一、 细胞培养的基本概念
体外培养：就是指将活体结构成分（如活体细胞、组织、器官等）甚至活的个体从体内或者其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中让其生长和发育的方法。
体内培养：就是将活体结构成分（如活体细胞、组织、器官等）甚至活的个体从体内或者其寄生体内取出,放在其他生物体内让其生长和改良的方法。
细胞培养的分类: 按培养对象分：
组织培养：是指从动物体内取出组织并模拟体内的生理环境，使之在体外人工条件下存活，生长和保持一定功能的技术。 “生长晕” 组织块（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）
细胞培养：将动物的某一个组织，如肝脏，肺，肾脏等取出，使其分散成单个细胞，在人工条件下（无菌，适温和一定营养条件下），使之存活，生长和繁殖的技术。
器官培养：使用器官原基、器官的一部分或整个器官，模拟体内的生理环境，使之在体外存活，生长和保持一定功能的技术。
（一）细胞培养的优点
1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动。
2.可控制：可控制-选择对象：均一性、重复性；类型：上皮？间质？--；性质：正常？肿瘤？--阶段：
可控制-调节条件：简化生长环境 方便施加各种实验因素
可控制-利用方法：采用各种研究技术、记录方法：
研究技术：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦 、显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记
记录方法：摄影照片、缩时电影、电视
3.应用广： 学科多：
对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类；一种动物：不同年龄；不同组织：肾脏 肝脏； 正常或异常（肿瘤）
4.较经济：可提供大量、同阶段、重复性好、生物学性状相似的实验对象。大规模的生物制品的生产，如：酶，单克隆抗体；大规模基因工程产品
（二）细胞培养的缺点：1.与体内主要不同：相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。2.主要表现：失去原有组织结构和细胞形态；分化减弱或不显；细胞趋向单一化 3.提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
（一）体内细胞生存的营养条件：1 水（80%以上） 溶剂、热稳定性和导热性、表面张力等 2 无机盐类 Na+ K+ Cl- Ca2+ Mg2+ 碳酸盐以及微量元素等 3 葡萄糖 主要的营养物质 ATP 糖元 无氧条件：C6H12O6---2C3H6O2+2ATP 有氧条件：C6H12O6---CO2+H2O+36ATP 4 维生素 5 氨基酸
（二）其它条件 如，温度（35-37℃） 氧 二氧化碳 酸碱度（7.36-7.44）体液渗透压
(280-310mOsm/kg)
(三)细胞之间的相互联系：如,激素 神经递质 局部化学介导因子 细胞增生的接触性抑制。
四）体外培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境：温度: 37 ℃；O2 ； CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO ← →H+ + HCO3-；pH: 7.2-7.4；渗透压3 无污染4 无毒
六、细胞培养实验的基本要求
1 实验前准备 详细的准备步骤、清单2 无菌室和操作野消毒3 无菌操作要求 养成严格的无菌操作素养：手指操作：操作端火焰消毒；动作要准确迅速4 实验中操作要求5 实验后要求 做好实验后的处理
七、细胞培养中的常用术语
原代培养；传代培养；外植块；细胞系；细胞株；克隆；体外（恶性）转化；再培养；贴壁率；饱和密度 群体倍增时间 ；汇合；细胞一代时间；
实验前的准备：玻璃器皿：培养瓶、培养皿、离心管、吸管等。塑料品：多孔培养板、培养皿等。金属器械：解剖刀、眼科剪和镊子等。其它：试管架、胶塞、吸头、酒精灯等。
一、清洗:细胞对任何有害物质都十分敏感，因此对新的或用过的培养器皿都要有严格的清洗。组织培养器皿清洗的要求比普通实验用器皿要高,每次实验后器皿都必须及时清洗,不同的器皿清洗方法和程序也有所不同,必须进行分别处理。
（一）玻璃器皿的清洗:整个玻璃器皿的清洗一般需要经过浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个大步骤。
1 浸泡;主要是软化器皿表面所附着的物质。 (1)生产工艺造成碱性、有害物质（如铅、砷以及灰尘等）和霉变。(2)浸泡 5%稀HCl 12小时 (3)刷洗 (4)冲洗（流水）
2 刷洗:除去器皿表面杂质。浸入水中煮沸（10min）-洗涤剂（洗衣粉）-煮沸（10min-刷洗 - 干燥
3 酸泡；利用氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物；清洁液（重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水） 浸泡24小时。
4 冲洗：自来水冲洗-沥水--蒸馏水冲洗--烘干
玻璃器皿完整的清洗步骤：5%HCl--刷洗--冲洗--清水煮沸--加洗衣粉煮沸--刷洗--冲洗--干燥--酸泡--冲洗--去离子水浸泡--蒸馏水冲洗--烘干--包装
（二）橡胶制品的清洗：去除胶塞等物上的硫磺等到有毒物质。
新的：0.5mol/l NaOH煮沸，流水冲洗，0.5mol/l HCl煮沸，流水冲洗，自来水煮沸2次，去离子水煮沸，50℃烘干。旧使用过的：先在水中浸泡，基本同玻璃器材。胶塞洗刷的重点部位是使用面，使用过程中不得与培养液接触。
（三）除菌滤器的清洗
不锈钢板式滤器、玻璃漏斗式滤器和微孔滤膜滤器。微孔滤膜滤器有可换膜式滤器和一次性滤器两大类。另又可分为正压滤器、负压滤器和针头式加压塑料小滤器。正压除菌滤器：稀洗涤剂刷洗、流水冲洗、沥水、去离子水浸
泡24小时、三蒸水浸泡24小时、干燥。
（四） 塑料制品清洗:稀洗液浸泡、流水冲洗、纱布或棉签刷洗、流水冲洗、晾干、清洁液、冲洗、去离子水浸泡2次、晾干。另外洗干净的器皿：2%NaOH、清水冲洗、2%HCl、自来水冲洗、重蒸水3小时、烘干备用。
三、包装 及时包装，以备消毒、灭菌、贮存。包装用品：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、特制玻璃消毒筒、大号培养皿、搪瓷杯等。注意事项：1小的先装盒再包裹，大的可直接包。2包装不宜过大。3复合器械，先尽量拆开。 4小的玻璃管道口要加棉花塞。5使用端密封，手接触端标志
四、消毒和灭菌
1 湿热消毒—压力蒸汽灭菌:目前最常用的一种灭菌方法。其通过高温高压及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。
手提式压力蒸汽灭菌器过程：1加水 2放入消毒物品 3加盖4打开排气阀，加热。5关闭排气阀6停止加热。7灭菌完毕。
2 高温干热灭菌:主要使用电热烤箱。不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌且不补高温损坏的玻璃器皿，金属器械以及不能和蒸汽接触的物品。另外，烧灼也是干热灭菌的方法之一。
3 紫外线消毒:实验室表面消毒最常用的一种方法。H：2.5m；0.06微瓦能量
注意：不能带人、畜、细胞等生物消毒。消毒后30分钟内不得进入。
4 滤过消毒:细菌过滤器——微孔薄膜过滤.适用范围：遇热易发生变性而失效的试剂或培养液。不锈钢和塑料式.关键：使用这种滤器重要的步骤是安装及无菌过滤过程。
5 电离辐射消毒:放射性核素产生的γ射线或电子加速器产生的加速粒子辐射物品以杀灭细菌微生物的方法。优点：不升温;穿透力强
6 消毒剂:是一种较为常用而方便的方法。适用范围：不能用物理消毒等方法进行消毒的场地和物品。如，无菌室的空气、台面，操作者的皮肤等。常用的消毒剂：甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯乙定，碘酒等等。
第二章 常用仪器设备
超净工作台 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪 微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广。
电热干燥箱：干热消毒（160℃ ，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒。
紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。
一、超净工作台
原理：利用鼓风机，驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，慢慢通过工作台面，在操作地形成无菌环境 气流：外流式和侧流式
测流式：空气经两次过滤净化后气流从上向下可从顶面流向两侧，气流通过操作区，将尘埃颗粒带走，形成了气流屏障。
0.32m/s-0.48m/s 100V 酒精灯火焰微动
注意事项：清洁滤器，紫外灯管。用前后用酒精（75%）擦拭台面。
二、水纯化装置 现多采用石英玻璃蒸馏器，各种规格使用方法不同，我们不做介绍。
三、抽气泵 一般不使用。 四、压力蒸汽消毒器 湿热消毒——高压锅。五、电热恒温培养箱
指的是普通的恒温培养箱。基本特点：可提供恒定的适宜培养物生长的温度。适用于细菌培养和封闭式细胞培养。
六、CO2培养箱 CO2培养箱设定的条件为37℃５％CO2。使用CO2培养箱培养细胞应注意问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
七、液氮生物容器 液氮罐 -196 ℃ 20天
八、电热恒温干燥箱：烘干和干热消毒玻璃器皿（50-300℃），带鼓风机和不带鼓风机两种。 50 ℃
九、离心机 低温低速离心机。 十、台式PH计 是一种精密仪器，小数点后2位 十一、倒置显微镜
十二、酶标仪、微孔板震荡器
第三章 动物细胞培养用液
动物细胞进行体外培养离不开其在体外生存、生长的各种溶液，此即培养用液。包括：培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、PH调整液和抗生素液等其它常用液。
一、蒸馏水的制备/培养用水
水是细胞体外生存最基本的环境条件。体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高，细胞培养用水的质量要求为电阻率在1×106 ??cm以上，双蒸馏水的水质刚刚达到这一标准。金属蒸馏器制备的蒸馏水，一般不作为培养用水。 去离子水不建议使用。 存放：棕色磨口试剂瓶。 现多购买使用。
二、缓冲溶液
缓冲液：由缓冲剂配制成的溶液在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲液。组成： 弱酸与弱酸强碱盐 弱碱与弱碱强酸盐 例：H2CO3/NaHCO3 Na2HPO3/NaH2PO3
理想缓冲液应有以下几个特点： ①能持续维持培养液的PH值恒定。 ②不干扰在培养液中进行的化学或生物化学反应。 ③不影响实验和观察。
三、生理盐水 最简单的生理盐水是，0.9%NaCl溶液，等渗。后期发展成为了现在的各种平衡溶液。
四、平衡盐溶液（BSS）及其配制：又叫盐溶液，集缓冲能力，生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。 主要成分：无机盐和G，另外含有少量酚红，酸碱度变化的指示剂。注意事项： ①Ca2+、Mg2+物质要单独溶解。 ②所选用的试剂尽量用GR试剂或AR试剂。 ③配制消化液时先用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液或是PBS液。④加入酚
红的量不得超过0.02g/1000ml。⑤配好后要分装，4℃保存，可配10×贮液，使用时过滤（滤器），不含G的可高压过滤。
标准及纯度， 一般化学试剂的品级：一级试剂、 二级试剂 、三级试剂、 四级试剂；国内标准名称：优级纯（保证试剂）、分析纯、化学纯、实验试剂 国内简写代号：GR AR CP LR；国内标签颜色：绿色 红色 蓝色 中黄色
五、天然培养基 包括各种动物血清、水解乳蛋白、胶原和组织提取液。
1血清：组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清,因为血清中含有丰富的营养物质,包括大分子的蛋白质和核酸等,对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些毒性物质的毒性起着一定的作用。血清的好坏也常常是实验成败的关键。
胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清最好，但较贵。
血清的重要作用： ①能提供细胞生存生长和增生所必需的生长调节因子。 ②能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。③含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成分。④提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。⑤在有些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
⑥给培养液提供良好的缓冲系统。 ⑦提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。
血清的不足之处：①存在不少有害于细胞生长和繁殖。例：补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等。②血清的成分不明确，影响对结果的分析。③不同动物，不同批次血清成分和活性差别比较大，使的培养结果不稳定。
血清一般不自制，如果特殊需要需自制时要注意：①消毒 ②空腹 ③隔绝 ④倾斜、室温、4℃过夜 ⑤离心 ⑥滤过，血清检测
2水解乳蛋白:为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然培养基，可用于许多细胞系和原代细胞培养。 淡黄色粉沫，易结块，溶液呈酸性。
配制：0.5g,Hanks,BSS,定容100ml,置室温下1-2h,高压灭菌,4℃,贮存。
使用：0.5%水解乳蛋白,37℃水浴预温后,无菌下与合成培养液1:1混合使用,即可培养。
3鼠尾胶原:能促进组织和细胞的附着,改善细胞生长表面特性胶原来源有尾腱,真皮和牛眼的水晶体，实验室常用大鼠尾胶原。 使用方法：①均匀涂于器皿的细胞生长面，不留液滴。 ②用氨水棉封口放于灭菌饭盒中 ③室温2h，氨气与鼠尾胶原作用，胶原凝固 ④BSS洗涤胶原面后，经细胞培养液浸泡过夜，37℃备用。
六、合成培养基
合成培养液是对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟。但这种模拟不是被动和不加选择的。而
是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的人工合成培养基。 合成培养基现有20多种，实际大多数cell培养选用的培养基仅七八种。如，TC199、DMEM、RPMI-1640、MEM等。
1 合成培养基的基本成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
（1）氨基酸 一般多为左旋（L-），有必须氨基酸，非必须氨基酸中的的谷氨酰胺，另外特殊需要加入其它氨基酸。是合成培养基的主要内容。
（2）碳水化合物 糖类为主，既是能量来源，也是合成某些氨基酸的原料。
（3）无机离子：培养基含有平衡盐液中的钾、钠等无机盐，有些培养基含有微量元素，如Fe2+、Zn2+、Ca2+等。
（4）维生素 各种维生素，包括脂溶性和水溶性维生素。
（5）其它成分 除了生长代谢所需的主要成分之外，为了优化生存环境，还添加一些其它成分。 如，核酸降解物（嘌呤和嘧啶类）；抗氧化剂（抗坏血酸、谷胱甘肽等）；还有难培养的细胞，可应用非特异性细胞生长刺激剂2-巯基乙醇。
2 配制 液体培养基，粉状培养基，参照说明书进行。
注意事项： ①严格按说明书进行。②不同厂家，批次，同一培养基比例可能不同。③三蒸水为三天内制备的（石英） ④不宜过量配制，不得有沉淀。⑤谷氨酰胺 ，碳酸氢钠有的需自行加入。
七、血清细胞培养基：要想使cell生长和繁殖，必需在人工合成培养基中加入一定量天然培养基，血清，谷氨酰胺等。另外，还有防止污染的抗菌素。 基础培养基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物质后叫细胞培养基或完全培养基，按血清含量又分为细胞生长培养基和细胞维持培养基。 组成见P43页。
八、无血清细胞培养基：由于血清成分的复杂性和易污染性，常常给研究带来了麻烦，无血清培养基的发现和使用保证了实验结果的准确性，稳定性，并减少了污染和简化了程序。
目前，常选用的无血清培养基多以合成培养基配成基础培养液，再补加其它成分。补加的成分主要有激素、生长因子、金属离子转移蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。
1 基础培养液：不少的合成培养液都可以做无血清培养液的基础培养基（见书）。最常用的是HamF12和DMEM混合液（1：1），再补加6-15mlHEPES与1.2g/L NaHCO3即可作为培养液。现已有商品化的DMEM/F12混合培养基粉剂出售，按说明书进行就可
2 补充成分：必需营养成分，酶抑制剂、生长基质等。有激素和生长因子，结合蛋白，贴壁因子等。
（1）激素：胰岛素、生长激素、胰高血糖素等、甾体激素等。生长因子：维持cell生存和增殖所必需的物质，依据化学性质可分为多肽
生长因子和甾体生长因子。如，EGF、TGF、NGF、FGF（2） 结合蛋白：转铁蛋白TF（结合Fe及其它有毒金属离子），白蛋白与其它脂类，金属离子，激素等结合后，具有刺激细胞增殖作用。（3） 贴壁因子：细胞体外培养时绝大多数真核细胞（贴壁依赖性细胞）需要固着于适当的基底，帮助细胞固着贴附的物质叫贴壁因子或胞外基质。
配制：①配贮液（10×）1mg/ml,适当温度保存 ②选择适当贴壁因子保存 ③三蒸水或PBS稀释，0.1mg/ml工作液 ④滤菌 ⑤涂布 ⑥静置，洗涤
3 微量元素 微量元素的增加较复杂，多采用商品包装，现多培养基中已加好无需再加。
无血清培养基内必需增加酶抑制剂来中止残余酶的作用。如，大豆胰酶抑制剂，0.1-0.5%
九 消化液 消化液中最常用的是胰蛋白酶液和EDTA液。 1 胰蛋白酶液
主要作用：使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。主要作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽腱。
活力 用解离酪蛋白的能力表示，常用有1:250，1：125两种。 PH8.0，37℃时作用力最强。
浓度有0.25%(m/v),0.125%,0.08%。 配制选用不含Ca,Mg离子的BSS液，终止用血清或胰蛋白酶抑制剂。
2 EDTA 属于化学螯合剂。具有一定消化作用，毒性小，价格便宜。用D-Hanks液配成0.02%工作液，常和胰蛋白酶混合使用。
原理：利用EDTA的螯合作用将组织间的Ca,Mg离子螯合掉破坏组织的完整性。
3 胶原蛋白酶液 原理：使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞离散。常和胰蛋白酶联用，效果不错。
十、PH调整液 NaHCO3溶液，不同浓度，7.4% 5.6% 3.7%。 10%醋酸液。 Hepes，非离子缓冲液，缓冲能力强，维持时间长，多采用20mmol/l的浓度
十一、L-谷氨酰氨 十二、抗菌素液
第四章 细胞原代培养
一、原代培养的概念
1 定义：从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养。
通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
2 含义①初次培养，不更换培养物的生长器皿；②原代培养中的“代”不是指细胞的“代”数，原代培养物中的细胞在接种之后，并不一定没有分裂增殖。；③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液也不等于不更换培养器皿。 ④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需用要分割培养物为较小的部分再培养。
二、原代培养的过程 取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养箱中培养。
1 取材及培养材料的制备
（1）准备工作：主要是对所涉及的器具、用品的灭菌以及实验者
、实验动物的清洁与消毒。①解剖器械和器具②工作台面③操作者④实验动物（2）取材及培养材料的制备①取目的组织块，洗涤、去脂、被膜、以及坏死组织。②1mm3组织块放于培养液中植块培养。③剪碎加入胰蛋白酶消化液。④将制成的细胞悬液用（不锈钢网筛）过滤。⑤离心。⑥弃上清液，将细胞溶液用少量培养液重新悬浮为细胞悬液。⑦用血细胞计数板计数细胞密度。 ⑧培养液调至期望密度，准备接种。（3）几种常用实验动物的取材:胚胎动物的取材：胚胎动物是体外培养常用的实验动物。由于胚胎生存于母体子宫内或者蛋壳内（鸟类），取材时主要注意对母体动物或者蛋壳进行消毒。
鸡胚：（38℃、40～70%湿度、21d）保存，4～10℃，10d a.将孵育一定时间的受精蛋取出，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。 b.受精蛋大头朝上，钝器击破，尽可能大些，去碎片，撕膜，暴露出尿囊绒毛膜后附着的血管。c.用弯镊子撕破尿囊绒毛膜，然后轻轻夹住鸡胚的颈部，托出鸡胚。放到事先盛有培养液的培养皿内。备用。
鼠胚：a.取一定妊娠天数的孕鼠，处死或麻醉。b.分别用碘酒与酒精棉球擦拭孕鼠腹部进行消毒。然后切开或剪开孕鼠腹部皮肤，暴露腹部肌肉。 c.沿腹中线切开或剪开腹肌，暴露内脏。用剪刀和镊子解剖出包含鼠胚的子宫，放置在一事先盛有培养用液的培养皿内，稍事清洗后， 换入另一培养皿内。d.撕破或剪开子宫，取出所有胚胎。置入一新的盛有培养用液的培养皿内，洗去血污。备用。
成年动物取材a.切取所要脏器或大组织块。对于带有鞘膜的器官如睾丸，取材时争取连同鞘膜一起切取。b.取后迅速置于冰冷的已加入抗生素溶液的培养液或平衡盐溶液中，在密封的容器内尽快运送到培养室处理。c.材料送到培养室以后，要尽快更换抗生素溶液并将组织块切成小块，然后放置到培养液中。备用。
皮肤标本取材:通过手术进行取材，取材时75%乙醇消毒两次（不能用碘酒），然后进行表皮层与真皮层的分离，消化，分别培养。
2 分离（散）细胞的方法
取材后，若要进行分离（散）细胞培养，紧接着的一个工作就是将所有取得组织分离成细胞悬液，方法有多种。最常用的是机械解离细胞法，酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
Ⅰ机械细胞分离法:主要适用于质地较软，内含纤维性成分较少，而且对机械分离较具耐受能力的组织，例如，胚胎组织，成年的脑组织、肝、肿瘤等。
抽吸法： 器材：细口径吸管、移液器、试管、培养瓶 步骤： ①洗涤 ②吸吹到组织块上至消散为止。 ③离心（1000r/m，5min） ④弃上
清，重制细胞悬液，计数。过网/筛法 器材：不锈钢网筛，粗大空针内芯，培养皿，烧杯，吸管，离心管
步骤： ①漂洗组织。 ②放置网筛，用内芯挤压过网进入下面的培养液中。③用网筛再次过滤，离心，1000r/min，5min。 ④再制细胞悬液，备用。
机械解离细胞法的优缺点：所需时间短，原则上这种方法对于分化程度较高的细胞如成熟的神经细胞、肌肉细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较低。使用时需根据不同细胞的耐受能力调整强度和时间。
Ⅱ消化分散法:采用低浓度胰蛋白酶或胶原酶对剪切成1mm3的组织块进行多次消化，使组织分散，细胞分离。配制时，一般使用不含Ca2+,Mg2+的平衡盐溶液或其它无Ca2+,Mg2+的缓冲溶液。 步骤（略）。
其它酶：链霉蛋白酶、透明质酸酶、粘蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及弹性蛋白酶等。
Ⅲ螯合剂解离法 螯合剂包括：EDTA-Na、柠檬酸钠、枸椽酸钠等。用无Ca2+,Mg2+的缓冲溶液配制，常与酶联用。
3 细胞计数 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数
4 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。
任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞较困难。
（1）细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力。克隆形成率＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
(2) 台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力，已淘汰。
(3) 四唑盐（MTT）比色法:四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物。溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。
操作步骤： （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）。（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲
线。
4 接种与培养
据培养类型和实验的具体要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶皿或培养板的各孔内。对于某些需要特定生长基质的细胞如N细胞，需要事先用生长基质物质包被培养瓶皿底壁或培养板，然后才能接种细胞。
用细胞悬液的量乘以细胞密度即可得出接种的细胞总数。
加足培养液，送入CO2培养箱内，静置2-3天，更换培养液一次。（注意颜色变化）
三、原代细胞培养方法的注意事项 1 培养液 ①培养基的选择 ②添加物 ③培养液的酸碱度 ④换液
2 培养空间:指培养物生存的空间，包括液相环境与气相环境两方面。给培养物提供足够大的空间对调节O2和CO2的比例是十分必要的。一般来说，培养液与液面上的空间二者之间的体积比例1：10为宜，液面高度维持在2-5mm的范围。
3 原代培养不成功最大的两个原因： ①在对组织分散并分离细胞的过程中严重损伤了细胞。
②给细胞提供的体外生长环境，尤其是生长基质与培养液条件不合适。
克 隆 一、基本概念
1名词：意指由同一个祖细胞分裂增生而来的一个子细胞群，体外培养技术中常用的细胞克隆即为此意。
另外，克隆一词也可指核酸分子片段如某一基因或DNA片段的扩增产物（同种分子群）。
2 动词：主要指从同一个祖细胞经分裂增殖而产生一个子细胞群的过程，体外培养技术中的细胞克隆就是此意。 另外，在分子生物学中克隆一词主要指为了获得相同核酸分子产物或分离某一核酸分子片段，以同一个核酸分子片段为模板，经扩增而产生碱基序列完全相同的分子产物之过程，分子克隆即为此。
3 克隆培养法：也可以称作单细胞分离培养法，就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的培养法。克隆培养不同于前面介绍的原代细胞培养或者常规传代培养，它强调培养产物的单一性而排除异质性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完全相同的纯细胞系（纯系），即细胞株。
二、克隆培养法的基本原理和过程 克隆培养法最基本的要求是拟用于培养并分裂增殖的祖细胞必须是一个细胞，如此，才能获得具有同一祖先的子细胞群。
进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞活力强，增殖能力强，对体外生长环境适应性强的细胞，如肿瘤细胞和转化细胞系，干细胞以及微生物细胞等。这些细胞种类即便是单个细胞被置于体外培养环境，也可以逐渐适应培养环境并进行分裂增殖，从而形成一群子细胞。
在进行克隆培养时，首先要制备细胞悬液，通过连续稀释获得可用于培养的单个细胞，然后将单细胞悬液接种到培养器
皿中适当的生长基质表面，让细胞单独生长繁殖，经过一定时间的培养之后，单个祖细胞便会形成一小群克隆细胞。接种单个细胞后能够形成克隆的概率被称为克隆形成率或克隆率。 单个细胞在体外增殖6代以上其后代所组成的细胞群体，称为克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
克隆形成率用来表示细胞独立生存的能力。
思考题 原代培养的定义及含义 自行设计一种细胞原代培养的过程 各种材料的取材
第五章 体外培养细胞的生长生物学
本章重点：了解体外培养细胞分型。 通过学习原代培养细胞的观察，了解一代细胞增殖过程和生物学特性。
体外培养的有机体结构成分（细胞），其生长生物学特征内有两重性。可以简单的归纳为两句话“万变不离其宗”，“入乡随俗”。
一、体外细胞培养物的生长类型
体外培养的动物细胞分为两种类型，一类是非贴壁依赖性细胞（悬浮型），另一类是贴壁依赖性细胞（黏附型）。
悬浮型细胞是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
黏附型细胞是必须附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
黏附是大多数动物细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式，粘附有两方面的含义：其一是细胞与细胞之间的相互接触，其二是细胞与细胞外基质结合。体内外生长环境不同，故细胞在体外的黏附方式也存在差异。
体内----立体特征；体外----“返祖”现象。 按照培养细胞的主要形态，可将其分为四型
（一）成纤维细胞型 主要形态特征：2-3个突起，胞体形态梭形，长条形，多角形或不规则型。核中央附近呈椭圆，核仁清楚。细胞之间排列松散，有较大的细胞间隙。植块培养细胞呈放射状或漩涡状走行形式。起源于中胚层的细胞体外培养一般表现这种形式。例：成纤维细胞，结缔组织细胞，肌肉细胞，骨与软骨细胞，以及胚胎间充质细胞等。
(二)、上皮细胞型泛指那些外形上类似上皮细胞，大体为扁平样的多种细胞。
主要形态特征：扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核。细胞之间相互衔接，当紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为拥挤而呈现“铺路石样”局部可构成单层的上皮样“膜片组织”。
上皮型细胞并不完全等于动物体内上皮组织的细胞。起源于外胚层和内胚层的细胞，体内培养时都可能呈现上皮型。
（三）游走型细胞 具有类似巨噬细胞样的特征，起源于网状内皮系统的细胞皆属本型。
主要形态特征：细胞相互分散，一般不形成群落，细胞内易出现色暗的吞噬性颗
粒，常具有胞质突起（伪足）。因在器皿壁上生长位置不固定常处于变形或游走状态，因此外形不规则且不断变化。有时类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。
表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬系统的细胞，如颗粒性白细胞，淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，肝枯否氏细胞以及某些肿瘤细胞等。植块培养时，此类细胞最先迁移出来。
（四）多形型细胞 神经细胞，神经胶质细胞。形态不规则，但不像成纤维型细胞那样，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分为胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。
悬浮型细胞主要形态学特点是胞体始终为球形，能以悬浮型生长的细胞，密度都可以较大，故培养的效率高。许多大规模培养方式即以悬浮状态进行。
这种方式培养细胞时，转换培养液，补加培养液以及收获细胞都比较容易，不足之处是不方便观察。
二、培养细胞一代生长过程 每代贴附生长细胞的生长过程
1 游离期 2 贴壁期 3 潜伏期 4 对数生长期 5 停止期（平顶期） 6 衰退期
1 游离期 细胞接种到培养液中后，细胞呈游离或悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时
2 贴壁期 黏附于固相表面是贴壁依赖性细胞生命活动的基本要求。这是细胞培养开始以后能否成功的第一步。一般认为，细胞与某种固相表面亲和性的大小，主要与细胞表面及固相表面所带的电荷性质和量有关。
细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。
不同细胞的粘附能力不同如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面，如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面
影响因素： 各种细胞不同 (附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞——上皮细胞——血细胞(最弱)。
生物因素 血清、培养液中的促附着因子
机械，物理等其他因素因素 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着
措施1.包被 对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质，如通过其所带电荷先吸附，培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分，细胞
本身也可能产生一些粘附分子。
贴壁后开始铺展，由圆形细胞变成放射延展细胞，进而过渡为极性细胞。常见的成纤维细胞型和上皮细胞型。
铺展（伸展） (spread) 进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为，铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞。极性细胞就是各种有机体细胞在体外的特征性细胞形态。
铺展状况是调节细胞形状的主要方面，铺展得越好，细胞越扁意味着细胞与生长基质表面接触面越大。
铺展状况与细胞的生长有密切关系只有当细胞铺展到合适的程度，DNA合成才开始进行。
通过比较贴壁依赖性细胞不同铺展程度与DNA合成率之间的关系发现细胞越扁(厚度越小)DNA合成率越高 。
3 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。
初代培养细胞比传代培养细胞潜伏期要长。另外，与细胞种类、接种的细胞密度、培养条件等因素均有关。无限细胞系比有限细胞系的潜伏期要短。
4 对数生长期（指数生长期）：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
这个时期可用群体倍增时间，细胞分裂指数（MI）来判断。 MI指的是培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比。细胞的增殖活性与细胞的种类、供体年龄以及培养条件等多种因素密切相关。一般细胞的MI为0.1-0.5%，原代比传代培养物的MI低。无限细胞系和肿瘤细胞的MI较高，可达3-5%。 正常：持续3-5天
接触性抑制：正常有机体细胞（非转化细胞），当细胞相互抑制的接触连接成片时，细胞便不再运动，表现出由于接触而相互抑制的特征，此即为接触抑制。
密度依赖性细胞生长抑制：细胞在发生接触抑制后，虽然运动受到抑制，但只要营养成分充足，仍然可进行短期的分裂增殖。只有当密度增大到一定程度后相互拥挤或挤压而致铺展程度降低，细胞变厚使得DNA合成受到限制时，细胞便不再分裂增殖。这种因为密度增大而致的分裂抑制现象称为密度依赖性细胞生长抑制。 血清可降低密度抑制
5 停止期（平顶期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。
机制：接触抑制、密度依赖性细胞生长抑制。 方法：及时传代
对于每一代培养细胞都可以再接种以后的不同培养时间计数培养物的细胞数量（实际常以细胞密度代替），然后，绘制出时间-密度曲线，即为培养物的生长曲线。不同种类的细胞生长曲线各有其特点，生长曲线可反映细胞的生物学特征。
6衰退期 对于传代培养，传到一定代数时，细胞的生命活动
明显减弱。生长缓慢，但很少分裂增殖甚或不再分裂，逐渐死亡。
三、细胞周期 细胞周期：细胞每一次增殖所经历的全过程称细胞的增殖周期。
分为四个连续时相：G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）M期（有丝分裂期）。
G1 — S — G2 — M为一个细胞周期。 G1、S、G2三期为细胞间期，此期为细胞生长过程，主要是遗传物质DNA的复制，而M期完成的是遗传物质（染色体）的分配。
细胞周期时间（TC）：完成一次细胞周期所需要的时间称为TC。TC相差不多，略有差异。
四、培养细胞的生命期 体外培养细胞整个生命活动过程可分为三个阶段：
第一阶段：原代培养期 为二倍体核型， 1-4周。细胞发生转化可能性极小，可选择指数生长期进行疫苗制备，药物测试，移植等试验。
第二阶段：传代培养期 为有限细胞系，10代以内形态基本与原代细胞相似，也可用于试验。而10代以后较难传代，大部分细胞退化，死亡。再传代较为缓慢。
第三阶段：衰退期 细胞存活一段时间后逐渐死亡
以上是正常的细胞周期，如果说是在任何一段时间，由于不明因素的干扰下，细胞就可能发生转化，具有了不死性，例如肿瘤细胞，也就是细胞获得了持久性的增殖分裂能力，也就形成了无限细胞系。发生转化后，核型大多变为异倍体，而且可能具有恶性或致瘤性。主要发生在Ⅱ期，Ⅲ期少，Ⅰ期极少。 鼠是至今转化率最高的物种，其中尤以小鼠最高。 人只有淋巴细胞可获得淋巴样细胞系，其它培养成系株的可能性比较小。
第六章 细胞传代培养
体外培养中所谓的传代概念并不等于细胞生物学中的亲代细胞与子代细胞这种代的概念。传代培养的实验质就是分割后再一次培养。在体外培养领域，认为只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个培养器皿之内继续培养就算培养就算传代，即便是按一传一的比例进行传代。
初代培养的首次传代是很重要的，是建立细胞系关键的时期。
传代作用：1.传代可以使细胞继续扩大培养。2.其它方面的用途：传代培养有时候起到纯化细胞的作用。
标准 1.观察培养物是否已基本长满培养瓶皿底壁。一般来说，原代培养物未达到生长基质的80%表面积，不要急于传代，对于首次传代扔培养物更是如此。
2.悬浮培养物不容易发生接触抑制现象，一般是代谢废物积聚到一寂程度后就进行传代。 如，PH变化较大
一、传代的过程
传代培养的核心工作有两方面：一是分割培养物，二是再次接种。具体操作步骤因原代培养的类型不同而有异。
1.贴壁依赖性细胞的传代过程 ⑴吸去或倾出旧培养
液。
⑵用PBS或者无Ca2+Mg2+平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1-2次尽量洗去残余血清，弃平衡盐溶液。
⑶解离细胞。多种方法①胰蛋白酶②振荡法③1mmol/LEDTA+0.25%胰解离下来。④对于能分⑷终止消化。加入胰蛋白酶抑制剂或者有血清培养液。
⑸培养液或蛋白酶抑制剂吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。吹打时必须有序进行，一边到另一边，均匀全面，不能用力过猛，不要产生气泡。肿瘤细胞 ⑹除去上清含酶溶液，离心1000r/min，5min
⑺重置悬液，细胞计数，调整细胞密度。 ⑻接种。 ⑼送入培养箱中继续培养。
泌胶原蛋白的培养物，需联合使用胰蛋白酶溶液和胶原酶溶液。
2.悬浮培养物 悬浮培养的细胞由于不贴壁生长,传代时无需使用消化液处理,直接将培养物吸取一部分或者将培养物离心后再分成几部分并接种培养即可。 ⑴将培养物转移到离心管内，1000r/min离心，5min。
⑵吸出上清液，给细胞沉淀加入培养液重置悬液。 ⑶分别取部分细胞悬液，接种在数个培养器皿内。
⑷补加培养液，入箱培养
二、传代培养的注意事项 1.传代的时机与再培养的细胞密度 2.传代数或代数与培养物的生长
3.传代时消化用胰酶消化注意事项： ①消化程度的掌握，出现细胞脱落或面上肿胀隆起，说明消化过头（加入胰酶抑制剂或5mlHanks液终止），显微镜下呈蛛网网状时就立即终止消化。
②大量传代时，最好要先做预试验，找准酶液的最佳消化浓度和作用时间，然后在分批进行消化。
三、培养细胞活力的测定 细胞活力的测定除了我们前面讲到过的方法（克隆形成实验，MTT比色法）之外，还可用染料排斥实验。对于某些活细胞排斥不能染色，而死细胞可通过变性的细胞膜与解体DNA结合着色。例如，台盼蓝，苯胺黑。以此来测定细胞的活力。 在台盼蓝下细胞染成蓝色，在苯胺黑下染成黑色，另外，结晶紫可使活细胞染色（类似于MTT法中的紫色结晶物）
四 培养细胞染色1.Giemsa染色 漂洗（Hanks液）-----干燥（不完全）-----固定（甲醇冰醋酸）----干燥（完全）-----Giemsa染色（15min）------冲洗（3min）-----干燥------封片(中性树胶)------观察（M）具体操作略。
2.HE染色 （1）染液配制： ①苏木精染液0.5g苏木精+5.0g铵矾或钾矾+0.1g碘酸钠，加温溶于70ml蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸，混匀，过滤后即成母液，可长时间保存。蒸馏水以1：20稀释即成为工作液，可用很长时间，每次染色前要过滤。
②伊红染液 0.5g伊红（醇溶性、水溶性）溶于100ml70%乙酸或蒸馏水，即成工作液。
（2）染色程序 ①10%甲醛固定30min，或以丙酮固定15min。 ②蒸馏
水洗1次后，入苏木精5～10min，染细胞核。 ③入0.5%盐酸-70%乙醇溶液脱色30s～1min，此时核呈紫红色。④入碱性溶液碱化使核变为蓝色。自来水长时间浸泡1%NaHCO3溶液。显微镜监视，掌握碱化时间。⑤蒸馏水洗1min，去除残留碱性溶液，否则影响伊红着色。 ⑥入伊红染液30s～1min。⑦用梯度乙醇溶液脱水：70%，90%，95%，乙醇各一次，每次30s～1min，100%乙醇2次各2min，如伊红为乙醇溶液，略去70%乙醇。 ⑧用二甲苯透明2次，各5min。 ⑨树胶封固。
（3）染色结果 细胞核呈蓝紫色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含有较多核糖体（例如淋巴细胞）则亦呈蓝色。
3.载玻片处理方法
对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先配制成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程不从载玻片脱落，必须使其牢固附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质，主要有多聚赖氨酸，铬矾明胶等。涂布方法： ①将载玻片用玻璃专用洗涤剂浸泡5min，间或振荡。 ②自来水冲洗5min。 ③1%HCl-70%乙醇溶液浸泡5min。 ④烤箱干燥（至此可用于普通染色）。 ⑤多聚L-赖氨酸（1：10溶于去离子水）浸泡5min，振荡。 ⑥入60℃烤箱1h，或室温干燥过夜（用于细胞化学，免疫细胞化学及原位杂交细胞化学）。
第七章 培养细胞常规检查和生物学检测
本章重点 了解并掌握体外培养细胞常规检查的基本内容和方法。 了解体外培养细胞常用的生物学检测方法。
一、常规检查 培养液PH值（颜色变化），清亮度（是否污染）和细胞生长状态等。
1.PH值正常值：7.2～7.4 “酚红”，呈橙红色 PH下降，酸化 变黄 PH升高，碱化，变紫红色
上述两种情况对细胞都将产生不利影响，严重时细胞脱落死亡。一般通5%CO2来维持，或是通过换液（2次/周），换法略。
2.微生物污染及排除 常见的微生物污染有细菌、霉菌、支原体、原生动物污染等。①细菌污染 眼观：培养液混浊，显微镜下可见大量细菌，常见细菌为：大肠杆菌，葡萄球菌，沙门氏杆菌等。可用琼脂培养或肉汤培养检测。排除：抗菌素联合用药，不可常用。 ②霉菌污染 眼观：易见，白色或浅黄色小点为菌落。排除：较难排除，全实验室用甲醛熏蒸。 ③支原体污染 眼观：培养液不混浊，对细胞影响不大。排除：a传代和换液可排除，b抗生素处理，如四环素、卡那霉素、泰乐菌素和麦诺霉素等，c特异性血清，d高热处理，e巨噬细胞和抗菌素联合处理。
3.细胞交叉污染及排除 主要是操作过程中导致，细菌、其他细胞、其他微生物交叉污染。
排除：①实验器材，不混用
。②培养液公用时，细胞吸管和细胞用液管要分开。
4.化学物质污染及排除 可能涉及过的各种化学物质。化学物质污染是细胞培养失败的重要原因。
二、培养细胞生物学检查和鉴定 无论是在进行体外培养的过程中还是的在培养工作结束后经常对培养物进行观察检测,以了解培养物的生长状况,研究培养物的生命活动变化。
1 活细胞的观察检测方法 相差显微镜，专门用于对体外培养活细胞的观察，可以直接观察到活细胞的形态结构，分裂增殖的动态变化及细胞运动等各种生命现象。
原理：利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率有差异的原理。折射率大的物体比小的物体中光波前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位差或相差。
2 活细胞的染料排除检测法 ⑴台眙蓝法 ⑵苯胺黑法 ⑶结晶紫法3 细胞活力测定MTT法
4 普通染色观察 ⑴Gemsa染色法 ⑵HE染色法
5 细胞化学技术普通化学技术可特异性地显示细胞内的细胞器和化学成分，其技术成熟、效果稳定，费用较低。
（1） 酸性磷酸酶 酸性磷酸酶是溶酶体的特征性酶，所以做为研究溶酶体的指标。
原理：该酶在酸性条件下分解甘油磷酸钠，释放出的磷酸根与醋酸铅置换形成磷酸铅，后者硫化胺作用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，于M下清晰可见。
（2）G-6-磷酸酶 滑面内质网的标志酶。原理同上。 （3）琥珀酸脱氢酶 为线粒体的标志酶。
原理：该酶使底物琥珀酸钠脱氢，无色的硝基蓝四唑（四唑盐）获H被还原为蓝色的formazan。
6 免疫细胞化学技术（ICC）
原理：利用抗原与抗体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分。 多肽和蛋白质
例，过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP），标记链亲和素-生物素法（LSABC法），葡萄球菌蛋白A法（SAB法）。
7 原位杂交技术（ISH） 原理：应用带有标记物的书籍碱基顺序的核酸探针与细胞内待测的核酸（DNA或RNA）按碱基配对的原则进行特异性的原位结合。然后通过对标记物的检测而获知待测核酸的有无及相对量。
第八章 细胞冻存与复苏、运输
本章重点：了解并能掌握细胞冻存与复苏的方法。 冷冻与复苏的基本原则是：慢冻快融。
一、培养物的冷冻与复苏原理 冷冻保存：就是将体外培养物悬浮在加有或不加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。
复苏：就是以一定的复温速率将冷冻的培养物恢复到常温的过程。 冰晶损伤：因水结冰形成冰晶而致细胞损伤被称为细
胞内的冰晶损伤。 溶液损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。在溶液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受这两种损伤。例，DMSO、甘油。不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样，且还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。
1 冷冻速率 指降温的速度，直接关系到冷冻效果。 过快形成较大的冰晶 过慢造成细胞严重脱水
目前多采用“二步冻结法”即先对细胞慢速冷却至一定温度，如-20℃或-30℃，使细胞外冻结，胞内脱水，然后再快速降温。
2 冷冻保存温度最佳保存温度（液氮）-196℃，此时细胞生命活动几乎停止。 10年以上 -70℃ - -80℃冷冻细胞，短期内对细胞活性无明显影响。1个月 -40℃以内对细胞保存不佳 -10℃ - -20℃存活率为零
3 复温或融化速度 融化温度不当会降低冻存细胞存活率。一般来说复苏温度越快越好。常规做法：取出，在37℃水浴中1-2min内完成复苏。
二、冷冻保存的方法
按照冷冻保护液在冻存后是否形成冰晶来划分，冻存方法分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。
非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃ - -80℃，然后直接投入液氮进行保存，或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气液，按一定的降温速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮进行保存的方法。或多或少有冰晶形成 玻璃化冻存是指利用多种高浓度保护剂组合成的玻璃化冷冻保护液悬浮细胞，直接投入液氮进行保存的方法。无冰晶形成。
1非玻璃化冻存⑴将处于对数生长期的培养物消化，制单细胞悬液，计数。 ⑵1000r/min,5min,去上清。⑶加入冷冻液，轻轻吹散。 ⑷分装，1-1.5ml，标记名称、日期等。 ⑸分级冷冻，多种方法：第一种：4℃,40min——-20℃,30-60min——-30℃, 30min——-80℃,过夜——投入液氮。第二种：先挂在液氮罐口20min，再直接投入液氮中 保存。 第三种：放入电子计算机程控降温仪内，并据不同细胞以不同降温速度连续降温至-100 ℃以下，再投入液氮保存。（6）作好冷冻记录，冻存日期，细胞代号，冻存管数，冻存过程中降温的情况，冻存位置和经手人等。
注意事项 ⑴DMSO不高压灭菌且有毒,不用滤膜过滤。 ⑵-30℃在分级降温时可省。
⑶0- -60℃这一范围为“危险温区”时间不宜过长。 ⑷塑料管冻存。 ⑸容积不能超过1/2。
2 玻璃化冻存方法⑴将冷冻离心管先预冷⑵离心细胞悬液，弃上清，1000r/min.⑶滴加冷冻液至细胞为1×106-1.5×106个/ml，滴加速度要控制好，约0.5ml。⑷吹散细胞悬液。 ⑸分装，12ml冷冻小管装0.8ml悬液。⑹两端火焰灭菌。⑺投入液氮保存。600℃/min
3 短期保存 ⑴细胞悬液 4℃，定期换液，1周 ⑵单层细胞保存法 25℃-30℃，定期换液，1个月
三、复苏 1非玻璃化冻存细胞复苏方法 ⑴液氮取出投入37℃-38℃水浴中，1-2min复温。⑵加入5ml血清培养液，一般为原体积的4倍。 ⑶离心弃上清。 ⑷加培养液吹散，培养。
2 玻璃化冻存方法 ⑴取出冰浴5min。 ⑵剪断管两端，将5ml细胞悬液移至50ml离心管中。⑶冰浴中，加入预冷的血清HanksBSS液，速度0.5ml/min，65min内加完。⑷400r/min,5min离心，弃上清，加足培养液，吹散，培养。
四、运输 液氮罐，暖水瓶，保温饭盒等。
第九章 细胞系(株)的建立与鉴定
一、基本概念 细胞系 细胞株
二、建立细胞系（株）的档案 建立细胞系或细胞株应对如下几方面加以说明：
1.培养细胞的来源 对拟建立的细胞系（株）应交代细胞供体所属物种及供体的年龄、性别、取材的器官或组织。如是肿瘤组织、应说明临床诊断结果、组织来源和病例号等。
2.细胞生物学特征 对所培养细胞的生物学性状予以说明。
3.培养条件和方法 说明所使用的培养基血清，使用浓度、并说明细胞生存的适宜温度、CO2浓度、PH值等条件。有些细胞生长还需添加的一定附加成分。
三、细胞系的鉴定 拟建立的细胞系或细胞株、除说明培养细胞的来源外，还要对其进行一系列的鉴定。
1.检定细胞系的纯度 检定细胞系的纯度包括鉴定除主类细胞外还含有哪类细胞及其所占比例多少。
2.细胞系的稳定性 细胞连续培养过程中主要指标有无明显变异。使用稳定的细胞系能保证实验结果的准确性、重复性。
3.细胞学特征 观察细胞系的形态和表达特征的数据及其与来源细胞的差异。
4.微生物污染检查 有无病毒、细菌、真菌、支原体等污染。
5.染色体稳定性 包括检查染色体数、染色体分组、染色体分带以及有无标记染色体等内容。
6.有无细胞系（株）交叉污染 包括用同工酶谱和抗原抗体反应等鉴定细胞系（株）的细胞特异性。
四、细胞系（株）的保藏
美国典型培养物保藏中心（Amercian Type Culture Collection,ATCC）是现今最大的细胞库。
ATCC网址：https://www.doczj.com/doc/b912179141.html,/ ATCC接纳细胞必须检测的项目如下：
1.培养简历 2.培养液 3.冻存液 4.细胞活力 5.细胞形态类型 6.核型 7.无污染检验 8.物种检测
9.免疫检测 同时提供细胞系(株)建立者和检测者的姓名。
中国国家专利局委托武汉大学建立的中国典型培养物保藏中心（China Center Type Culture Collection,CCTCC）保藏了十几个国家的专利培养物1000多株，非专利培养物3000多株，其中包括各类微生物菌种、动、植物细胞系
、病毒、单细胞藻类和质粒等 CCTCC E-mail:yingtlu@https://www.doczj.com/doc/b912179141.html, hyyang@https://www.doczj.com/doc/b912179141.html,
中科院细胞库是中科院典型培养物保藏委员会成员库之一。 网址：https://www.doczj.com/doc/b912179141.html,/cellbank/
第十章 胚胎干细胞的培养
能在体外增殖又具有胚胎细胞全能性或多能性的，并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。
20世纪70年代，胚胎性瘤细胞（EC细胞）是畸胎瘤干细胞，具有恶性生长并显示类似于胚胎细胞发育的全能或多能的性质。
80年代初，从小鼠早期胚胎的内细胞团或桑椹胚分离建立了具有发育全能性的胚胎干细胞（ES细胞）。
近年,多能性胚胎生殖细胞系（EG细胞），被称为“干细胞之母”。
一、ES细胞和EG细胞培养和建系的基本技术 （一）饲养层细胞
不论ES细胞或EG细胞，原代或初代培养阶段一般都须依赖于能分泌它们在体外存活增殖所必需生长因子的饲养层细胞。保持活性但不分裂增殖 1 MEF细胞 小鼠胚胎成纤维细胞
2 STO细胞 来自于SIM小鼠胚胎的硫代鸟嘌呤和乌本苷有抗性的成纤维细胞系。
二、胚胎细胞的来源 采用超排途径 1 主要材料 动物：雌雄小鼠 激素：PMS、HCG
2 获取胚胎的过程 （1）雌鼠，5IU PMS，48h后 5IU HCG（2）雌雄合笼，自然交配，次晨查阴道栓为交配后0.5d（即0.5dpc）。 （3）3-4d，分别剖取子宫，冲出子宫内桑椹胚和早期胚泡进一步分离培养ES细胞。8.5-10.5dpc时的胚胎生殖嵴可建立EG细胞系。
（三）ES和EG细胞的培养过程 1 ES细胞培养
基本培养液为含15-20%FCS，0.1mmol/l，β-巯基乙醇和50IU/ml青霉素，50ug/ml链霉素的MEM培养液。
接种桑椹胚和胚泡于预先铺有作为饲养层无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35mm培养皿中，培养2-3d然后按下列方法分离ICM细胞，进一步培养。
方法一，免疫手术法： 1）取出10只左右上述体外培养的胚泡，放在小培养皿中，用酸性Tyrode液（PH2.5）处理1-2分钟，去除透明带。 2）胚泡移入Hanks液的小培养皿中洗涤一次。直接露于经培养液1:2000稀释的兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H-2b）。3）30分钟后，再移到用培养液1:6稀释的新鲜豚鼠血清中,处理30min左右胚泡的滋养层细胞呈泡状，发生免疫溶解，而ICM细胞不具有H-2b抗原，不发生细胞免疫溶解，故完整无损。
方法二、常规培养：桑椹胚或胚泡不需要透明带
1)在铺有饲养层的MEM基本培养液中培养3-4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来。
2）吸出ICM细胞团，0.25%(w/v)胰蛋白酶和0.2mmol/l混合消化液在37℃消化5分钟。
3)部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的培养板培养4天,可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团。
4)胰蛋白酶消化巢