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。 c.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。 d.用PBS或HBSS洗涤一次。 e.加入含0.1％ Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。 f.转步骤5。 2.对于悬浮细胞或细胞悬液： a.收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。 b.用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或 水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。 c.用PBS或HBSS洗涤一次。
翻译好的罗氏公司T u n e l 试剂盒操作说明方案 Final approval draft on November 22, 2020
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、 2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、 DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、
凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 （Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit） Cat number：KGA For Research Use Only Store at4℃for one year Expire date： 一、试剂盒说明 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。 二、试剂盒组份 组份Cat: KGA105 (10 assays) Cat: KGA106 (20 assays) Cat: KGA107 (50 assays) Cat: KGA108 (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光 Propidium Iodide 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光 Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4℃ 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液 四、使用注意事项 1．微量试剂取用前请离心集液。 2．Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。 3．Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。 4．本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不推荐用于检测组织样本。 5．推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS中，防止进一步的损伤。 6．细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。 7．因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、操作方法 1．悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）； 2．用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞；